Tài liệu Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống hoa cúc (tím huế, phan trắng, pha lê, pháo hoa, kim cương) bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ===    === HOÀNG THỊ THANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH NĂM GIỐNG HOA CÚC (TÍM HUẾ, PHA LÊ, PHAN TRẮNG, PHÁO HOA, KIM CƯƠNG) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học: TS. LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI - 2016 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. La Việt Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, Phòng thí nghiệm sinh lý thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Thanh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống hoa cúc (Tím huế, Phan trắng, Pha lê, Pháo hoa, Kim cương) bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả nghiên cứu của người khác. Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Thanh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6- benzyl amino purin NAA Napthalene acelic acid CT Công thức Agar Thạch MS Murashige & Skoog, 1962 ĐC Đối chứng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài......................................................................................... 1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................. 2 3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn ........................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Nguồn gốc ............................................................................................... 3 1.2. Vị trí phân loại ........................................................................................ 4 1.3. Đặc điểm thực vật học cây hoa cúc ........................................................ 4 1.4. Giá trị sử dụng......................................................................................... 4 1.5. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam ........................................................................................................ 6 1.5.1. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới ............ 6 1.5.2. Tình hình sản xuất và thương mại hoa cúc ở Việt Nam ................... 6 1.6. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây hoa cúc bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................................................................... 7 1.6.1. Trên thế giới ...................................................................................... 7 1.6.2. Ở Việt Nam ....................................................................................... 9 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 11 2.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 11 2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm.............................................................. 11 2.2.1. Dụng cụ ........................................................................................... 11 2.2.2. Thiết bị ............................................................................................ 11 2.4. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 12 2.5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 13 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ....................................................... 13 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 13 2.5.3. Phương pháp phân tích thống kê số liệu ......................................... 14 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 15 3.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của năm giống hoa cúc .............. 15 3.1.1. Giống cúc Tím huế ......................................................................... 16 3.1.2. Giống cúc Phan trắng...................................................................... 19 3.1.3. Giống cúc Pha lê ............................................................................. 22 3.1.4. Giống cúc Pháo hoa ........................................................................ 25 3.1.5. Giống cúc Kim cương ..................................................................... 28 3.2. Ảnh hưởng của NAA tới khả năng ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc ........................................................................................................ 