Tài liệu Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp pcr đa mồi

LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS. Ngô Tất Trung – Khoa Sinh học phân tử và TS. Đinh Nho Thái – Bộ môn Di truyền học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Hữu Song, TS. Bs. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và lãnh đạo Khoa đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày tháng năm 2015 Học viên Đào Thanh Quyên MỤC LỤC CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................... Error! Bookmark not defined. 1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở ngƣời ...................................................... Error! Bookmark not defined. 1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới ........................................... Error! Bookmark not defined. 1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt Nam Error! Bookmark not defined. 1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở ngƣời.Error! Boo 1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli ................................ Error! Bookmark not defined. 1.2.2. Klebsiella pneumoniae .................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.3. Salmonella sp................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.4. Proteus mirabilis ............................................. Error! Bookmark not defined. 1.2.5. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ EnterobacteriaeceError! Bookmark not defined. 1.3.Phƣơng pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnhError! Bookmark not defined. 1.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩnError! Bookmark not defined. 1.3.2. Phƣơng pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩnError! Bookmark not defin 1.3.2.1.Kỹ thuật PCR ................................................. Error! Bookmark not defined. 1.3.2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi) ............ Error! Bookmark not defined. 1.3.3. Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN ngƣờiError! Bookmark not defined 1.3.3.1. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN ngƣời trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ..................................... Error! Bookmark not defined. 1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN ngƣời ”làm giàu” ADN vi khuẩn …………………………………………………………………………….E rror! Bookmark not defined. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................. Error! Bookmark not defined. 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................... Error! Bookmark not defined. 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................... Error! Bookmark not defined. 2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm .................................. Error! Bookmark not defined. 2.3.2. Các máy và thiết bị chính ................................ Error! Bookmark not defined. 2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu .............................................. Error! Bookmark not defined. 2.4.2. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồiError! Bookmark not defined 2.4.3. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứuError! Bookmark not def 2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm ......... Error! Bookmark not defined. 2.4.5. Phƣơng pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổError! Bookm 2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi ......................... Error! Bookmark not defined. 2.4.8. Giải trình tự gen.............................................. Error! Bookmark not defined. 2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồiError! Bookmark not defined. 2.4.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu bằng toán thống kêError! Bookmark not defined. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................ Error! Bookmark not defined. 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN......................................................... Error! Bookmark not defined. 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh..... Error! Bookmark not defined. 3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻError! Bookmark not defined. 3.1.3.Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh ........... Error! Bookmark not defined. 3.1.3.1. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae.................................................... Error! Bookmark not defined. 3.1.3.2. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn SalmonellaError! Bookma 3.1.3.3. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K. pneumoniae................................................................ Error! Bookmark not defined. 3.1.3.4. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilisError! Bookmark 3.1.3.5. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E. coliError! Bookmark not defi 3.1.4. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ EnterobacteriaceaeError! Book 3.1.5.Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnhError! Bookmark not d 3.1.6. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phƣơng pháp trên panel chuẩn dƣơng……………………………………………………………………………….Error! Boo 3.1.6.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dƣơngError! Bookmark not 3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƢỜI KẾT HỢP ‘’LÀM GIÀU’’ ADN VI KHUẨN ............................................ Error! Bookmark not defined. 3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lƣợng ADN cũng nhƣ khả năng loại bỏ ADN ngƣời bằng các dung môi khác nhau ......................... Error! Bookmark not defined. 3.2.2. Kết quả so sánh nồng độ ADN tách chiết bằng phƣơng pháp thông thƣờng so với phƣơng pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩnError! Bookmark not defined. 3.2.3. Kết quả realtime PCR định lƣợng nồng độ ADN so sánh các phƣơng pháp tách chiết.………………………………………………………………………………..Error! 3.2.3.1. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phƣơng pháp tách ADN không qua xử lý. ....................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.3.2. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phƣơng pháp sử dụng kit thƣơng mại MolYsis .................................. Error! Bookmark not defined. 3.2.3.3.Kiểm chứng hàm lƣợng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung môi phá bạch cầu ....................................................... Error! Bookmark not defined. 3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT .................. Error! Bookmark not defined. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................... Error! Bookmark not defined. KIẾN NGHỊ .................................................................. Error! Bookmark not defined. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp của phản ứng PCR . Error! Bookmark not defined. Hình 2. Mô hình thí nghiệm thực hiện quá trình tối ƣu hóa PCR đa mồiError! Bookmark not d Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phƣơng pháp loại bỏ ADN ngƣờiError! Bookmark not d Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnhError! Book Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh .................................................................... Error! Bookmark not defined. Hình.6.Kết quả PCR các mồi đơn trên ADN mẫu đƣợc tách chiết từ mẫu chuẩn dƣơng trong điều kiện PCR chuẩn ............................ Error! Bookmark not defined. Hình.7. Hình ảnh phổ sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trƣng cho họ Enterobacteriaceae ................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 8. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn Salmonella spError! Bookmark Hình 9. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn K. pneumoniaeError! Bookmar Hình 10. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn Proteus mirabilisError! Bookm Hình 11. Kết quả giải trình tự đoạn gen S-uidA đặc trƣng cho vi khuẩn E. coliError! Bookmar Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn ......................................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 13. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae ................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi trên ADN tác nhân gây bệnh khác ........................................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 15. Kết quả xác định ngƣỡng phát hiện của PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn dƣơng…………………………………………………………………………….46 Hình16. Kết quả realtime PCR mồi betaglobin định lƣợng nồng độ ADNError! Bookmark not Hình 17: Hiệu quả loại ADN ngƣời (thông qua tồn dƣ beta globin) giữa các Kit (SHPT108@dehuman ADN), Kit MolYsis .............. Error! Bookmark not defined. Hình.18. Kết quả PCR mồi đơn E. coli-SuidA trên ADN đƣợc xử lý bằng dung môi SHPT108@dehumanDNA ........................................ Error! Bookmark not defined. Hình. 19. Sơ đồ so sánh kết quả PCR đa mồi và cấy máuError! Bookmark not defined. DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á)................................................................................................................................4 Bảng 2. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined. Bảng 3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined. Bảng.4. Trình tự mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh ........................................................................... Error! Bookmark not defined. Bảng 5. Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phƣơng phápError! Bookmark not defined. Bảng 6. Kết quả đo OD các mẫu ADN sử dụng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác Error! Bookmark not defined. Bảng8: Hàm lƣợng và chất lƣợng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi khuẩn E.coli ......................................................................... Error! Bookmark not defined. Bảng 9. Kết quả đo OD các ADN tách chiết từ mẫu máu có vi khuẩn sử dụng các phƣơng pháp tách chiết ............................................. Error! Bookmark not defined. Bảng 10. So sánh kết quả nuôi cấy và PCR đa mồi trên mẫu nhiễm khuẩn huyết………………………………………………………………………………….. 53 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic aldA Aldehyde dehydrogenase A Bộ mồi EPKS Gồm các gen đích phát hiện vi khuẩn E. coli, Proteus mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella. sp bp base pair dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DTCS Dye Terminator Cycle Sequencing EBV Epstain BarrEpptabar virus HBV Hepatis B virus HSV Herpes simplex Virus kDa Kilodalton M100 Ladder marker 100 M50 Ladder Marker 50 bp MCLB1 Manmanlian cellular lysis Buffer 1 NKH Nhiễm khuẩn huyết OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Pol polymerase SD Standard Deviation Se Độ nhạy Sp Độ đặc hiệu X Giá trị trung bình TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Thị Ngọc Anh (2008), "Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp tại Bệnh viện Nhi Đồng 2 năm 2007", Tạp chí Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 12(2). 2. Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn ( 2002), Bệnh học truyền nhiễm. Nhà xuất bản y học Hà Nội, p. 11- 31. 3. Phạm Văn Ca (1995) Tìm hiểu căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tại BV Bạch Mai từ 1989- 1993: Luận án tiến sĩ. 4. Nguyễn Thanh Liêm, cs (2005), "Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng, huyết học, vi trùng học ở trẻ sơ sinh sanh non bị nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Nhi đồng I từ tháng 1-99 đến 1-04.", Y học TP Hồ Chí Minh,, 9(1). 5. Lê Văn Phùng (2009), Vi khuẩn Y học. NXB Giáo dục Việt Nam, p. 198-247. 6. Bùi Thanh Thuyết, Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Phan Quốc Hoàn (2014), "Nghiên cứu các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết tại Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108 (2010-2013)", Tạp chí Y dược lâm sàng 108, Tập 9(Số đặc biệt), pp. 190197. 7. Phạm Hùng Vân, T P Bình, K T L Anh et al. (2008), "Nghiên cứu đa trung tâm khảo sát tình hình đề kháng các kháng sinh của các trực khuẩn gram âm dễ mọc gây nhiễm khuẩn bệnh viện phân lập từ 1/ 2007 – 5/ 2008", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh. Tiếng Anh 8. Bekal S., Brousseau R., Masson L. et al. (2003), "Rapid identification of Escherichia coli pathotypes by virulence gene detection with DNA microarrays", J Clin Microbiol, 41(5), pp. 2113-25. 9. Bloos F., Sachse S., Kortgen A. et al. (2012), "Evaluation of a polymerase chain reaction assay for pathogen detection in septic patients under routine condition: an observational study", PLoS One, 7(9), pp. e46003. 10. Chamberlain J. S., Gibbs R. A., Ranier J. E. et al. (1988), "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification", Nucleic Acids Res, 16(23), pp. 11141-56. 11. Chen, J.Zhang, L.Paoli et al. (2010), "A real-time PCR method for the detection of Salmonella enterica from food using a target sequence identified by comparative genomic analysis", Int J Food Microbiol, 137(2-3), pp. 168-74. 12. Deen J., von Seidlein L., Andersen F. et al. (2012), "Community-acquired bacterial bloodstream infections in developing countries in south and southeast Asia: a systematic review", Lancet Infect Dis, 12(6), pp. 480-7. 13. Feng P., Lum R., Chang G. W. (1991), "Identification of uidA gene sequences in beta-D-glucuronidase-negative Escherichia coli", Appl Environ Microbiol, 57(1), pp. 320-3. 14. Gebert S., Siegel D., Wellinghausen N. (2008), "Rapid detection of pathogens in blood culture bottles by real-time PCR in conjunction with the pre-analytic tool MolYsis", J Infect, 57(4), pp. 307-16. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. Gosiewski T1, Jurkiewicz-Badacz D, Sroka A et al. (2014 ), "A novel, nested, multiplex, real-time PCR for detection of bacteria and fungi in blood", BMC Microbiol., 14(1), pp. 144. Hansen W. L., Bruggeman C. A., Wolffs P. F. (2009), "Evaluation of new preanalysis sample treatment tools and DNA isolation protocols to improve bacterial pathogen detection in whole blood", J Clin Microbiol, 47(8), pp. 262931. Hartman L. J., Selby E. B., Whitehouse C. A. et al. (2009), "Rapid real-time PCR assays for detection of Klebsiella pneumoniae with the rmpA or magA genes associated with the hypermucoviscosity phenotype: screening of nonhuman primates", J Mol Diagn, 11(5), pp. 464-71. Heimer S. R., and H. L. T. Mobley., (2001), "Interaction of Proteus mirabilis urease apoenzyme and accessory