Tài liệu Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây xuân hoa (

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 1 LỜI CẢM TẠ Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những ngƣời thân đã nuôi dƣỡng và giáo dục con nên ngƣời. Tôi xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Thầy chủ nhiệm, thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành biết ơn: - TS. Phan Phƣớc Hiền. - Kỹ sƣ Trịnh Phi Ly. Đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu đã tận tình giúp đỡ trong việc lấy mẫu lá Xuân Hoa và đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn. - TS. Nguyễn Ngọc Hải, Phòng Vi Sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm. - Cô và Chú Đinh Công Bảy, chủ cơ sở trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh đã tận tình giúp đỡ và cung cấp số lƣợng lớn lá Xuân Hoa. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. iii TÓM TẮT Đỗ Thị Tuý Phƣợng, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2007. “ Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Phan Phƣớc Hiền Đề tài đƣợc tiến hành tại: - Phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Thời gian tiến hành: từ 15/3/2007 đến 30/7/2007. Nội dung tiến hành: - Tiến hành chiết tách các phân đoạn từ cao kháng khuẩn nhất bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, sau đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn này với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế để tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. - Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội. - Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của lá Xuân hoa bằng quy trình DPPH. Kết quả đạt đƣợc: - Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với nồng độ ức chế tối thiểu là : MICE. coli = 500 µg/ml. iv MICsalmonella= 500 µg/ml. - Tách chiết đƣợc 18 phân đoạn và xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn là XH9, XH10, XH11, XH12, XH13. - Tiến hành tách chiết trên phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn này thu đƣợc 2 hợp chất XH-K11 và XH-K13. - Sau khi chạy phổ và tham khảo một số tài liệu, đã định danh đƣợc XH-K11 là apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử: C21H20O10 và chất XH-K13 là β- sitosterol-3-O- β-glucoside, có công thức phân tử: C35H60O5. - Khảo sát tính chống oxy hóa của lá Xuân Hoa cho thấy hàm lƣợng các phân tử ức chế DPPH là khá cao (85,7%), thông qua so sánh chỉ số IC50 của mẫu Xuân Hoa với Vitamin C: IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). v SUMMARY Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi Minh City. “Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa leaves”. Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Content: - Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that researching antibacterial property of these fractions for E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these antibacterial fractions. - Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process. Result: - Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with : MICE. coli = 500 µg/ml. MICsalmonella= 500 µg/ml. - Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction. - Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin 7-O-β- glucoside and β- sitosterol-3-O- β-glucoside. - Determination of antioxidant property of Xuan Hoa extract shows that the molecular volume which inhibits oxidant activity is high (85,7% Vitamin C): IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). vi MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm Tắt ......................................................................................................................... iv Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. xi Danh sách các hình và biểu đồ ...................................................................................... xii Danh sách các bảng và sơ đồ ....................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 2 1.2. Mục đích - Yêu cầu ................................................................................................ 2 1.2.1. Mục đích.............................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu................................................................................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa ................................................................................... 3 2.1.1. Đặc điêm thực vật học......................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 3 2.1.3. Phân bố ................................................................................................................ 4 2.1.4. Nhân giống .......................................................................................................... 4 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa ................................................................................ 4 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian ................................................................................. 4 2.2.2. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 5 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan ............................................................................................. 5 2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo ............................................................... 10 2.3. Thành phần hóa học ............................................................................................... 13 2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ..................................................... 15 vii 2.4.1. Alcaloid ............................................................................................................... 15 2.4.2. Flavonoid............................................................................................................. 16 2.4.3. Tinh dầu .............................................................................................................. 16 2.4.4. Saponin ................................................................................................................ 17 2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột ........................................................................ 17 2.5.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 17 2.5.2. Hình thể ............................................................................................................... 17 2.5.3. Tính chất nuôi cấy ............................................................................................... 