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 40 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các giống cúc được sử dụng trong nghiên cứu *....................................... 11 Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Tím huế........................................................ 16 Bảng 3.1.2. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Phan trắng ....................................... 19 Bảng 3.1.3. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Pha Lê ............................................. 22 Bảng 3.1.4. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Pháo hoa .......................................... 25 Bảng 3.1.5. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Kim cương ...................................... 28 Bảng 3.2. Khảo sát sự ra rễ của năm giống cúc trên môi trường MS bổ sung NAA 0,3 mg/l ....................................................................... 31 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 3.1.1. Giống cúc tím Huế ....................................................................... 18 Hình 3.1.2. Giống cúc Pham trắng .................................................................. 21 Hình 3.1.3. Giống cúc Pha lê .......................................................................... 24 Hình 3.1.4. Giống cúc Pháo hoa ..................................................................... 27 Hình 3.1.5. Giống cúc Kim cương .................................................................. 30 Hình 3.3. Sản xuất thử nghiệm giống Pha lê ngoài tự nhiên .......................... 32 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là một loài hoa trồng chậu và cắt cành phổ biến trên thế giới. Ngày nay, nó đã được nhân giống thành công bằng nhiều phương pháp như nuôi cấy đoạn cắt, mô sẹo, tế bào trần và tái sinh thành cây con [20]. Cùng với sự phát triển của xã hội, chất lượng cuộc sống con người được nâng cao thì người ta càng chú ý đến những giá trị thẩm mỹ và tinh thần; trong đó hoa là một trong những lựa chọn của con người để làm đẹp cho cuộc sống, sản xuất hoa trở thành ngành kinh tế phát triển đem lại nhiều giá trị kinh tế cao. Hoa cúc là một trong những loại hoa được ưa chuộng và phổ biến nhất. Hoa cúc hấp dẫn con người bởi sự đa dạng về màu sắc, dáng vẻ; chúng được sử dụng nhiều trong các buổi lễ trang trọng; nhiều loài còn có tác dụng chữa bệnh, dùng để tách chiết tinh dầu hay ngâm rượu; giá cả lại phải chăng. Ngoài ra, hoa cúc còn có sự hấp dẫn lớn tới các nhà kinh doanh bởi độ bền, bông lâu tàn, khi tàn bông chỉ héo chứ không rụng, năng suất cao. Với các ưu thế đó, hoa cúc đang được các nhà trồng hoa chú trọng phát triển. Khi sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo, phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến. Cây hoa cúc được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp vô tính qua phương pháp giâm cành truyền thống. Nhiều năm qua, thực tế cho thấy phương pháp này không đáp ứng kịp nhu cầu giống, mặt khác còn mang nguy cơ lây lan bệnh hại và làm thoái hóa giống. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in vitro tỏ ra rất hiệu quả trong sản xuất số lượng lớn cây trồng sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng nhất về mặt di truyền, không những tận dụng được chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ mà còn 1 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp rút ngắn được thời gian sinh trưởng và phát triển của cây so với trồng từ hạt. Do đó, tôi lựa chọn đề tài: “Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống hoa cúc (Tím huế, Phan trắng, Pha lê, Pháo hoa, Kim cương) bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật” nhằm nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân nhanh, ra rễ và rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên, phục vụ sản xuất hoa thương phẩm. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1. Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân giống năm giống hoa cúc (Tím huế, Phan trắng, Pha lê, Pháo hoa, Kim cương) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Quy trình tập trung vào giai đoạn nhân nhanh, ra rễ và rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện ngoài tự nhiên. 