Tài liệu Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống cúc (phan vàng, sao đỏ, đại đóa, thạch bích, vàng hè) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN --------  ------- PHẠM THỊ NHÌ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH NĂM GIỐNG CÚC (PHAN VÀNG, SAO ĐỎ, ĐẠI ĐÓA, THẠCH BÍCH, VÀNG HÈ) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI - 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN --------  ------- PHẠM THỊ NHÌ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH NĂM GIỐNG CÚC (PHAN VÀNG, SAO ĐỎ, ĐẠI ĐÓA, THẠCH BÍCH, VÀNG HÈ) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học: TS. La Việt Hồng HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: TS. La Việt Hồng, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 là người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận này. Hơn nữa, thầy luôn động viên giúp tôi vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. Ngoài ra, để hoàn thành đề tài này tôi cũng đã nhận được những sự chỉ bảo cả về kiến thức chuyên ngành cũng như phương pháp tiến hành thí nghiệm từ tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa sinhKTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tôi xin được cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi giúp tôi có thể vượt qua những khó khăn để hoàn thành được đề tài này. Hà Nội, ngày…..tháng 5 năm 2016 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Nhì LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống cúc (Phan vàng, Sao đỏ, Đại đóa, Thạch bích, Vàng hè) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của các tác giả khác. Hà Nội, ngày…..tháng 5 năm 2016 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Nhì DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Agar Thạch BAP 6 - Benzyl amino purin IAA Beta - Indole - acetic acid IBA Indode - 3 - Butyric acid MS Murashige and Skoog, 1962 ND Nước dừa TDZ Thidiazuron BA Benzyl Adenin NAA Naphthalene acetic acid MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................ 1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................ 2 3. Ý nghĩa của đề tài ...................................................................................... 2 NỘI DUNG ....................................................................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc ....................................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc của hoa cúc ................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm của hoa cúc ..................................................................... 3 1.2. Giá trị sử dụng ........................................................................................ 4 1.3. Phương pháp nhân giống cây hoa cúc.................................................... 4 1.3.1. Phương pháp nhân giống truyền thống .......................................... 4 1.3.2. Phương pháp nhân giống hoa cúc hiện đại/kĩ thuật nuôi cấy mô .. 5 1.4. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ............................................... 8 1.4.1. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới ................... 8 1.4.2. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ở Việt Nam .................... 8 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 9 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 9 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 9 2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................ 9 2.1.3. Môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật.... 9 2.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro .............................................................. 9 2.2. Thời gian, địa diểm .............................................................................. 10 2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 10 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................... 10 2.3.2. Phương pháp xử lí số liệu thống kê .............................................. 