Tài liệu Xây dựng quy trình sản xuất nấm linh chi bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM TIẾN DŨNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY DỊCH THỂ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Bích Thùy TS. Nguyễn Văn Giang NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Tiến Dũng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Bích Thùy và TS. Nguyễn Văn Giang – Bộ môn Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công Nghệ Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Lãnh đạo, cán bộ viên chức Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu và Phát triển Nấm, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Tiến Dũng ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục .......................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ............................................................................................................... viii Danh mục biểu đồ, sơ đồ ................................................................................................. ix Trích yếu luận văn ............................................................................................................ x Thesis abstract................................................................................................................. xii Phần 1. mở đầu................................................................................................................ 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu.......................................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu chung................................................................................................... 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................... 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................................... 3 1.3.1. Phạm vi về nội dung nghiên cứu ........................................................................ 3 1.3.2. Phạm vi về thời gian........................................................................................... 3 1.3.3. Địa điểm nghiên cứu: ......................................................................................... 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài......................................................................... 3 1.4.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Khái quát chung về nấm linh chi ..................................................................................... 4 2.1.1. Phân loại học và phân bố ................................................................................... 4 2.1.2. Giải phẫu hình thái quả thể nấm linh chi ........................................................... 5 2.1.3. Giá trị dược liệu của nấm linh chi ...................................................................... 7 2.1.4. Sinh trưởng và phát triển của nấm linh chi ganoderma lucidum ....................... 9 2.2. Công nghệ sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu bằng phương pháp nhân giống nấm dạng dịch thể ....................................................................................................................13 2.2.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống nấm dịch thể trên thế giới ...................... 13 iii 2.2.2. Nghiên cứu nhân giống nấm dạng dịch thể tại việt nam .................................. 17 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 19 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ...................................................................................19 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 19 3.1.2. Vật liệu có nguồn gốc tự nhiên ........................................................................ 19 3.1.3. Hóa chất và vật tư ............................................................................................ 19 3.1.4. Trang thiết bị sử dụng trong thí nghiệm........................................................... 19 3.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................................19 3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................20 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ......................................................................... 20 3.3.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường và các điều kiện thí nghiệm ...................... 25 3.3.3. Phương pháp theo dõi và đánh giá ................................................................... 26 3.3.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ........................................................... 29 Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận ................................................................... 30 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng dịch thể tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi ..........................................................................................................30 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ph môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi .................................................................. 30 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dịch chiết tự nhiên tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi ............................................................................... 34 4.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng carbon tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi ............................................................................... 35 4.1.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng nitrogen tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi ............................................................................... 