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP, BAP kết hợp nước dừa và BAP kết hợp NAA đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của năm giống cúc (Tím huế, Phan trắng, Pha lê, Pháo hoa, Kim cương) Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA tới khả năng ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh. Nghiên cứu rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên. 3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn Ý nghĩa lí luận: Bổ sung nguồn tài liệu khoa học về ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP, BAP kết hợp NAA, BAP kết hợp nước dừa đến quá trình tái sinh chồi in vitro, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ cho chồi in vitro. Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhằm cung cấp nguồn giống sạch bệnh, chất lượng cao. 2 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc Hoa cúc còn được gọi Higo-giku (bằng tiếng Nhật), nghĩa là hoa vàng, có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản (C. indicum và C. zawadskii) được trồng cách đây khoảng 2000 năm [22], [27]. Cúc Higo là cây trồng tự nhiên chỉ có duy nhất ở Higo (trước đây là tỉnh Kumamoto) của đảo Kyushu, được đặc trưng bởi hình thức canh tác độc đáo và kỹ thuật sản xuất có uy tín vào nửa sau thế kỷ XVII [34]. C. coronarium và C. segetum phân bố rộng rãi ở Địa Trung Hải, phía tây châu Phi và châu Á [37]. Vào năm 1860, nhân dịp thăm viếng Nhật Bản, ông Robert Fortune đã đem về Châu Âu nhiều loại cúc mới. Trong sự phát triển hoa cúc, chính sự lai giống tiếp của các loại cúc này mà người ta được thêm nhiều giống mới nữa. Ở châu Úc, hoa cúc được trồng tại Tasmania vào năm 1836, New South Wales 1843, Victoria 1855 và ở New Zealand 1860. Ở Mỹ cuối thế kỷ XIX, cúc được trồng rất nhiều. Riêng hoa cúc của Việt Nam hiện tại có xuất xứ từ Trung Quốc, Nhật Bản và châu Âu. Trên thế giới đã có rất nhiều hội Hoa Cúc Quốc gia được thành lập. Ở Anh Hội Hoa Cúc Anh Quốc được thành lập vào năm 1846 tại Stoke Newington. Dần dần nhiều Hội Hoa Cúc Quốc Gia khác cũng được thành lập như ở Canada, Châu Úc, New Zealand, Mỹ, Pháp và Nam Phi... Hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum vào năm 1753. Nhà thực vật học Thụy Điển Carl Linné đã đặt cho cây hoa cúc tên này. Chrysanthemum bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Chrysos - vàng (gold) và Anthos - bông, hoa. Các nhà chuyên môn trong ngành đều đồng ý cho rằng Linné đặt tên như vậy rất đúng vì hoa cúc khởi thủy là một bông nhỏ màu vàng. 3 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.2. Vị trí phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật Cúc được xếp vào lớp hai lá mầm (Dicotyledones), phân lớp Cúc (Asteriles), bộ Cúc (Asterales), phân họ hoa Cúc (Asteraceae), chi Chrysanthemum [14]. 1.3. Đặc điểm thực vật học cây hoa cúc Rễ: Thuộc loại rễ chùm, đầu chóp rễ phân nhánh mạnh, trong điều kiện thích hợp thì phát triển rất nhanh hình thành bộ rễ có nhiều nhánh, điều này rất có lợi cho sức hút nước của cây [10]. Thân: Cúc là cây thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gãy nên khi cây lớn phải làm giàn để đỡ cây khỏi đổ. Thân cúc đứng hay bò, cao hay thấp, đốt ngắn hay dài, sự phân nhánh mạnh hay yếu tùy thuộc vào từng giống [35]. Lá: Lá cúc thường xẻ thùy, có răng cưa, lá đơn mọc so le nhau, mặt dưới bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng lưới. Từ mỗi nách lá thường sinh ra một mầm nhánh. Phiến lá to hay nhỏ, đậm nhạt hay xanh vàng còn tùy theo giống [18]. Hoa: Là hoa đơn tính hoặc hoa lưỡng tính có nhiều màu sắc khác nhau, có đường kính từ 1,5 - 12 cm, có thể là hoa đơn hay hoa kép, thường mọc trên một cành, phát sinh từ các nách lá [19]. Quả: Cây hoa cúc có dạng quả bế khô, hình trụ, hơi dẹt, chỉ chứa một hạt. Hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ [15]. 