11 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 12 3.1. Tái sinh và nhân nhanh 5 giống hoa cúc bằng kĩ thuật nuôi cấy mô ... 12 3.1.1. Giống cúc Phan vàng .................................................................... 12 3.1.2. Giống cúc Sao đỏ .......................................................................... 16 3.1.3. Giống cúc Đại đóa ........................................................................ 20 3.1.4. Giống cúc Thạch bích ................................................................... 24 3.1.5. Giống cúc Vàng hè ........................................................................ 28 3.2. Ra rễ và tạo cây in vitro hoàn chỉnh..................................................... 33 3.3. Rèn luyện cây thích nghi với điều kiện tự nhiên ................................. 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của giống cúc Phan vàng ............................... 13 Bảng 3.1.2. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của giống cúc Sao đỏ ..................................... 17 Bảng 3.1.3. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của giống cúc Đại đóa ................................... 21 Bảng 3.1.4. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của giống cúc Thạch bích .............................. 25 Bảng 3.1.5. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của giống cúc Vàng hè .................................. 29 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA 0,3 mg/l đến sự ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh của chổi cúc in vitro ...................................................................... 33 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1.1. Quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cúc Phan vàng sau 4 tuần nuôi cấy ........................................................ 12 Hình 3.1.2. Quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cúc Sao đỏ sau 4 tuần nuôi cấy.............................................................. 16 Hình 3.1.3. Quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cúc Đại đóa sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................ 20 Hình 3.1.4. Quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cúc Thạch bích sau 4 tuần nuôi cấy....................................................... 24 Hình 3.1.5. Quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cúc Vàng hè sau 4 tuần nuôi cấy ........................................................... 28 Hình 3.2. Ảnh hưởng của NAA đến ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc in vitro ...................................................................................... 33 Hình 3.3. Rèn luyện cây cúc in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên ........... 34 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hoa cúc (Chrysanthemum) là một trong số những loại hoa cắt cành và hoa trồng chậu quan trọng nhất trên thế giới. Các giống hoa cúc thương mại thường được nhân giống bằng cắt đốt hoặc cắt chồi bên [28]. Nhu cầu về hoa cúc ngày càng cao do đó phương pháp nhân giống cũng liên tục được cải tiến nhằm tạo ra những giống cây với số lượng lớn, chất lượng cao. Tuy nhiên phương pháp nhân giống bằng cách cắt chồi bên được tiến hành trong thời gian dài, cây bố mẹ không được phục tráng… đã làm cho giống bị suy thoái, cây dễ bị mắc bệnh làm giảm năng suất, chất lượng hoa. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học việc áp dụng phương pháp nuôi cấy mô (in vitro) hoàn toàn có thể khắc phục được các nhược điểm trên. Ngày nay, cả những nước phát triển cũng như một số vùng chuyên canh hoa ở Việt Nam như Đà Lạt đã tiến hành sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để tạo ra số lượng cây con lớn, đồng đều, chất lượng cao đáp ứng nhu cầu cây giống [3]. Vườn hoa Mê Linh-Hà Nội là một trong những khu vực trồng hoa lớn của cả nước với diện tích trên 500 ha [3]. Các loại hoa được trồng phổ biến tại đây như: cúc, hồng, lily…Trong đó cây hoa cúc chiếm diện tích gần một nửa đất trồng. Tuy nhiên cây cúc tại đây cũng không được quan tâm sử dụng phương pháp hay kĩ thuật mới để nhân giống, sản xuất. Xuất phát từ những lí do trên tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống cúc (Phan vàng, Sao đỏ, Đại đóa, Thạch bích và Vàng hè) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô” nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống 5 giống cúc bằng kĩ thuật nuôi cấy mô để cung cấp giống cúc chất lượng cho 1 thị trường. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nhân giống cho 5 giống cúc Phan vàng, Sao đỏ, Đại đóa, Thạch bích, Vàng hè bằng kĩ thuật nuôi cấy mô. 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của của BAP, BAP kết hợp nước dừa, BAP kết hợp NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của 5 giống cúc Phan vàng, Sao đỏ, Đại đóa, Vàng hè, Thạch bích. Nghiên cứu ảnh hưởng của α- NAA đến khả năng tạo rễ và tạo cây in vitro hoàn chỉnh. Nghiên cứu rèn luyện cây con thích nghi với điều kiện tự nhiên. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa lí luận Cung cấp tư liệu khoa học về cúc: ảnh hưởng của BAP, BAP kết hợp nước dừa, BAP kết hợp NAA đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi cúc in vitro. Ảnh hưởng của NAA đến ra rễ và tạo cây in vitro hoàn chỉnh, cũng như khả năng thích nghi của chồi cúc in vitro với môi trường tự nhiên. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Là cơ sở để hoàn thiện quy trình nhân giống 5 giống cúc bằng kĩ thuật nuôi cấy mô, nhằm cung cấp giống cúc chất lượng cho thị trường. 2 NỘI DUNG Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc 1.1.1. Nguồn gốc của hoa cúc Hoa cúc lần đầu tiên được trồng ở Trung Quốc như một loại thảo mộc có hoa khoảng 500 năm TCN. Các giống hoa cúc đã được giới thiệu từ Trung Quốc đến Nhật Bản trong thế kỉ thứ 8 SCN. Hà Lan dường như là quốc gia đầu tiên ở Châu Âu nhập khẩu hoa cúc vào năm 1688 nhưng nó không thể sống. Đến năm 1789, 3 giống được nhập khẩu vào Pháp từ Trung Quốc trong đó chỉ có 1 giống sống sót và được trồng ở Anh năm 1975 và ở đó nó được gọi là “ hoa cúc đẹp trai”. 8 giống sau đó được Anh nhập vào từ Trung Quốc vào đầu thế kỉ 19 và nó tăng dần lên con số 48 giống vào năm 1826. Năm 1836, hoa cúc được đưa tới Tasmania từ Anh và đã được trồng ở New South Wales, Australia năm 1843, nó cũng được đưa đến Victoria (Mĩ) vào năm 1855 và đến lượt New Zealan vào năm 1960 [20]. 1.1.2. Đặc điểm của hoa cúc Hoa cúc được biết đến như Gul-e-daudi hoặc là hoàng hậu của mùa thu. Hoa Cúc thuộc họ cúc Asteraceae. Nó rất hấp dẫn, quyến rũ và là cây trồng ngắn ngày, nó vừa thể hiện như là một cây trồng hàng năm cũng như hoa thảo dược lâu năm. Chiều cao của cây hoa cúc dao động từ 40 - 60 (cm), các lá mọc so le và có răng cưa, rễ chùm, và gốc là gỗ rắn. Những bông hoa cúc thường nở vào đầu mùa đông với nhiều màu sắc, hình dạng và kích thước. Màu sắc của hoa cúc trong phạm vi từ trắng và kem thông qua các sắc thái của màu vàng, màu hồng, màu đồng, màu đỏ, tím đậm và xanh lá cây [10]. Hoa cúc có thể được trồng trên tất cả các loại đất, tuy nhiên những nơi giàu ánh sáng, đất đai màu mỡ và thoát nước tốt là tốt nhất để canh tác chúng. Độ pH lí tưởng của đất để canh tác hoa cúc là từ 6-7, và chúng phát triển 3 nhanh nhất trong điều kiện cường độ ánh sáng cao. Cúc được phân bố rộng rãi ở Châu Âu, Châu Á, Châu Phi và Châu Mĩ. Trong số 200 loài được biết đến của hoa cúc, một số loài thích hợp cho các khu vườn đá hay vùng cỏ mọc. Hầu hết các giống hoa cúc Đại đóa ngày nay đều là kết quả của sự pha trộn giữa các giống cúc C. sinensis, C. indicum, C. ornatum [29]. Có khoảng 275 giống khác nhau được trồng ở các khu vực khác nhau của thế giới với mục đích làm đẹp và giải trí. Ngoài giá trị làm cảnh hoa của 52 giống của cúc Đại đóa còn có thể ăn được [16]. 