Tài liệu Xây dựng quy trình phát hiện pseudomonas aeruginosa trong một số mẫu chế phẩm thuốc bằng kỹ thuật pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THU CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MỘT SỐ MẪU CHẾ PHẨM THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THU CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MỘT SỐ MẪU CHẾ PHẨM THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ: 60720408 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS-TS Nguyễn Thị Lập HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã dạy dỗ và truyền đạt những tri thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và rèn luyện tại trƣờng cũng nhƣ quá trình tôi tiến hành làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng cùng với các thầy cô giáo và anh chị bộ môn Hóa sinh trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt công việc nghiên cứu khoa học của mình. Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS Nguyễn Thị Lập ngƣời đã trực tiếp tận tình hƣớng dẫn và góp ý để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và cơ quan công tác đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Hà nội, ngày 3 tháng 4 năm 2017 Học viên Trần Thị Thu Cúc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................... 3 1.1. PSEUDOMONAS AERUGINOSA ........................................................ 3 1.1.1.Đặc điểm hình thái và nuôi cấy ......................................................... 3 1.1.2.Đặc điểm sinh hóa ........................................................................... 4 1.1.3. Đặc điểm kháng nguyên ................................................................... 5 1.1.4. Hệ gen .............................................................................................. 6 1.1.5.Các yếu tố độc lực ............................................................................. 7 1.1.6. Khả năng gây bệnh ........................................................................... 9 1.1.7. Khả năng kháng thuốc kháng sinh .................................................. 10 1.2. PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOÀI VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ........................... 11 1.2.1. Theo phƣơng pháp truyền thống..................................................... 11 1.2.2 Theo phƣơng pháp hiện đại ............................................................ 12 1.2.2.1 Phƣơng pháp ELISA.................................................................. 13 1.2.2.2. Phƣơng pháp giải trình tự DNA ............................................... 13 1.2.2.3. Phƣơng pháp lai phân tử (Hybridization) ................................. 14 1.2.2.4. Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) ...................... 15 1.3. TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT ..................................... 19 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 23 2.1. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................................................................................................. 23 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu: .................................................................... 23 2.1.2.Nguyên vật liệu, trang thiết bị: ........................................................ 23 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 26 2.2.1. Các bƣớc tạo mẫu tự tạo dùng trong nghiên cứu............................ 26 2.2.2.Quy trình phát hiện P. aeruginosa theo phƣơng pháp truyền thống .................................................................................................................. .27 2.2.3. Tách chiết DNA của vi khuẩn và phƣơng pháp PCR ..................... 29 2.2.3.1. Tách chiết DNA của vi khuẩn: ................................................. 29 2.2.3.2. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm (A260) .......................................................... 30 2.2.3.3. Nhân bản đoạn gen 16S ribosomal RNA của các loài vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR ................................................................................. 30 2.2.3.4. Lựa chọn các yếu tố của phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa. ................................................................... 