1.4. Giá trị sử dụng Phân loài của họ cúc rất đa dạng, bao gồm các giống cây trồng quan trọng (hoa cắt) và cây trồng trang trí (chậu và vườn), cũng như các cây trồng thực phẩm trong nấu nướng, có dược tính và dược lý đang được quan tâm [24]. Năm 1966, hoa cúc được Thị trưởng Richard J. Daley công nhận là hoa chính thức của thành phố Chicago, Illinois [38]. Hoa cúc cũng là hoa chính thức của thành phố Salinas, California. Ở Trung Quốc, một số loại hoa cúc 4 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp được sử dụng làm trà, thậm chí được sử dụng làm thuốc trừ sâu thân thiện môi trường. Ở Nhật Bản, hoa cúc được coi là người bạn tâm tình và có một “lễ hội hạnh phúc” để kỉ niệm. Hoa cúc được dử dụng rộng rãi ở Nhật Bản: 40% sử dụng làm quà, 25% cho các cơ sở thương mại (khách sạn, sự kiện), 25% sử dụng trong gia đình để thờ cúng và 10% cho mục đích giáo dục trong giảng dạy cắm hoa nghệ thuật [29]… Riêng ở Việt Nam, hoa cúc thường có mặt ở công viên, vườn hoa, phòng khách, bàn làm việc, trong các lễ thăm viếng… Ngoài ra cúc còn được trồng đại trà nhằm mục đích cắm hoa bình, trồng trong bồn hay để trang trí… [5], [37]. Hoa cúc Garland C. coronarium, trồng ở Nhật Bản, Trung Quốc và Đông Nam Á là họ hàng gần của rau diếp và là một loài ăn được có giá trị [31]. Cúc cũng như như các thành viên khác của Anthemideae là một nguồn cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị sinh học, các hợp chất có hoạt tính và các loại tinh dầu [17]. Theo Lê Kim Biên thì họ cúc gồm có 374 loài, trong đó có 181 loài đã biết giá trị sử dụng [4]. Làm thuốc: Cây hoang dại 85%, 16 loài cây trồng. Làm cảnh: 30 loài (nhập nội có nguồn gốc nước ngoài). Rau ăn: 31 loài tự nhiên, 4 loài trồng. Thuốc trừ sâu: 3 loài (không gây độc) Phân xanh: 1 loài, cúc quỳ ở Mỹ dùng để phủ đất trống bạc màu. Chất béo và tinh dầu: 12 loài, đặc biệt là cây thanh hao. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ thì việc sản xuất và nhân giống hoa cúc trở nên dễ dàng hơn rất nhiều. Người ta đã có thể kéo dài được tuổi thọ của hoa, điều khiển hoa theo ý muốn, trồng trái vụ hoặc cho nở hoa vào các dịp lễ tết đã làm cho giá trị của hoa cúc được tăng lên nhiều lần. 5 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.5. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam 1.5.1. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới Tuy cây hoa cúc có nguồn gốc từ lâu đời nhưng đến năm 1688, Jacop Layn (Hà Lan) mới trồng phát triển mang tính thương mại ở nước này và đến tận thế kỉ XX nó mới có ý nghĩa thương mại trên thế giới. Các giá trị sản xuất hoa ở Nhật Bản đã tăng gấp đôi trong thập kỉ qua, là kết quả của sự cải thiện nhanh chóng điều kiện sống và hưởng thụ cuộc sống, hoa cúc chiếm 35% tổng sản lượng hoa cắt cành. Liên quan đến sản xuất hoa cúc mỗi năm [21], Nhật Bản là quốc gia đứng đầu thế giới về sản xuất hoa cúc (2 tỷ USD), tiếp theo là Hà Lan (800 triệu USD), Colombia (600 triệu USD), Italy (500 triệu USD) và Mỹ (300 triệu USD) [23]. 1.5.2. Tình hình sản xuất và thương mại hoa cúc ở Việt Nam Ở Việt Nam, diện tích trồng hoa cúc còn ở mức khiêm tốn, khoảng 3500 ha, chủ yếu tập trung ở các vùng trồng hoa như: Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt… chủ yếu là các giống cúc nhập nội. Riêng Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh hàng năm sản xuất hàng chục triệu cành hoa cúc cắt, cúc chậu phục vụ nhu cầu trong nước. Ở Hải Phòng cúc là cây quan trọng thứ hai trong cơ cấu sản xuất hoa tươi. Cùng với Layơn, cúc là mặt hàng xuất khẩu tiềm năng trong những năm tới. Ở các tỉnh phía nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớn nhất. Đà Lạt là vùng lý tưởng cho nhiều giống cúc sinh trưởng và phát triển. Có thể nói, so với những năm trước đây sản xuất hoa cúc ở Việt Nam đã tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, lượng hoa sản xuất ra còn rất hạn chế so với nhu cầu rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn mà cây hoa cúc có thể đem lại nếu được đầu tư phát triển. Năm 2014, hoa cúc nhập khẩu từ Việt 6 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Nam được giao dịch với giá 29 Yen/cành trên thị trường bán sỉ tại Tokyo, chỉ bằng một nửa so với giá cúc trồng tại Nhật và thấp hơn từ 30 - 40% đối với cúc nhập từ Malaysia, Trung Quốc [39]. Hiện nay ở Việt Nam, việc nhân giống cây hoa cúc chủ yếu bằng phương pháp vô tính bằng giâm cành, nuôi cấy in vitro. 1.6. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây hoa cúc bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.6.1. Trên thế giới Năm 1974, Asjes và cộng sự (Hà Lan) đã chứng minh rằng có thể sử dụng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô. Ông đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống cúc sạch bệnh. Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thức hiện thành công bởi Fukai, Goi và Tanak (1991) [22]. Các tác giả đã nghiên cứu phương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỉ lệ sống và tái sinh chồi cao nhất. Ngoài chồi đỉnh các nhà nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp bộ phận khác nhau của cây hoa cúc để nuôi cấy như: đoạn thân, mẫu lá… cho thấy các đoạn thân có khả năng tái sinh chồi cao hơn các mẫu lá. Cùng năm đó Lu, Nugent và Wadlei [26] đã thành công trong tái sinh cây trực tiếp từ những đoạn thân của cây hoa cúc trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2 0,5 mg/l BAP và 0,2 - 2 mg/l NAA, tỷ lệ tạo chồi cao nhất là 100%. Đối với những đoạn thân của cây đã thành thục, khả năng phát sinh chồi cao hơn. Người ta còn có thể nhân giống hoa cúc bằng cách tái sinh callus từ các mẫu cấy thân và lá. Ngoài ra, việc sử dụng cánh hoa, quả để làm nguyên liệu nuôi cấy tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Cho đến nay, việc sử dụng chồi đỉnh và chồi nách để làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô vẫn là biện pháp phổ biến nhất vì sử dụng chồi đỉnh và chồi nách 7 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp dễ thành công, ít nhiễm bệnh, có hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng các bộ phận khác của hoa cúc để nuôi cấy. Sử dụng phương pháp này cho phép tạo ra một số lượng lớn cây con sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn, hoàn toàn đáp ứng được cho sản xuất ở quy mô công nghiệp. Smavanda Vantu (2005), tiến hành nhân nhanh 2 giống Prince de Monaco và Romica bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, kết quả môi trường MS bổ sung BAP 2 mg/l và NAA 0,002 mg/l cho kết quả tối ưu [33]. Methods Mol Biol (2010), tiến hành nhân giống từ đốt thân của giống Kitam trên môi trường MS cơ bản, chiếu tia gama gây đột biến làm thay đổi màu sắc ban đầu của hoa [28]. Kashif Waseem và cộng sự (2011), tiến hành nhân nhanh cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium L.) từ đốt thân. Sau khi khử trùng với HgCl 1%, họ tiến hành nuôi cấy mẫu trên môi trường MS cơ bản bổ sung IAA, BAP, NAA với các nồng độ khác nhau. Kết quả: môi trường MS bổ sung IAA 0,3 mg/l và MS bổ sung BAP 1,0 mg/l là tốt nhất cho nhân nhanh và tái sinh chồi cúc; môi trường bổ sung IBA 0,2 mg/l kết hợp NAA 0,2 mg/l phù hợp nhất cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh [25]. Snjezana Keresa và cộng sự (2012), tiến hành nhân nhanh giống cúc Palisade White từ chồi nách và phôi soma bằng vi nhân giống trên môi trường bổ sung các loại chất điều hòa sinh trưởng có nồng độ khác nhau như: BAP, GA, IAA, NAA, IAB, 2,4_D. Kết quả: môi trường MS bổ sung BAP 0,1 mg/l + GA 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất từ 3,7 - 4,1 chồi/mẫu; môi trường bổ sung IAA 2mg/l cho rễ dài nhất (2,24 cm); môi trường bổ sung IBA 0,5 mg/l cho nhiều rễ nhất: khoảng (5,3 rễ/chồi) [32]. Aurelia Slusarkiewicz-Jarzina và cộng sự (2014), sử dụng mô lá của giống Bronze Bornholm nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung cytokinins (kinetin - KIN, zeatin - ZEA, BAP) và auxins (2,4_D, NAA, IAA, PFA) với 8 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp nồng độ khác nhau, kết luận môi trường thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi là môi trường bổ sung kinetin 4 mg/l; NAA 2 mg/l và PFA 50 mg/l [16]. 1.6.2. Ở Việt Nam Ở Việt Nam mặc dù cây hoa cúc đã được nhập nội vào nước ta từ lâu nhưng sự hiểu biết cũng như kết quả nghiên cứu về cây hoa này còn chưa nhiều. Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu thường tập trung vào việc tập hợp các kinh nghiệm trồng hoa và các phương pháp nhân giống. Từ năm 1992, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp với bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1988) đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang được trồng phổ biến ở miền Bắc nước ta như cúc CN93, vàng Đài Loan, đỏ Hà Lan [6]. Từ năm 2001 - 2005, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tiến hành khảo sát, đánh giá và so sánh các giống hoa cúc nhập từ Hà Lan. Kết quả đã tuyển chọn cho sản xuất giống hoa cúc chùm CN20 có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt, cây cao 70 - 90 cm, thân cứng khỏe, thời gian sinh trưởng 3 - 4 tháng, hoa đẹp được người tiêu dùng ưa chuộng và được trồng 2 vụ chính là vụ Thu và Đông [8]. Nguyễn Thị Diệu Hương, Dương Tấn Nhựt (2004) khi nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống cây hoa cúc (Chrysanthemum indicum L.) sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong môi trường 1/2 MS đã bổ sung BAP kết hợp với NAA, IAA, IBA theo sự biến thiên của các chất kích thích sinh trưởng. Kết quả cho thấy trong môi trường 1/2 MS có bổ sung NAA (0,2 - 0,5 mg/l), IBA (0,2 - 0,5 mg/l) đều tạo rễ cho chồi cây hoa cúc tốt hơn trong môi trường 1/2 MS có bổ sung IAA (0,2 - 0,5 mg/l) [7]. 