1.2. Giá trị sử dụng Ở các quốc gia khác nhau, hoa cúc được sử dụng cho các mục đích khác nhau và vào các dịp khác nhau. Mặc dù tại Nhật bản phần lớn hoa cúc được sử dụng cho mục đích làm quà tặng và thương mại (khách sạn, sự kiện) thì ở một số nước Châu Âu như: Balan, Pháp, Croatia, cụm hoa màu trắng là biểu tượng của cái chết và được sử dụng chủ yếu để trang trí cho các ngôi mộ vào tất cả các Ngày Thần Thánh. Ngoài ra, hoa cúc cũng được trồng làm cây cảnh như các loài hoa cắt khác trên toàn thế giới [19]. Riêng ở Việt Nam, hoa cúc thường có mặt ở công viên, vườn hoa, phòng khách, bàn làm việc, trong các lễ thăm viếng…Ngoài ra, cúc còn được trồng đại trà nhằm mục đích cắm hoa bình, trồng trong bồn hay để trang trí…[2]. Theo Lê Kim Liên thì họ cúc gồm có 374 loài, trong đó có 181 loài đã biết giá trị sử dụng...[1]. 1.3. Phương pháp nhân giống cây hoa cúc 1.3.1. Phương pháp nhân giống truyền thống Trong nông nghiệp việc sản xuất giống cây trồng thông qua giao phấn là việc quan trọng hàng đầu nhằm đảm bảo sự phát triển liên tục của các thế hệ. Hầu hết các loài thực vật được duy trì thông qua sinh sản hữu tính, điều này được thực hiện dễ dàng và đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển 4 của các loài mới trong điều kiện môt trường thay đổi. Mỗi cơ thể được sinh ra nhờ sinh sản hữu tính thường có sự kết hợp độc đáo của các gen [32]. Nhân giống cúc bằng hạt là rất hiếm vì khi cây phát sinh từ hạt, đặc tính di truyền của cây đã bị thay đổi. Ngoài ra sự sinh trưởng và phát triển của cây con lớn lên từ hạt là rất chậm và yếu do đó nhân giống vô tính là phương pháp nhân giống quan trọng và duy nhất để tái tạo các loài thực vật có phẩm chất mong muốn [29]. Cúc được nhân giống vô tính thông qua cắt chồi bên. Phương pháp này được thực hiện đơn giản, dễ làm, cây giống tạo ra nhiều và giá rẻ. Tuy nhiên do nhân giống vô tính trong một thời gian dài không được định kì phục tráng, đã làm giảm năng suất và phẩm chất hoa nên chưa đáp ứng được nhu cầu thị trường. Hơn nữa, việc nhân giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành nên hệ số nhân giống thấp, cây không sạch bệnh [3]. 1.3.2. Phương pháp nhân giống hoa cúc hiện đại/kĩ thuật nuôi cấy mô 1.3.2.1. Trên thế giới Tái sinh từ mô lá: Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy mô in vitro có thể tăng cường sự nhân lên nhiều lần [31]. Sự hình thành các chồi khỏe mạnh với hệ số nhân nhanh cao là một trong những điều kiện tiên quyết để tăng hiệu quả kinh tế mà nuôi cấy mô đem lại. Ngày nay có thể tạo được một số lượng lớn cây trồng từ một mẫu cấy thông qua nuôi cấy mô trong ống nghiệm [11], [15]. Theo Bajaj et al., 1992, [11], Dejong et al. (1993), [15], cho rằng việc nhân nhanh cúc in vitro từ lá giúp tái sinh chồi bất định không qua giai đoạn mô sẹo trung gian. Chen et al (1985), [13], đã tiến hành nuôi cấy lá non của 8 giống cúc trên môi trường MS có bổ sung BAP từ 3-5 mg/l + NAA 2 mg/l và thấy rằng nó tốt nhất cho búp cảm ứng. 5 Urban et al 1994, [39], đã tái sinh thành công chồi từ các mảnh lá của giống cúc Iridon và Helka. Mityushkina et al 1995, [25], đã tái sinh từ mẫu lá 32 trong số 40 giống cúc moriflorium thử nghiệm, trong khi đó Kim and Kim (1998), [23], đã tái sinh chồi trực tiếp từ lóng và các phân đoạn lá của D. indicum và D. zawadskii trên môi trường cơ bản bổ sung BAP 3,0 mg/l và IAA 0,2 mg/l. Oka et al (1999), [27], công bố rằng búp được hình thành chủ yếu từ vết cắt của lá cúc sau 8-9 ngày nuôi cấy trên môi trường cơ bản bổ sung 0,1 mg/l BAP+0,1 mg/l NAA. Datta et al (2002), [14], đã bắt đầu nhận thấy lá cấy của cúc khác biệt khi có sự hiện diện của IB và IAA. Waseem. K (2009), [40], đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh của chồi cúc in vitro và ông nhận thấy ở nồng độ IBA 0,3 mg/l, NAA 0,5 mg/l, IAA 0,1 mg/l ảnh hưởng tốt nhất đến sự tái sinh chồi cúc từ mô lá. Waseem. K (2011) [42] cho rằng sử dụng IAA (0,1 mg/l và 0,2 mg/l) cùng với BAP (1,0-2,0) mg/l có tác động tích cực đến quá trình tái sinh và nhân nhanh cúc so với các nồng độ kết hợp khác. Tái sinh từ đốt thân: Năm 1990, khi nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng Lunegent và Wardly (1990) [24] đã kết luận: đoạn thân cúc dài 1-2 cm cho phát triển trong môi trường cấy BAP thì chúng hình thành 2-3 chồi mới và không có rễ bất định, còn trong môi trường bổ sung 0,1-0,3 mg/l axit IBA thì hình thành 1-2 chồi và không có rễ bất định. Năm 1990, Kenneth C. Torres [22] đã nuôi cấy mô thành công từ đoạn thân và lá cúc trên môi trường MS, tỷ lệ hình thành chồi đạt 100% và trung bình các cây được nuôi cấy mô sau 3-4 tháng đã ra hoa. 6 Tosca et al., 2000 [38] tiến hành tái sinh giống cúc Dendranthema từ đốt thân trên môi trường cơ bản bổ sung 1,25mg/l NAA+ 1,25 mg/l BA. Texixeira da Sival, (2003a,c) [36], [37] tiến hành nghiên cứu tái sinh giống cúc D. grandiflorum ông nhận thấy: Tái sinh trên môi trường cơ bản bổ sung 2-4 mg/l IAA hoặc 4 2,4- D hình thành phôi soma, từ 1-4 mg/l TDZ hình thành mô sẹo, 1-2 mg/l IBA hoặc 2 mg/l NAA hình thành rễ, 1-2 mg/l BA hình thành chồi. Shatnawi. M và cs (2010) [33] đã nhân giống hoa cúc in vitro thành công trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l BAP. 1.3.2.2. Ở Việt Nam Nguyễn Thị Diệu Hương, Dương Tấn Nhựt (2004) [6] khi nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống cây hoa cúc (Chrysanthemum indicum L.) sạch bệnh bằng kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong môi trường ½ MS bổ sung BAP kết hợp với NAA, IAA, IBA theo sự biến thiên của các chất kích thích sinh trưởng. Kết quả cho thấy trong môi trường ½ MS có bổ sung NAA (0,2-0,5 mg/l), IBA (0,2-0,5mg/l) đều tạo rễ cho chồi cây hoa cúc tốt hơn trong môi trường ½ MS có bổ sung IAA (0,2-0,5 mg/l). Năm 2005, Dương Tấn Nhựt và cs [8] tiến hành thí nghiệm nuôi cấy hoa cúc (Chrysanthemum sp.) trong các hộp nhựa tròn có đục lỗ và hộp không đục lỗ. Kết quả cho thấy trọng lượng tươi và chiều cao cây trong 1 lỗ thoáng khí cao hơn rõ ràng so với cây được cấy trong hộp không thoáng khí, có tỉ lệ sống cao, sinh trưởng, phát triển tốt hơn khi ra vườn ươm. Năm 2007, Trần Thị Thu Hiền và cs [4] đã nghiên cứu phương pháp nhân giống hoa cúc CN97 bằng nuôi cấy mô tế bào đã đưa ra kết luận: môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA là môi trường ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh phù hợp nhất cho chồi cúc in vitro. Năm 2014, La Việt Hồng và cs [5] đã hoàn thiện quy trình nhân giống hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun-3) bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro. 7 1.4. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc 1.4.1. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới Hoa cúc là loại hoa giàu truyền thống văn hóa cũng đóng vai trò kinh tế quan trọng, đứng vị trí thứ 2 sau hoa hồng. Nhật Bản là quốc gia sử dụng hoa cúc nhiều nhất vào khoảng 2 tỉ cành/năm, sau đó là Hà Lan (800 triệu cành/năm), Colombia (600 triệu cành/năm), Italy (500 triệu cành/năm) và Mỹ (300 triệu cành/năm) [12]. Giá trị sản xuất hoa ở Nhật Bản đã tăng gấp đôi trong thập kỷ qua là kết quả của sự cải thiện nhanh chóng của điều kiện sống và hưởng thụ của cuộc sống, với hoa cúc chiếm 35% tổng sản lượng hoa cắt cành [12]. Một số nước nhập và xuất khẩu hoa cúc trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Hà Lan, Pháp, Đức, Nga, Mỹ, Singapore, Isaren [12]. 1.4.2. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ở Việt Nam Ở Việt Nam, diện tích trồng hoa cúc còn ở mức khiêm tốn, khoảng 3500 ha, tập trung chủ yếu ở các vùng trồng hoa như Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt... và chủ yếu là các giống cúc nhập nội. Riêng Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh, hàng năm sản xuất hàng chục triệu cành hoa cúc cắt, cúc chậu phục vụ cho nhu cầu trong nước. Ở Hải Phòng, cúc là cây quan trọng thứ hai trong cơ cấu sản xuất hoa tươi. Cùng với layơn, cúc là một mặt hàng xuất khẩu trong những năm tới. Ở các tỉnh phía Nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớn nhất. Đà Lạt là vùng lý tưởng cho nhiều giống cúc sinh trưởng và phát triển. Có thể nói, so với những năm trước đây sản xuất hoa cúc ở Việt Nam đã tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, lượng hoa sản xuất ra thực sự còn rất hạn chế so với nhu cầu rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn mà cây hoa cúc có thể mang lại nếu được đầu tư phát triển [9]. 