32 2.2.3.5. Nhân bản của các đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa bằng các cặp mồi đặc hiệu đã chọn. ............................................................... 35 2.2.3.6. Điện di ADN trên gel agarose. ................................................ 35 2.2.3.7. Đánh giá độ đặc hiệu: ............................................................... 36 2.2.3.8. Đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp: ........................................ 37 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 39 3.1. TÁCH CHIẾT DNA CỦA P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM THUỐC TỰ TẠO......................................................................................... 39 3.1.1. Tạo các mẫu tự tạo và kiểm tra sự có mặt của P. aeruginosa theo phƣơng pháp truyền thống ........................................................................ 39 3.1.2. Kết quả kiểm tra tách chiết DNA tổng số bằng điện di .................. 41 3.1.3. Kết quả kiểm tra tách chiết DNA của vi khuẩn tổng số bằng PCR .................................................................................................................. .42 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ........................................................ 43 3.2.1.Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa. ...................................................................... 43 3.2.2. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa ............................. 50 3.2.3. Xác định độ đặc hiệu của các quy trình đã thiết lập. ...................... 51 3.2.4. Xác định ngƣỡng phát hiện của các quy trình đã thiết lập ............. 55 3.3.ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PCR ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG MẪU CHẾ PHẨM TỰ TẠO ........................... 57 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 61 4.1. VỀ KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA CỦA P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM ................................................................................................. 61 4.2. VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ............ 61 4.3. VỀ KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PCR ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG MẪU CHẾ PHẨM TỰ TẠO....... 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 67 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PCR Polymerase chain reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa DNA Acid deoxyribonucleic RNA Acid ribonucleic dNTP Deoxynucleotide triphotphat ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng chuẩn Hoa kỳ) CFU bp Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) Base pair (cặp base) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Đặc điểm hình thái của P.aeruginosa trên các môi trƣờng lựa chọn.................................................................................................................28 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách…………31 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng của một phản ứng PCR thông thƣờng…… 32 Bảng 2.4: Dải nồng độ lựa chọn thành phần phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu……………………………………………………………………...33 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR khảo sát lựa chọn các thành phần phản ứng nhân bản gen đặc hiệu …………………………………….......... …….34 Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra P. aeruginosa trong 5 mẫu tự tạo theo phƣơng pháp truyền thống …………………………………………………………..40 Bảng 3.2. Chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa …………………………………………………………..44 Bảng 3.3. Bảng thành phần PCR phù hợp nhất cho phản ứng nhân bản các đoạn gen đặc hiệu …………………………………….…………………….49 Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi trên 26 loài chủng vi sinh vật chuẩn………………………………………………………………..52 Bảng 3.5. Kết quả đếm lại số lƣợng vi sinh vật đƣa vào mẫu ban đầu…..….55 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA ……………………….41 Hình 3.2: Nhân bản đoạn gen 16s rRNA của vi khuẩn bằng cặp mồi ID16R08F và IDL16R09R ………………………………………………42 Hình 3.3. Kết quả tối nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………….. 