37 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi tới sinh trưởng hệ sợi giống nấm linh chi trong môi trường dinh dưỡng dịch thể ............................................................40 4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ lắc................................................. 40 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ sục khí .......................................... 41 4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi .......................................... 44 4.3. Kết quả nghiên cứu sử dụng giống nấm linh chi dạng dịch thể..................................46 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi nuôi cấy dịch thể ................................................................................. 46 iv 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi nuôi cấy dịch thể ........................................................................................ 49 4.4. Kết quả nghiên cứu nuôi trồng nấm linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể ...50 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn giống và nguyên liệu nuôi trồng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm linh chi và năng suất nấm linh chi ........................... 50 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của lượng giống thương phẩm đến sự sinh trưởng của nấm linh chi trên nguyên liệu nuôi trồng....................................... 53 4.5. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất nấm linh chi bằng phương pháp nhân giống dạng dịch thể ....................................................................................................................54 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ..................................................................................... 59 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 59 5.2. Kiến nghị.......................................................................................................... 59 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 60 Phụ lục ......................................................................................................................... 63 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CNM Cao nấm men CT Công thức CTĐC Công thức đối chứng CV% Sai số thí nghiệm g Gram KLC Khuẩn lạc cầu LSD0.05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MTĐC Môi trường đối chứng PG Potato glucose QTCN Quy trình công nghệ SKS Sinh khối sợi T. Thời gian TB Trung bình TN Thí nghiệm V/V/M Lít không khí/lít môi trường/phút vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Phân loại học nấm Linh chi ........................................................................... 4 Bảng 2.2. Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu ............................................................. 8 Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi ............................................ 31 Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến sinh khối của hệ sợi nấm Linh chi ............................................................... 33 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của dịch chiết tự nhiên đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi ...................................................................................... 34 Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của glucose đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi ........................................................................................................ 36 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của cao nấm men đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi ................................................................................................ 37 Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của các chế độ lắc đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi .........40 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể (cho bình lên men dung tích 2lit) ................................................................. 42 Bảng 4.8. So sánh hiệu quả nuôi lắc và nuôi sục khí ................................................... 44 Bảng 4.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi ...................................................................................... 45 Bảng 4.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cây giống đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi .......................................................................................... 47 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nguyên liệu nuôi trồng nguồn giống đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi ................................................................... 52 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của nguyên liệu nuôi trồng đến sự hình thành quả thể nấm Linh chi ........................................................................................................ 53 Bảng 4.13. Ảnh hưởng của lượng giống cấy đến sự sinh trưởng của nấm Linh chi trên nguyên liệu nuôi trồng .......................................................................... 54 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi ................................................. 5 Hình 2.2. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi ................................ 10 Hình 4.1. Hệ sợi nấm Linh chi nuôi tĩnh sau 10 ngày nuôi cấy .............................. 32 Hình 4.2. Ảnh hưởng của cao nấm men tới sinh trưởng hệ sợi Linh chi ................ 38 Hình 4.3. Hệ sợi nấm Linh chi sau 10 ngày nuôi cấy trong bình sục khí ............... 41 Hình 4.4. Sinh trưởng của nấm Linh chi sử dụng nguồn giống khác nhau ............. 51 viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Biểu đồ 4.1. Kết quả ảnh hưởng của dịch chiết tự nhiên đến SKS hệ sợi nấm Linh chi .. 35 Biểu đồ 4.