18 2.5.4. Đặc tính sinh hóa ................................................................................................. 18 2.5.5. Sức đề kháng ....................................................................................................... 19 2.5.6. Độc tố .................................................................................................................. 19 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên........................................................................................ 19 2.5.8. Khả năng gây bệnh .............................................................................................. 21 2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm .............................................................. 21 2.6.1. Staphyl ococcus aureus ....................................................................................... 21 2.6.2. Pseudomonas aeruginosa.................................................................................... 21 2.6.3. Escherichia coli ................................................................................................... 21 2.6.4. Salmonella ........................................................................................................... 22 2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH ............................................................................. 23 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...................................................... 24 3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 24 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................................. 24 3.2.1. Địa điểm .............................................................................................................. 25 3.2.2. Thời gian ............................................................................................................. 25 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................................. 25 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 25 3.3.2. Hóa chất .............................................................................................................. 27 viii 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ........................................................................................... 28 3.4.1. Xử lý nguyên liệu ................................................................................................ 28 3.4.2. Điều chế các loại cao........................................................................................... 28 3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa .................................................................................. 28 3.4.2.2. Điều chế cao chloroform .................................................................................. 29 3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol..................................................................................... 29 3.4.2.4. Điều chế cao nƣớc ............................................................................................ 29 3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao ....................................................... 31 3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất cao chloroform ........................................................ 32 3.4.4.1. Sắc ký cột ........................................................................................................ 32 3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 35 3.4.4.3. Sắc ký điều chế ................................................................................................ 37 3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn ............................................................................. 38 3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc tách chiết từ cao chloroform ....................................................................................................................................... 38 3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH ...................................................... 40 3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH ................................................................... 40 3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH ................................................. 40 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 44 4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết .................................... 44 4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng .................... 45 4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform................................................................ 45 4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. ................................................ 47 4.2.2.1. Phân đoạn XH11 .............................................................................................. 47 4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 ................................................................................. 47 4.2.2.3. Phân đoạn XH13 .............................................................................................. 48 4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết. ............................................................... 49 ix 4.3.1. Chất XH-K13 ...................................................................................................... 49 4.3.2. Chất XH-K11 ...................................................................................................... 50 4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform. .................................................................................................................... 52 4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa ................................................................. 55 4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C ....................................................................... 55 4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa .................................................. 