43 Hình 3.4: Kết quả lựa chọn nồng độ mồi cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………..45 Hình 3.5: Kết quả lựa chọn nồng độ Mg2+ cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P.aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………...46 Hình 3.6: Kết quả lựa chọn nồng độ dNTPs cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………...47 Hình 3.7. Kết quả lựa chọn nồng độ enzyme cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ………..48 Hình 3.8: Kết quả lựa chọn nồng độ đệm cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………..49 Hình 3.9. Kết quả nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của P. aeruginosa bằng các cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………………………………………………51 Hình 3.10.Kết quả PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi PAL-F/PAL-R ...54 Hình 3.11: Kết quả kiểm tra ngƣỡng phát hiện của quy trình ……………..…… ........................................................................................... 56 Hình 3.12 Kết quả điện di kết quả PCR kiểm tra hiệu quả tách chiết DNA từ các mẫu tự tạo ……………………………………………………………...57 Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của P. aeruginosa trong các mẫu tự tạo bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R …………….58 Hình 3.14. Kết quả PCR phát hiện P. aeruginosa trong một chế phẩm nghi ngờ nhiễm P. aeruginosa …………………………………………………..60 ĐẶT VẤN ĐỀ Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là vi khuẩn phổ biến gây bệnh cho ngƣời và động vật. Trong thời kì thị trƣờng thuốc đang rất phát triển và sôi động nhƣ hiện nay, việc giám sát chất lƣợng thuốc càng trở nên khó khăn và phức tạp, đòi hỏi ngành kiểm nghiệm nói riêng và cả ngành y tế nói chung càng phải có nhiều nghiên cứu chặt chẽ. Do vi khuẩn có khả năng dị hóa để lấy năng lƣợng từ các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ nên nếu có mặt trong thuốc vi khuẩn có thể sẽ gây ra sự hƣ hỏng công thức thuốc bằng cách phá hỏng hoạt chất cũng nhƣ các tá dƣợc. Hơn thế nữa, sự hiện diện của một số lƣợng lớn các vi sinh vật và các vi sinh vật gây bệnh sẽ là mối đe dọa sức khỏe nghiêm trọng cho ngƣời dùng thuốc. Vì vậy, việc giám sát chặt chẽ các vi sinh vật này không đƣợc có mặt trong thuốc là vấn đề tối cần thiết. Dƣợc điển của các nƣớc trên thế giới và Dƣợc điển Việt Nam IV qui định không đƣợc có mặt P.aeruginosa trong các chế phẩm dùng cho nƣớu răng, lợi, da, mũi, tai, miếng dán qua da, chế phẩm xông hít, dạng đặt âm đạo, chế phẩm dùng đƣờng uống có chứa nguyên liệu chƣa qua xử lí có nguồn gốc từ động vật và dƣợc liệu. Mặt khác, sử dụng các phƣơng pháp truyền thống thƣờng mất nhiều công sức, tốn thời gian, chậm và đôi khi không đặc hiệu nên không đáp ứng đƣợc các trƣờng hợp cần chẩn đoán nhanh, chính xác và điều trị kịp thời. PCR đã đƣợc nghiên cứu và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các phòng kiểm ngiệm trên thế giới nhằm phát hiện một cách nhanh chóng, chính xác các vi sinh vật chỉ điểm y tế. Tuy nhiên, tại Việt Nam việc triển khai ứng dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ PCR trong kiểm nghiệm phát hiện vi sinh vật gây bệnh nhƣ P.aeruginosa chƣa đƣợc nghiên cứu, triển khai và ứng dụng. 1 Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài ―Xây dựng quy trình phát hiện Pseudomonas aeruginosa trong một số mẫu chế phẩm thuốc bằng kỹ thuật PCR‖ với các mục tiêu cụ thể sau: + Tách chiết đƣợc DNA của P.aeruginosa trong các mẫu chế phẩm thuốc + Xây dựng đƣợc quy trình phát hiện P.aeruginosa bẳng phƣơng pháp PCR + Ứng dụng đƣợc quy trình đã xây dựng để phát hiện P.aeruginosa trong các mẫu chế phẩm thuốc. 2 Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1.1.1.