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng glucose trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi .................................................... 36 Biểu đồ 4.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi ......................................... 38 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của thành phần Pepton của môi trường dinh dưỡng dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi .................................................................. 39 Biểu đồ 4.5. Đường cong sinh trưởng nấm Linh chi ................................................... 46 Biểu đồ 4.6. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến SKS hệ sợi nấm Linh chi ... 48 Biểu đồ 4.7. Kết quả ảnh hưởng của tuổi giống đến SKS hệ sợi nấm Linh chi .......... 49 Sơ đồ 4.1. Quy trình công nghệ sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nhân giống dạng dịch thể ................................................................................. 55 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Tiến Dũng Tên luận văn: “Xây dựng quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể”. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu trong nuôi cấy giống nấm Linh chi dạng dịch thể. Xác định được các điều kiện nuôi trồng tối ưu trong nuôi trồng nấm Linh chi trên cơ chất tổng hợp sử dụng nguồn giống dạng dịch thể. Phương pháp nghiên cứu Tiến hành nuôi cấy giống nấm Linh chi trên môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể để nghiên cứu nhân tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm; sau đó, sử dụng giống nấm dịch thể nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp để nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng nấm Linh chi. Từ đó, xác định được các điều kiện tối ưu cho nuôi cấy giống nấm Linh chi dạng dich thể và nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể; trên cơ sở các kết quả đạt được, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nấm Linh chi sử dụng nguồn giống nấm nuôi cấy dạng dịch thể. Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng dịch thể tới sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh được nuôi cấy, tác giả thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường dịch thể vànghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy dịch thể. Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ nuôi khác nhau tới sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dịch thể, tác giả thực hiện thí nghiệm nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường dinh dưỡng dịch thể và nghiên cứu trong các điều kiện: nuôi tĩnh, nuôi trên máy lắc và nuôi sục khí. Trong nội dung nghiên cứu phương pháp sử dụng giống nấm dạng dịch thể, thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và độ tuổi giống được sử dụng để cấy chuyển tốt nhất, nghiên cứu tỷ lệ cấy chuyển giống tối ưu nhất khi cần nhân giống các cấp trung gian. Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn giống tới hiệu quả nuôi trồng nấm Linh chi, tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng x nguồn giống dịch thể với đối chứng là nguồn giống thể rắn truyền thống; nghiên cứu tỷ lệ sử dụng giống dịch thể hữu hiệu để cấy lên cơ chất tổng hợp nuôi trồng nấm. Kết quả chính và kết luận Kết quả nghiên cứu đã xác định được các điều kiện tối ưu để nhân giống nấm Linh chi dạng dịch thể và các điều kiện tối ưu để nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể. Đồng thời, tác giả đã chứng minh được hiệu quả và ưu điểm vượt trội của công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi trên cơ chất tổng hợp sử dụng nguồn giống dạng dịch thể so với công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống trên thể rắn đang phổ biến hiện nay. Trên các cơ sở đó, tác giả xây dựng được chi tiết các công đoạn sản xuất và đề xuất quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nhân giống dịch thể./. xi THESIS ABSTRACT Master candidate: Pham Tien Dung Thesis title: Establish the production process of Ganoderma lucidum by breeding method of the liquid form. Major: Biotechnology Code: 60 42 02 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Determination of optimum culture conditions in culture of Ganoderma lucidum. Identification of optimum culture conditions for growing Lingzhi mushrooms on synthetic substrates using humoral material sources. Materials and Methods Propagation of the Lingzhi mushroom variety on a nutrient medium to study factors affecting the growth and development of mycelium; After that, using the fungus cultured on synthetic substrates to study the effect of growing conditions of the mushrooms. From there, the optimum conditions for cultivating Lingzhi mushrooms and cultivating Lingzhi mushrooms using the source of the same species; On the basis of the results obtained, to build up the technological process of producing Lingzhi mushrooms using the source of cultured mushrooms. In the study on the effect of the nutrient medium environment on the growth of the mycotoxins cultured, the authors studied the effect of pH on the medium and studied the effects of nutrients of the culture medium. In the study of the effect of different culture regimes on the growth of the mycobacterium hyphae in culture media, the author conducted experiments on culture of hyphae in mushroom hybrids. and in the study of static culture, raising on the shaking machine and aeration. In the research on the method of using the mushroom species, we conducted a study on the effect of time and age on seedlings used for best transplantation. like intermediate levels. In the contents of the study on the effect of seed sources on the efficiency of growing Lingzhi mushrooms, the experiments to compare the effectiveness of growing Lingzhi mushrooms using the source of seedlings with the control is a traditional solid seed source; Study on the rate of use of effective bacillary seedlings for transplanting