56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 58 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 58 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 60 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 62 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI C Cfu COSY d DEPT DMSO DPPH E HMBC HSQC IC50 IR J LD50 m Me MIC MS Nt NMR Rf s t TSA Brain Heart Infirm Chloroform Colony forming unit Correclation Spectroscopy Double: mũi đôi Distortionlees Enhancement by Polarization Transfer Dimethylsulfuoxid 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl Ete dầu hỏa Heteronuclear multiple bond correction Heteronuclear single quantum coherence Inhibitory Concentration 50: nồng độ ức chế 50% DPPH Infrared Spectrometry: hồng ngoại Coupling constant: hằng số ghép cặp Lethal dose 50: liều gây chết 50% số cá thể Multiplet: mũi đa Methanol Minimum Inhibitory Concentration: nồng độ ức chế tối thiểu Mass Spectrometry: khối phổ Nhƣ trên Nuclear Magnetic Resonnace: cộng hƣởng từ hạt nhân Retention factor Single: mũi đơn Tripplet: mũi ba Tryptic Soy Agar xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cây Xuân Hoa............................................................................................. 3 Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê ........................................................................ 29 Hình 3.2: Chất phân tích đã đƣợc đƣa vào cột sắc ký ................................................... 33 Hình 3.3: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng ................................................................... 36 Hình 3.4: Sắc ký điều chế ............................................................................................. 37 Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C và mẫu Xuân Hoa sau khi cho DPPH vào ................................................................................................................................. 43 Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli v à Salmonella ............................. 44 Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng ........................................................................ 47 Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng ........................................................................ 48 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. Coli ................................... 52 Hình4.5 : Các nồng độ kháng E. coli của phân đoạn XH9 ........................................... 53 Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 ........................ 54 Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 .......................... 54 Đồ thị 4.1: Vitamin C .................................................................................................... 55 Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa........................................................................................ 56 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột ...................................................................... 7 Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng ................................................................................................................................ 9 Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột ..................... 9 Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan ......................................................................... 10 Bảng 2.5: Ảnh hƣởng của lá tƣơi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trƣởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo.......................................................................... 11 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy .............................................................. 12 Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm ........................................................... 39 Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa..................................................... 42 Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ mẫu vitamin C ..................................................... 43 Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao ...................... 44 Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên Cao Chloroform.................................................. 45 Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn ........................... 53 Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C.................................................... 55 Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa ........................................... 56 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của mẫu Xuân Hoa đối với độ hấp thụ của DPPH ................ 57 Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu .................................................................... 28 Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao ............................................................... 30 Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH ............................................ 41 xiii 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) là một loại cây đƣợc dân gian biết đến nhƣ là một dƣợc liệu có thể chữa đƣợc rất nhiều căn bệnh: bệnh tiêu hóa, tiểu đƣờng, trĩ nội, chảy máu, suy nhƣợc thần kinh…Tuy nhiên, trên thực tế có rất ít nghiên cứu về cây này để có thể làm rõ vẫn đề trên. Hiện nay trên thế giới chƣa có một nghiên cứu nào sâu xa về cây này. Các nhà khoa học Việt Nam cũng chỉ mới bƣớc đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó. Trần Công Khánh và cộng sự (1999) đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính và có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hƣớng bảo vệ tế bào gan. Huỳnh Kim Diệu (2003) đã thử nghiệm lá Xuân Hoa đối với heo chƣa cai sữa có tác dụng tăng trọng và chữa đƣợc bệnh dịch tả. Và gần đây, trong Hội Nghị Khoa Học và Công Nghệ Hóa Hữu Cơ Toàn Quốc lần thứ 3 Hà Nội 11 – 2005, Phan Phƣớc Hiền và cộng sự đã công bố công trình phân lập Triterpenoid và Steroid từ lá cây Xuân Hoa Psenderanthemum palatiferum họ Acanthaceae bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân. Hiện nay, nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa trở nên rất phổ biến. Phƣơng pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tƣợng kháng thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phƣơng pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số bệnh nhiễm khuẩn. Thêm vào đó, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn nhƣ 2 các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…Vì thế trong công trình này chúng tôi cũng khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá Xuân Hoa. Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ cao chloroform . Xác định phân đoạn kháng vi khuẩn: E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn kháng khuẩn. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá cây Xuân Hoa. 1.2.2. Yêu cầu Cô lập 4 loại cao: Ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol, nƣớc. Dùng phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch để xác định cao có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Tiến hành sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để tách các phân đoạn và một số hợp chất từ lá Xuân Hoa. Sử dụng phƣơng pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các phân đoạn đƣợc ly trích từ cao chloroform. Tiến hành ly trích lá cây Xuân Hoa và đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng 517 nm [3] để xác định khả năng chống oxy hóa. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa 2.1.1. Đặc điểm thực vật học [2] Tên khoa học: Pseudranthemum palatiferum. Họ: Ô rô (Acanthaceae) Tên thông thƣờng: Xuân Hoa, Hoàn Ngọc, Tú Linh, Nhật Nguyệt, Thần Tƣợng Linh, Lan Điền,… 2.1.2. Đặc điểm hình thái [2, 6] Cây có thể cao 1-2 m (nếu trồng trên đất vƣờn nhà), sống lâu năm. Thân cây xanh hoặc tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều mảnh. Lá mọc đối hình mũi mác, dài 12-17 cm, rộng 3,5-5 cm, gốc lá hơi men xuống. Hình 1.1: Cây Xuân Hoa Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành. Cụm hoa dài 10-16 cm. Hoa lƣỡng tính, không đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có 4 5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nửa chiều dài của thùy, môi dƣới gồm 3 thùy to, thuỳ giữa của môi dƣới có các chấm màu tím. Quả nang 2 ổ, mỗi ổ chứa 2 hạt. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch. Cây mọc hoang ra hoa gần nhƣ quanh năm. 2.1.3. Phân bố [6, 14] Hiện nay cây Xuân Hoa đƣợc trồng ở nhiều nơi nhƣ một loại cây thuốc gia đình. Cây mọc hoang ra hoa gần nhƣ quanh năm. Gần đây đƣợc phát hiện mọc hoang ở vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng (Ninh Bình), rừng Bình Nguyên (Phạm Hoàng Lộ, 1999). Ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa một số bệnh về tiêu hóa. Ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số nhà trồng cây Xuân Hoa để chữa táo bón. Đặc biệt gần đây nhất chúng tôi đƣợc biết có một số doanh nghiệp ở Tây Ninh đã dùng lá và rễ cây Xuân Hoa này làm trà và đƣợc bán rộng rãi ra thị trƣờng với tên gọi trà Hoàn Ngọc. 2.1.4. Nhân giống [6 ] Cây Xuân Hoa có thể nhân giống dễ dàng bằng cách giâm cành. Lấy đoạn cành bẻ, cách ngọn khoảng 20 cm, bỏ bớt vài lá phía dƣới, cắm vào đất ẩm, để chỗ mát, hàng ngày tƣới đều (khoảng 2-3 lần/ngày). Cây chịu đất xốp và độ ẩm trung bình. Chỉ sau 1 tuần cành giâm đã ra rễ. Cây phát triển nhanh. Trồng khoảng trên 2 tháng là có thể dùng làm thuốc chữa bệnh. 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian Cây Xuân Hoa đƣợc dùng trong dân gian để chữa nhiều bệnh nhƣ: - Nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hoá, đau dạ dày, đau bụng không rõ nguyên nhân. - Loét hành tá tràng, chảy máu đƣờng ruột. - Khôi phục phục sức khoẻ cho ngƣời ốm yếu, chữa suy nhƣợc thần kinh. - Chấn thƣơng chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thƣơng sọ não. - Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt. 5 - Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trƣớng, làm giảm đau khi bị ung thƣ gan giai đoạn phát bệnh. - Điều chỉnh huyết áp. - Ở Trung Quốc, ngƣời ta dùng rễ cây Xuân Hoa để chữa đòn ngã tổn thƣơng. Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng Xuân Hoa để chữa những bệnh thuộc đƣờng tiêu hóa. Thời gian gần đây, một số Việt kiều ở Mỹ cũng đã dùng cây Xuân Hoa để chữa bệnh đái tháo đƣờng. Bệnh nhân dùng liên tục cây Xuân Hoa giữ đƣợc ổn định tỷ lệ đƣờng trong máu. Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt. Ngƣời ta thƣờng dùng lá tƣơi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nƣớc, giã nát lấy nƣớc uống hoặc nấu ăn. Liều lƣợng phu thuộc vào ngƣời bệnh, từng bệnh, thông thƣờng ăn 2-8 lá/ngày, chia làm 2 lần trƣớc bữa ăn. 2.3.1. Tác dụng sinh học 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan [9] Để góp phần xác minh tác dụng đƣợc lƣu truyền trong dân gian và chứng minh tác dụng của cây thuốc Xuân Hoa, Trần Công Khánh và cộng sự của ông đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá cây Xuân Hoa trên in vivo.  Thử độc tính cấp - Chuột nhắt trắng, chia làm 6 lô, mỗi lô 7 con. - Thuốc thử: Cao đặc toàn phần đƣợc cân và hòa tan bằng nƣớc cất, thu đƣợc các dung dịch có hàm lƣợng khác nhau: 33,2 mg/ml; 66,8 mg/ml; 125,2 mg/ml; 222,4 mg/ml; 367,6 mg/ml; 460 mg/ml. - Tiến hành: Cho mỗi chuột uống 0,5 ml dung dịch thuốc Xuân Hoa ở các lô khác nhau: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg; 5,56 g/kg; 9,19 g/kg; 11,5g/kg thể trọng chuột. Quan sát diễn biến hành vi, sau đó giết ngẫu nhiên 3 chuột ở 3 lô khác 6 nhau: quan sát đại thể phủ tạng và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của thuốc nhƣ tim - gan - thận - dạ dày - ruột. - Kết quả: o Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc và trong suốt quá trình thử nghiệm thuốc không gây thay đổi trạng thái hoạt động của chuột: Chuột vẫn bò lui tới, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi… o Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kh; 11,5 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhƣng sau 1giờ thì trở lại bình thƣờng, chuột rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng. o Tất cả các chuột thí nghiệm (ở liều trên) đều không chết. Chuột sống khỏe mạnh sau 48 giờ. o Quan sát đại thể: Các phủ tạng đều bình thƣờng. o Làm vi thể các cơ quan: Cắt thành miếng mỏng và nhuộm tế bào, quan sát dƣới kính hiển vi (Bảng 2.1). Cơquan Liều Tim Gan Thận Dạ dày Ruột Đánh giá 7 0,83g/kg 9,19g/kg Cơ tim Các tĩnh Quản cầu và Niêm Niêm Không bình mạch xoang các ống thận mạc dạ mạc ruột có tổn thƣờng. và tĩnh mạch bình thƣờng. dày và và các thƣơng trung tâm tuyến tuyến thực thể trên thuỳ bình bình ở các xung huyết. thƣờng. thƣờng. tạng. Cơ tim Tế bào gan Quản cầu Niêm Niêm Có thoái bình hơi to, xung huyết, mạc dạ mạc ruột hoá nhẹ thƣờng. nguyên sinh các ống thận dày và và các ở gan. chất có thoái bình thƣờng. tuyến tuyến bình bình thƣờng. thƣờng. hoá nhẹ. 11,5g/kg Cơ tim Tế bào gan Nang Niêm Niêm mạc Có tổn bình hơi to, Bowmann mạc dạ ruột và thƣơng thƣờng. nguyên sinh rộng ra, tế dày và các tuyến nhẹ ở chất có thoái bào thành tuyến bình gan và hoá nhẹ, tĩnh ống teo nhỏ. bình thƣờng. thận. mạch trung thƣờng. tâm trên thuỳ xung huyết. Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột Kết luận: Cao toàn phần Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều. Nhƣ vậy, trên độc tính cấp cao Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50.  Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan - Chuột nhắt trắng, chi làm 6 lô, mỗi lô từ 8 – 12 con. - Cao toàn phần lá Xuân Hoa đã loại bỏ chlorophyl, hòa tan với nƣớc cất.