Đặc điểm hình thái và nuôi cấy Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí có hình dạng thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, kích thƣớc khoảng 0,51μm × 1,5-5μm. Có một lông ở một đầu nên có khả năng di động, có các pili là nơi tiếp nhận nhiều loại phage và giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ, ít khi có vỏ và không sinh nha bào[2]. Mặc dù đƣợc phân loại là một sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa còn đƣợc xem nhƣ là sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trƣờng thiếu một phần hay toàn phần khí oxy[10]. P.aeruginosa có thể thể hiện ra các kiểu hình: chủng trơn nhẵn, mịn (smooth), chủng sần sùi, thô (rough), hay chủng nhầy (mucoid) tùy thuộc trong các điều kiện môi trƣờng sống. Các chủng mịn và nhầy có vai trò trong sự xâm lấn và sản xuất các yếu tố độc lực. P.aeruginosa dễ dàng nuôi cấy trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng (thạch thƣòng, thạch máu, canh thang), hiếu khí tuyệt đối. pH thích hợp từ 7,2 – 7,5 (dao động 4,5 – 9,0), nhiệt độ tối ƣu là 37°C, nhƣng chúng có thể mọc đƣợc trong khoảng dao động rộng (5 – 42°C), sự kết hợp giữa sản xuất pyocyanin và khả năng phát triển ở 42°C là đủ để phân biệt P.aeruginosa từ Pseudomonas spp khác. (Ví dụ, P.fluorescens, P.putida, P.stutzeri, P.putrefaciens). Thời gian thế hệ của P.aeruginosa là 0,58 giờ[2]. Trên môi trƣờng đặc, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: loại chủng to, mịn, bò trải dẹt, giữa lồi lên trông giống nhƣ quả trứng ốp (fried egg) và loại chủng thô, đôi khi gặp loại chủng lạc nhầy. Trong các bệnh phẩm lâm sàng thƣờng gặp loại thứ nhất và trong các mẫu lấy từ môi trƣờng, thƣờng gặp loại thứ hai. 3 Tính chất đặc trƣng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố và chất thơm. Có hai loại sắc tố chính: - Pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nƣớc và chloroform, khuyếch tán tốt ra môi trƣờng nuôi cấy, làm cho môi trƣờng và khuẩn lạc có màu xanh nên có thể nhận ra một cách dễ dàng bằng mắt thƣờng. - Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím có bƣớc sóng 400 nm. Pyoverdin không bền vững, dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không chuẩn. Khi nuôi cấy vi khuẩn ở môi trƣờng có nồng độ sắt thấp, nó đƣợc tổng hợp nhiều hơn. Cấu trúc hóa học của pyoverdin chƣa đƣợc biết đầy đủ [1]. Có khoảng 10% P.aeruginosa không sinh sắc tố[1]. Trong trƣờng hợp này chuẩn đoán vi khuẩn học gặp nhiều khó khăn. King, Ward và Raney đã tìm ra thạch Pseudomonas Agar P (môi trƣờng aka King A) để tạo điều kiện cho vi khuẩn tăng sinh pyocyanin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trƣờng aka King B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tăng sinh sắc tố pyoverdin[31]. Chất thơm do trực khuẩn mủ xanh sinh ra là kimetylamin. 1.1.2.Đặc điểm sinh hóa Các tính chất hóa sinh thƣờng đƣợc sử dụng trong lâm sàng gồm: urease(-), indol(-), H2S (-), citrate Simmon (+), catalase (+), agrinin dihydrolase và gelatinase (-), khử NO3- thành N2. Trên môi trƣờng Oxidase fermentation (OF) nhiều loại cacbonhydrat bị thoái hóa theo lối oxy hóa có sinh acid: glucose, mannitol, glycerol, ethanol, arabinose, fructose và galactose. P.aeruginosa không lên men đƣờng lactose 4 P.aeruginosa có đủ các cytochrome (b,c,a và oxidase) trong hệ thống vận chuyển điện tử. Trong thực hành thƣờng dùng ―oxidase test‖ để kiểm tra sự có mặt của cytochrome oxidase [1]. 1.1.3. Đặc điểm kháng nguyên - Kháng nguyên liên kết với tế bào: + Kháng nguyên lông H là các protein đặc hiệu nằm trong lông của vi khuẩn. Có 50 type kháng nguyên H. Kháng nguyên H không chịu nhiệt nên khó khăn trong việc điều chế, do đó việc định type huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chƣa đƣợc áp dụng rộng rãi. + Kháng nguyên thân O có bản chất là lipopolysaccharide(LPS) protein. LPS của P. aeruginosa gồm 3 phần: phần lõi (core), chuỗi bên đặc hiệu O (mang tính kháng nguyên đặc hiệu type huyết thanh) và lipid A quy định độc tính. Trong các chủng mịn của P. aeruginosa, 5-30% của các lõi LPS đƣợc thay thế bằng chuỗi bên O có cấu trúc, chiều dài và biến thể khác nhau gọi là type huyết thanh [48][59]. Với các chủng thô chứa ít, ngắn, hoặc không có chuỗi O bên và dễ bị tiêu diệt trong ống nghiệm bằng cách bổ sung huyết thanh [18][59]. Nói chung, chủng P. aeruginosa phân lập từ môi trƣờng và từ các bệnh nhiễm trùng bệnh viện là chủng mịn và kháng huyết thanh còn chủng phân lập từ phổi của bệnh nhân xơ nang tiến triển là chủng thô và nhạy cảm với huyết thanh [18]. Ngoài chủng thô, nhiều P. aeruginosa phân lập từ các bệnh nhân xơ nang hiển thị kiểu hình nhầy do sản xuất rất nhiều alginate exopolysaccharide [32]. Kháng nguyên O đƣợc nghiên cứu nhiều và đƣợc sử dụng kích thích miễn dịch bảo vệ chống P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế (International Antigenic Typing Scheme, IATS), việc định type kháng nguyên O (serotype) chia P. aeruginosa thành 17 nhóm kháng nguyên đƣợc ký hiệu từ O1 đến O17[29]. Đến năm 1990 ba kháng nguyên mới đã đƣợc Liu và Wang bổ sung thêm vào hệ thống phân loại này thành 20 type 5 kháng nguyên[36]. Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dƣ và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa. Đồng thời việc các phƣơng pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này. - Các kháng nguyên ngoại bào: P. aeruginosa sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào góp phần vào cơ chế bệnh sinh nhƣ: kiềm protease, elastase, exotoxin A, exoenzyme S và hemolysin. Một số enzym này cũng đồng thời còn là những kháng nguyên đƣợc nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch. Năm 2006 một nhóm nghiên cứu ngƣời Anh đã công bố nghiên cứu về hiệu quả và độ an toàn một loại vaccine đƣờng uống có tên Pseudotat 1 có thể giúp cơ thể kháng lại P.aeruginosa [5] 1.1.4. Hệ gen Vật chất di tuyền của P. aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tai trong nguyên sinh chất. Bộ gen của P.aeruginosa là tƣơng đối lớn (5,5-7,5 Mb) với khoảng 65% Guanine + Cytosine và mã hóa giữa 5.500 và 6.500 khung đọc mở cửa tùy thuộc vào chủng. Năm 2000, trình tự gen của chủng PAO1 đã đƣợc giải mã hoàn toàn. Với 6.264.403 cặp base 5.570 khung đọc mở (ORFs) dự đoán, kích thƣớc và độ phức tạp của bộ gen P.aeruginosa phản ánh một sự thích nghi tiến hóa cho phép nó phát triển mạnh trong môi trƣờng đa dạng và kháng lại một loạt các kháng sinh [9]. 6 Ngoài ra P.aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài nhân là các Plasmid. Các đoạn plasmid này chứa các gen TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra các betalactamase làm cho vi khuẩn kháng các thuốc nhóm này. Tìm hiểu cấu trúc bộ gen rất quan trọng trong việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinh, cơ chế kháng thuốc và các phƣơng pháp điều trị nhiễm khuẩn P.aeruginosa. 1.1.5.Các yếu tố độc lực P. aeruginosa là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội. Độc tố của P. aeruginosa chỉ có tác động gây chết khi chúng đƣợc tạo ra với số lƣợng lớn. Tuy nhiên, loài vi khuẩn này có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền và gây bệnh. - Nội độc tố (endotoxin): là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lƣợng nhỏ protein. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết. Nội độc tố của P. aeruginosa tác động tới bạch cầu, tiểu cầu, kích hoạt hệ nội tiết enzyme và cả hệ thần kinh giao cảm làm tăng tiết các chất nhƣ renin, catecholamin, serotonin, histamin. Bên cạnh đó nội độc tố còn hoạt hóa hệ kallikreinogen – kinin gây nên rối loạn vi tuần hoàn, rối loạn vận mạch, rối loạn đông máu, gây ức chế miễn dịch. Ngoài ra nội độc tố của vi khuẩn còn gắn lên thụ thể CD4 trên bề mặt monocyte và macrophage kích thích chúng sinh ra chất gây hoại tử tổ chức. [13] - Ngoại độc tố (exotoxin A): Exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. Exotoxin A có khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipid, gây tổn thƣơng nhiều cơ quan, nhƣng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thƣơng gan. 90% số chủng P. 7 aeruginosa sản xuất exotoxin A nhƣng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng. - Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết, các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ: + Protease: P. aeruginosa tiết ra 2 loại protease quan trọng là alkaline và elastase. Nhiều chủng tiết ra collagenase. Các protease này thƣờng có tác dụng hiệp đồng. Elastase (lasA elastase và lasB elastase) phân giải các cấu trúc protein của tế bào nhân chuẩn nhƣ collagen, elastin và hủy hoại cấu trúc protein của tế bào này. Nó phá vỡ hệ thống miễn dịch đặc hiệu của cơ thể (IgA, IgG, bổ thể làm cho nhiễm trùng lan tỏa với các biểu hiện lâm sàng nhƣ viêm màng keratin, hoại tử tổ chức trong bỏng và tạo các xơ nang. Ngoài ra elastase còn dung giải fibronectin giúp cho vi khuẩn dễ dàng bám vào màng nhầy phổi. Elastase phá vỡ biểu mô và cản trở chức năng của các lông mao bên trong đƣờng hô hấp. Elastase cũng hỗ trợ P. aeruginosa trong việc tránh thực bào tại các vị trí tổn thƣơng bằng cách ức chế hoá hƣớng bạch cầu [16][30]. Alkaline can thiệp vào sự hình thành và phân giải fibrin. Elastase và alkaline còn gây ra sự bất hoạt với hai yếu tố quan trọng của hệ miễn dịch là Inteferon gamma (IFN) và Tumor Necrosis Factor (TNF) [35] + Heamolysine có 2 loại: Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): không có tính enzyme, không có tính kháng nguyên và ít độc, có vai trò hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C. Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): Phospholipase C thƣờng tác động hiệp đồng với glycolipide và protease alkaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thƣơng. + Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân trung tính và các tế bào lympho. 8 + Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme. + Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít đƣợc biết đến. Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đƣờng ruột; độc tố này có thể là một trong những nguyên nhân gây viêm ruột non. Khi gây nhiễm qua da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch. 1.1.6. Khả năng gây bệnh P. aeruginosa hiếm khi gây bệnh ở ngƣời khỏe mạnh. Chúng thƣờng gây bệnh cơ hội ở các bệnh nhân có hệ miễn dịch suy giảm hoặc chấn thƣơng. Nhiễm khuẩn do P. aeruginosa thƣờng gặp nhiều ở các khoa Bỏng, khoa Hồi sức tích cực, khoa Tiết niệu, khoa chăm sóc bệnh nhân sau phẫu thuật. P. aeruginosa thƣờng gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thƣơng, vết mổ, vết bỏng. Có nhiễm khuẩn sinh trƣởng ngay trong các thuốc dùng để điều trị. Từ vết thƣơng, vết bỏng vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết. Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn này tỷ lệ tử vong thƣờng rất cao. Đầu tiên, P. aeruginosa bám vào bề mặt các mô sử dụng roi của nó, pili, và EXO-S; sau đó, chúng tạo ra sự tập chung lây nhiễm trầm trọng; và cuối cùng, làm tổn thƣơng mô do sử dụng các yếu tố độc lực của chúng [22].Từ đó P. aeruginosa giải phóng mạnh mẽ các ngoại độc tố và nội độc tố của chúng trong quá trình tiếp tục lây nhiễm sang vật chủ thậm chí ngay cả sau khi P. aeruginosa đã bị giết chết bởi thuốc kháng sinh. Các bệnh cấp tính do P. aeruginosa có xu hƣớng trở nên mãn tính và đe dọa tính mạng. Trong bệnh xơ nang P. aeruginosa sử dụng roi của mình để đi đến những vùng thiếu dƣỡng khí- môi trƣờng oxy cạn kiệt. Tại vị trí này, P. aeruginosa trải qua một quá trình chuyển đổi từ một hiếu khí một loại vi khuẩn kỵ khí và bắt đầu hình thành màng sinh học kỵ khí. Khi màng sinh học 9 đƣợc hình thành, P. aeruginosa trong cộng đồng này có thể cảm nhận mật độ của chúng thông qua hiện tƣợng thụ cảm đám đông (quorum sensing), chúng tiết ra các pheromone trọng lƣợng phân tử thấp cho phép chúng giao tiếp với nhau [20]. Điều này khiến cho chúng có khả năng chống lại sự bất lợi nhƣ kháng các kháng sinh ticarcillin, ceftazidime, tobramycin, và ciprofloxacin, bởi vì một khi các vi khuẩn nhận biết rằng lớp bên ngoài màng sinh học của chúng đang bị phá hủy, các lớp bên trong sẽ phát triển mạnh mẽ hơn để thiết lập lại cộng đồng [52]. P. aeruginosa cũng lây nhiễm động vật. Trên động vật thí nghiệm, ở chuột lang tiêm vào màng bụng khoảng 0,5 – 0,1ml canh khuẩn khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần hình thành những ổ mủ. 1.1.7. Khả năng kháng thuốc kháng sinh P. aeruginosa có khả năng kháng tự nhiên số lƣợng đáng kể các kháng sinh nhƣ ampcilin, amoxicillin, amoxicillin/clavulanic, các cehalosporin thế hệ 1,2, cefotaxime, ceftiaxone, nalidixic acid, trimethoprim. Hơn nữa, chúng dễ dàng có đƣợc khả năng kháng thuốc kháng sinh mới bằng cách thay đổi đột biến hoặc trao đổi vật liệu di truyền qua plasmid, transposon hay integron [38]. Một số cơ chế kháng thuốc đã đƣợc xác định của P. aeruginosa, bao gồm:[7] - Sản xuất các enzym phá hủy cấu trúc các kháng sinh phổ rộng: βlactamase các cephalosporinase hay các carbapenemase. - P. aeruginosa cũng có thể thay đổi các đích tác dụng của kháng sinh, ví dụ nhƣ methyl hóa 16S rRNA để ngăn chặn sự tấn công của aminoglycoside vào quá trình sao chép DNA, hoặc thay đổi topoisomerase ngăn cản tác động của quinolone. - Hình thành màng sinh học, tăng tiết alginat làm giảm tính thấm với thuốc - Hệ thống bơm đẩy thuốc ra ngoài (Efflux pumps): 10