into synthetic mushroom culture. xii Main findings and conclusions The results of the study have identified the optimal conditions for propagation of the Ganoderma lucidum of the liquid form and the optimal conditions for the productions the Ganoderma lucidum. At the same time, the author has proved the effectiveness and advantages of the technology of growing Lingzhi mushrooms on the synthetic substrate using the source of aquatic species compared with the technology of growing Lingzhi mushrooms using the same source solids are popular nowadays. On that basis, the author elaborated the production steps and proposed the production process of Lingzhi mushrooms by breeding method of the liquid form./. xiii PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm Linh chi là loại nấm dược liệu có giá trị cao đối với sức khỏe con người; từ hơn 4000 năm trước ở Trung Quốc, nấm Linh chi đã được biết đến và sử dụng như một loại dược liệu quý hiếm có hiệu quả cao trong việc điều trị và làm thuyên giảm một số căn bệnh nan y, giải độc, bồi bổ sức khỏe tăng cường sinh lực,… Vì thế Linh chi được xem như một loại thần dược, chỉ dành riêng cho các bậc vua chúa. Hiện nay, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi ở trong nước và trên thế giới ngày càng gia tăng, thị hiếu của người tiêu dùng ngày càng cao, đòi hỏi thêm nhiều sản phẩm từ nấm phù hợp với nhu cầu sử dụng. Do đó, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong công nghệ dược liệu cũng như thực phẩm chức năng ngày càng tăng. Tuy nhiên, lượng cung của nấm Linh chi luôn thấp hơn so với nhu cầu đặc biệt là các sản phẩm đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng thương phẩm cùng với hàm lượng của một số dược chất quý giá trong nó. Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế liệu từ nông, lâm nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… rất dồi dào, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh đó điều kiện tự nhiên cũng rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm nói chung cũng như nấm Linh chi nói riêng. Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở nước ta đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến, thiết bị hiện đại để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu. Nhu cầu tiêu thụ ngày càng lớn đặt ra yêu cầu về công nghệ nhằm nâng cao sản lượng cũng như chất lượng trong sản xuất nuôi trồng nấm Linh chi. Các dược chất có giá trị được chiết xuất từ quả thể nấm dược liệu, trong đó có Linh chi, đã và đang là nguồn dược liệu quan trọng cung cấp cho ngành sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng. Việc nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất nấm nói chung và sản suất nấm Linh chi nói riêng nhằm rút ngắn chu kỳ nuôi trồng, giảm chi phí sản xuất, nâng cao hiệu quả và chất lượng nấm là yêu cầu tất yếu. Ở nước ta hiện nay, sản xuất nấm ăn - nấm dược liệu ngày càng phát triển mạnh, tuy nhiên các cơ sở nhân giống và nuôi trồng nấm ở nước ta đều đang áp 1 dụng công nghệ nuôi trồng nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng chủ yếu được thực hiện theo quy trình công nghệ nhân giống trên cơ chất rắn (như nhân giống trên các môi trường thạch, mùn cưa tổng hợp, thóc, que sắn, v.v..) Đây là phương pháp truyền thống, quá trình sản xuất đơn giản và được sử dụng phổ biến; tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế như hệ số nhân giống thấp, chất lượng giống không ổn định và không đồng nhất về tuổi giống trong cùng một chai giống, rất khó khăn khi cần sản xuất một lượng lớn giống phục vụ sản xuất; thời gian nhân nuôi một cấp giống kéo dài trung bình từ 15 đến 25 ngày, thời gian từ khi cấy giống vào nguyên liệu nuôi trồng đến khi thu hái nấm thương phẩm dài trong vòng 3-4 tháng, dẫn đến giá thành giống nấm và nấm thương phẩm cao; hơn nữa, các công đoạn của quy trình sản xuất truyền thống chỉ thích hợp cho các cơ sở nuôi trồng thủ công với quy mô manh mún nhỏ lẻ, chỉ có thể áp dụng cơ giới hóa một phần nào đó (nhưng chưa có hiệu quả cao) trong quá trình sản xuất. Trong khi đó, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm;nghiên cứu và sản xuất giống dịch thể trên thế giới đã đạt được một số thành tựu đáng kể. Ứng dụng sản xuất giống dịch thể có hiệu quả rõ rệt so với giống thể rắn như rút ngắn thời gian sinh trưởng chỉ còn 4 - 6 ngày một cấp giống, độ thuần cao, chất lượng tốt, tỷ lệ nhiễm giảm, thích hợp cho sản xuất giống nấm và nuôi trồng nấm theo quy mô công nghiệp. Việc nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể có ý nghĩa quan trọng và cấp thiết góp phần giải quyết các khó khăn và hạn chế của công nghệ sản xuất hiện nay; đáp ứng nhu cầu thực tiễn cũng như xu hướng sản xuất theo định hướng thị trường và trên quy mô công nghiệp. Nhận định được vai trò và tầm quan trọng đó, tác giả lựa chọn thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể” nghiên cứu nhằm góp phần giải quyết các vấn đề tồn tại nêu trên. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu chung Kết quả nghiên cứu xây dựng được quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nuôi cấy giống dạng dịch thể. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Xác định được một số điều kiện tối ưu của môi trường nuôi cấy giống nấm Linh chi chủng Ga-1 dạng dịch thể. 2 Đánh giá kết quả nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể với đối chứng nuôi trồng Linh chi sử dụng nguồn giống thể rắn được sản xuất theo phương pháp truyền thống; từ đó xây dựng được quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nuôi cấy giống dạng dịch thể. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Phạm vi về nội dung nghiên cứu Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy giống nấm Linh chi cấp trung gian dạng dịch thể để xây dựng quy trình nhân giống nấm dạng dịch thể phục vụ sản suất; Nghiên cứu nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịnh thể trên cơ chất nuôi trồng tổng hợp để sản xuất quả thể nấm. 1.3.2. Phạm vi về thời gian Thời gian thực hiện đề tài: từ 08/2016 đến 08/2017. 