9 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Trần Thu Hiền và cộng sự (2007), nghiên cứu phương pháp sản xuất giống cúc CN97 bằng nuôi cấy mô tế bào, kết luận môi trường bổ sung NAA 0,5 mg/l là môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh phù hợp nhất cho chồi cúc CN97 [11]. Hoàng Thị Thái Hòa và Đỗ Đinh Thục (2010), nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân bón lá Diệp lục tố, Growmore, Agriconik, phân chiết suất từ cá, hỗn hợp ngâm ủ (gồm: cá kết hợp chất dinh dưỡng vô cơ) đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa cúc Chi vàng Đà Lạt [2]. La Việt Hồng và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống cúc CN01 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy: môi trường tái sinh đa chồi phù hợp là môi trường MS bổ sung BAP 0,7 mg/l; môi trường ra rễ cho cây in vitro là môi trường MS bổ sung NAA 0,3 mg/l; cây con được rèn luyện trên giá thể tro trấu và xơ dừa (1:1) cho tỷ lệ sống cao nhất [3]. 10 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu thực vật Bảng 2.1. Các giống cúc được sử dụng trong nghiên cứu * STT Tên giống 1 Tím huế 2 Phan trắng 3 Pha lê 4 Pháo hoa 5 Kim cương * Các giống cúc do Phòng Sinh lý thực vật, khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 thu tại làng hoa Mê Linh - Hà Nội cung cấp. Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Sinh lý thực vật, khoa Sinh KTNN - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.2.1. Dụng cụ Dao cấy, khay cấy, panh gắp, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, pipet, kéo… 2.2.2. Thiết bị Nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần, máy đo pH, cân kĩ thuật, tủ lạnh Hitachi, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô trùng, Cân phân tích 2.3. Môi trường nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng thực vật Môi trường nuôi cấy cơ bản [13]: MS + 30 g/l đường sacharose + 7 g/l agar và chất điều hòa sinh trưởng của hãng Dulchefa, Hà Lan chứa khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin, pH môi trường là 5,8. Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng: BAP (6-benzyl amoni purie), NAA (α- Naphthalene acetic acid). Ngoài ra trong nghiên cứu còn sử dụng nước dừa. 11 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp BAP là một homone thực vật nằm trong nhóm cytokinin. Nó là dạng cytokinin tổng hợp đầu tiên giúp cho quá trình phát triển của cây. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, BAP đã được sử dụng từ lâu và đem lại các kết quả rất tích cực BAP được sử dụng với mục đích kích thích tạo nhánh bên. Tuy nhiên chồi bên tạo ra có kích thước nhỏ [1], và có thể gây ra hiện tượng mọng nước (thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ). Ở nồng độ BAP quá cao sẽ dẫn đến việc mọc quá nhiều chồi không như mong muốn. NAA là một homone thực vật nằm trong nhóm auxin. Là chất điều khiển sinh trưởng chủ yếu kích thích sinh trưởng tế bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng ưu thế ngọn, thường được sử dụng trong việc phát sinh rễ [1]. Cũng như BAP, NAA cũng được sử dụng trọng nuôi cấy mô tế bào thực vật. Người ta đã sử dụng NAA riêng lẻ để kích thích tạo rễ hoặc sử dụng kết hợp với BAP hay kinetin trong việc tạo chồi. Tỉ lệ BAP và NAA sẽ định hình sự phát triển của mô thực vật. Nước dừa được sử dụng trong nuôi cấy invitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đẩy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy. Nước dừa bổ sung vào môi trường các loại đường, protein tốt trong tăng trưởng của mô [12]. Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở 117 o C trong 15 phút. 2.4. Điều kiện nuôi cấy Tất cả các thí nghiệm đều thực hiện ở điều kiện nhân tạo: Ánh sáng: Sử dụng đèn chiếu sáng Neon Cường độ chiếu sáng 2000 - 3000 lux Thời gian chiếu sáng từ 6h - 20h hàng ngày Nhiệt độ: 25o C - 27o C Độ ẩm trung bình: 50% - 70% 12