proteins identified with yeast two-hybrid technology.", J. Bacteriol, 183, pp. 1423–1433. Hein I., Flekna G., Krassnig M. et al. (2006), "Real-time PCR for the detection of Salmonella spp. in food: An alternative approach to a conventional PCR system suggested by the FOOD-PCR project", J Microbiol Methods, 66(3), pp. 538-47. Hossein Fazzeli, Mohammad Reza Arabestani, Bahram Nasr Esfahani F. K. et al. (2012), "Development of PCR-based method for detection of Enterobacteriaceae in septicemia", J Res Med Sci, 17(7), pp. 671-675. Houck P. M., Bratzler D. W., Nsa W. et al. (2004), "Timing of antibiotic administration and outcomes for Medicare patients hospitalized with communityacquired pneumonia", Arch Intern Med, 164(6), pp. 637-44. Island M. D., Mobley H. L. (1995), "Proteus mirabilis urease: operon fusion and linker insertion analysis of ure gene organization, regulation, and function", J Bacteriol, 177(19), pp. 5653-60. J. Vandepitte and J. Verhaegen, K. Engbaek, P. Rohner et al. (2003), Basis laboratory proceduce in clinical bacteriology 2nd edition edn.: World Health Organization. Jonathan D. Dattelbaum C. V. L., 2 David E. Johnson,2,3, Mobley1* a. H. L. T. ( 2003), "UreR, the Transcriptional Activator of the Proteus mirabilis Urease Gene Cluster, Is Required for Urease Activity and Virulence in Experimental Urinary Tract Infections", Infection and immunity, 71( 2), pp. 1026–1030. Jordan J. A., Durso M. B., Butchko A. R. et al. (2006), "Evaluating the near-term infant for early onset sepsis: progress and challenges to consider with 16S rDNA polymerase chain reaction testing", J Mol Diagn, 8(3), pp. 357-63. Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H. L. (2004), "Pathogenic Escherichia coli", Nat Rev Microbiol, 2(2), pp. 123-40. Liu P., Li P., Jiang X. et al. (2012), "Complete genome sequence of Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286, a multidrug-resistant strain isolated from human sputum", J Bacteriol, 194(7), pp. 1841-2. Maheux A. F., Picard F. J., Boissinot M. et al. (2009), "Analytical comparison of nine PCR primer sets designed to detect the presence of Escherichia coli/Shigella in water samples", Water Res, 43(12), pp. 3019-28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. MariaC.Rivera. J. L. (2014), "The ring of life provides evidence for a genome fusion origin of eukaryotes", Clin Microbiol, 52(4), pp. 1168-76. Martin GS M. D., Eaton S, Moss M, (2003), "The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000", N Engl J Med, 348, pp. 1546–1554. McCann C. D., Jordan J. A. (2014), "Evaluation of MolYsis Complete5 DNA extraction method for detecting Staphylococcus aureus DNA from whole blood in a sepsis model using PCR/pyrosequencing", J Microbiol Methods, 99, pp. 1-7. Park D. W., Chun B. C., Kim J. M. et al. (2012), "Epidemiological and clinical characteristics of community-acquired severe sepsis and septic shock: a prospective observational study in 12 university hospitals in Korea", J Korean Med Sci, 27(11), pp. 1308-14. Pletz M. W., N. Wellinghausen, et al. (2011), "Will polymerase chain reaction (PCR)-based diagnostics improve outcome in septic patients? A clinical view", Intensive Care Med 37(7), pp. 1069-76. Poore C. A., Coker C., Dattelbaum J. D. et al. (2001), "Identification of the domains of UreR, an AraC-like transcriptional regulator of the urease gene cluster in Proteus mirabilis", J Bacteriol, 183(15), pp. 4526-35. Poore C. A., Mobley H. L. (2003), "Differential regulation of the Proteus mirabilis urease gene cluster by UreR and H-NS", Microbiology, 149(Pt 12), pp. 3383-94. Sambrook J. F. E. F., Maniatis T., (1989), Molecular cloning I-III. A Laboratory Mannual London, UK: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Samuel Baron ( 1996), Medical Microbiology. 4th edition edn. University of Texas Medical Branch at Galveston. Simonson A. B., Servin J. A., Skophammer R. G. et al. (2005), "Decoding the genomic tree of life", Proc Natl Acad Sci U S A, 102 Suppl 1, pp. 6608-13. T. salik, E. L.Jones, D.Nicholson B. W., L.Liesenfeld, O.Park, L. P.Glickman, S. W.Caram, L. B.Langley, R. J.van Velkinburgh, J. C.Cairns, C. B.Rivers, E. P.Otero, R. M.Kingsmore, S. F.Lalani, T.Fowler, V. G.Woods, (2010), "Multiplex PCR to diagnose bloodstream infections in patients admitted from the emergency department with sepsis", J Clin Microbiol, 48(1), pp. 26-33. T.S. Jacoby a, R.S. Kuchenbecker b, R.P. dos Santos b, L. Magedanz c, P. Guzatto c, L.B. Moreira, (2010), "Impact of hospital-wide infection rate, invasive procedures use and antimicrobial consumption on bacterial resistance inside an intensive care unit", Journal of Hospital Infection, 75(1), pp. 23 – 37. Waters D., Jawad I., Ahmad A. et al. (2011), "Aetiology of community-acquired neonatal sepsis in low and middle income countries", J Glob Health, 1(2), pp. 154-70.