1.3.3. Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu và Phát triển Nấm,Bộ môn Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học về các chỉ tiêu sinh trưởng cơ bản của hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường dịch thể, cũng như nhu cầu về dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh tối ưu cho sinh trưởng, phát triển của Linh chi trong điều kiện nuôi cấy dịch thể. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nấm Linh chi, trong đó công nghệ nhân giống dạng dịch thể của giống nấm Linh chi Ga-1 cho phép cải thiện khả năng sinh trưởng của giống, rút ngắn thời gian nuôi cấy giống, tăng chất lượng giống nấm cung cấp cho nuôi trồng nấm. Công nghệ này có tính khả thi cao, có thể thay thế cho công nghệ truyền thống, rút ngắn chu kỳ nuôi trồng nấm, tăng năng suất nấm thương phẩm, giảm chi phí sản xuất và nâng cao hiệu quả kinh tế. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NẤM LINH CHI 2.1.1. Phân loại học và phân bố Nấm Linh chi có tên khoa học là: Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst. Tên tiếng Anh: Lingzhi, Reishi. Tên thông dụng là Linh chi (Việt Nam), Lingzhi (Trung Quốc), Reishi (Nhật Bản). Ngoài ra, nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác nhau, như: Bất lão thảo, Vạn niên thảo, Thần tiên thảo, Chi linh, Đoạn thảo,… Nấm Ganoderma rất phong phú và phân bố khá rộng ở vùng nhiệt đới ẩm và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là thân gỗ mục hay các nguyên liệu có cellulose; trong tự nhiên, Linh chi có thể được tìm thấy ở các rừng có nhiều loại cây lá rộng, nhất là rừng gỗ lim nên còn gọi là nấm lim. Bảng 2.1. Phân loại học nấm Linh chi Giới nấm Funggi Ngành nấm thật Eumycota Ngành phụ Baisidiomycota Lớp nấm đảm Hymenomycetes Lớp phụ Hynomycetidae Bộ nấm lỗ Aphyllophorales Họ Linh chi Ganodermataceae Họ phụ Ganodermoidae Chi Linh chi Ganoderma Loài Linh chi Ganoderma lucidum Nguồn: Trịnh Tam Kiệt (2013) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Các loài Linh chi được xếp vào một họ riêng là họ Ganodermataceae. Từ khi xác lập thành 4 một chi riêng là Ganoderma, đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận (Lê Xuân Thám,1996). Trong đó, chỉ riêng với Linh chi đỏ Ganodermalucidum, hiện nay có khoảng 45 thứ (variete) Linh chi được xác định; nghĩa là chỉ với Linh chi đỏ ta đã có 45 loại có màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, vàng cam đến cam, đỏ cam, đỏ, đỏ sậm, đỏ tía,... Do vậy Linh chi đỏ được gọi là Linh chi chuẩn để phân biệt với những loài khác cùng chi Ganoderma nhưng không phải là Linh chi thật sự. Khi nói đến “Linh chi” là đề cập đến Linh chi đỏ Ganoderma lucidum. Ngoài ra còn có Linh chi đen (Ganoderma subresinosum) và Linh chi tím là hai loại hoàn toàn khác Linh chi đỏ. Linh chi vàng gặp ở Việt Nam, chưa phát hiện thấy ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á khác. Trong số các loại Linh chi tìm thấy cho đến nay thì Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) được nghiên cứu y dược chi tiết nhất. Loài chuẩn Ganoderma lucidum có thành phần hoạt chất sinh học phong phú và hàm lượng dược liệu nhiều nhất. 2.1.2. Giải phẫu hình thái quả thể nấm Linh chi Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales). Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây. Ở Việt Nam nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard N.T (1890 đến 1928). Hình 2.1. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Nguồn: Lê Xuân Thám (1996) 5 Quả thể của nấm Linh chi (cây nấm) gồm hai phần: cuống nấm và mũ nấm (phiến nấm, tai nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên đôi khi đính tâm do sự liền tán; cuống có hình trụ đường kính từ 0,3-3,5 cm; cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống láng bóng, không có lông, phủ suốt lên đến mặt tán nấm; vỏ cuống có thể có màu đỏ, nâu đỏ, hay nâu đen,… Mũ nấm khi còn non có hình trứng, lớn dần có hình quạt, đôi khi dị dạng; trên mặt mũ thường nhẵn bóng như láng vecni, không có lông, có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím,... càng về già thì màu càng sẫm lại. Mũ nấm trưởng thành có thể có đường kính biến động lớn từ 2-15cm, thường dày 0,8-3,3 cm; có loài Linh chi đường kính lớn tới 100 cm; ở phần đỉnh cuống thường lồi lên hay hơi lõm xuống (Nguyễn Hữu Đống, 2002). Mặt dưới thể quả thuờng phẳng, có màu trắng kem hay hơi vàng nhạt, có nhiều lỗ nhỏ li ti; đây là lớp bào tầng sinh sản của nấm, chính những lỗ này là nơi hình thành và phóng thích bào tử khi quả thể trưởg thành. Mật độ lỗ khoảng 3 – 5 ống/mm2, miệng lỗ gần tròn. Khi bổ đôi quả thể ra thì thấy dây là những ống thẳng, chiều dày từ 0,3 – 1,5 cm. Còn phần thịt nấm ở trên thì có màu vàng nâu đến nâu đỏ. Phân cách giữa phần trên và phần duới (tầng sinh sản) là khá rõ ràng vì phần trên thì các lớp tia sợi hướng lên, còn phần duới thì là ống thẳng hướng xuống. Phần thịt nấm dày từ 0,4 – 2,2 cm, màu vàng kem – nâu nhợt – trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới. Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên. Trên lát cắt trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợi phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 – 0,5 mm). Nhờ lớp láng bóng không tan trong nước do đó mà nấm chịu được mưa, nắng. Ở lớp dưới hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử. Tầng sinh sản (bào tầng hay thụ tầng - hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,8 cm màu kem – nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3 - 35 ống/mm. Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng hình chùy, không màu dài 16 – 22 µm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores). Nấm đến tuổi trưởng thành lỗ sinh bào tử ở phía dưới phiến có màu nâu sẫm; khi bào tử đảm chín thì nó được phóng thích dọc theo ống và thoát ra ngoài 6