8 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các giống cúc: Phan vàng, Sao đỏ, Đại đóa,Thạch bích, Vàng hè do phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp. 2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: Cân kĩ thuật, tủ lạnh sâu, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần, buồng cấy vô trùng, máy khuấy từ ra nhiệt, cân phân tích, tủ ấm, Micropipet Jinson. Dụng cụ: Cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml), giấy báo, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo… 2.1.3. Môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật - Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962) [26] gồm các khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin…thường được sử dụng trong nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật (phụ lục). - Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng: BAP (6 - Benzyl amino purin); NAA (Naphthalene acetic acid) của hãng Dulchefa, Hà Lan. Ngoài ra, nghiên cứu còn sử dụng nước dừa trong một số thí nghiệm. - Các thành phần khác: Đường saccharose: 30 g/l của công ty TNHH Đức Lộc cung cấp, Agar: 7 g/l của công ty Long Hải cung cấp. Môi trường được điều chỉnh về pH= 5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl 1N) trước khi khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1170C, 1 atm trong 15 phút. 2.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối. Nhiệt độ: 25± 20C Độ ẩm: 50-60% Cường độ ánh sáng: 2000 lux. 9 2.2. Thời gian, địa diểm Thí nghiệm được tiến hành tại phòng Sinh lý thực vật, khoa SinhKTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi cúc in vitro Trong nghiên cứu này sử dụng BAP, BAP kết hợp nước dừa (ND), BAP kết hợp NAA để tái sinh và nhân nhanh. Các tiêu chí đánh giá bao gồm: Số chồi/mẫu, chiều cao chồi (cm), nguồn gốc phát sinh chồi, độ đồng đều của chồi, đặc điểm chồi, màu sắc mô sẹo/đường kính mô sẹo, hiện tượng hoại tử và thủy tinh hóa sau 4 tuần nuôi cấy, cụ thể gồm 3 thí nghiệm sau: * Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BAP: Sử dụng môi trường MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar bổ sung BAP (0,0 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 1,0 mg/l). * Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BAP+10%ND: Sử dụng môi trường MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar bổ sung 10% ND + BAP (0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l). * Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BAP + NAA: Sử dụng môi trường môi trường MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar bổ sung BAP (0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 1,0 mg/l) kết hợp NAA (0,02 mg/l; 0,04 mg/l). 2.3.1.2. Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh Trong nghiên cứu này sử dụng α-NAA làm chất kích thích ra rễ cho chồi cúc in vitro. Các tiêu chí đánh giá bao gồm: Số rễ, chiều dài rễ, thời gian bao lâu để chồi cúc ra rễ. * Thí nghiệm 4: Sử dụng môi trường môi trường MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar bổ sung 0,3 mg/l NAA. 2.3.1.3. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 10 * Thí nghiệm 5: Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: Trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn và tiến hành rèn luyện một trong năm giống cúc giống cúc đó là cúc Đại đóa trực tiếp ngoài đồng ruộng, tiêu chí đánh giá là tỉ lệ sống sót của cây con. 2.3.2. Phương pháp xử lí số liệu thống kê Các số liệu được phân tích theo các tham số thống kê gồm giá trị trung bình, độ lệch chuẩn…trên chương trình Exel 2007 theo mô tả của Nguyễn Văn Mã và Cs, 2013 [7]. Sự sai khác giữa các công thức được kiểm định bằng giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với α = 0,05. 11