Tài liệu Xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng human papilloma virus nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở việt nam bằng kỹ thuật realtime pcr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- Nguyễn Thanh Tâm XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƢ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------- Nguyễn Thanh Tâm XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƢ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VÂN TRANG TS. LÊ HỒNG ĐIỆP Hà Nội – 2016 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vân Trang, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Lê Hồng Điệp cùng các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại Phòng Miễn dịch Vắc xin –Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệđộng viên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học viên Nguyễn Thanh Tâm Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ADN/ ARN (Deoxi)ribonucleic acid Vật chất di truyền Primer Mồi - HPV Human Papillomavirus Papillomavirus gây bệnh trên người Hr-HPV High risk HPV Nhóm HPV nguy cơ cao Lr-HPV Low risk HPV Nhóm HPV nguy cơ thấp LRC Long Control Region Vùng kiểm soát dài của gen PCR Polymerase Chain Reaction Probe - Đầu dò gắn huỳnh quang Reverse - Primer ngược ORF Open Reading Frame Khung đọc mở của gen ORI Origin Vị trí khở đầu tái bản OD Optical density Mật độ quang của mẫu ADN URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa của gen UTCTC - Ung thư cổ tử cung Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………………………... DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………………………… MỞ ĐẦU................................................................................................................................ 6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 8 1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus........................................................................... 8 1.1.1 Đặc điểm hình thái của HPV ........................................................................................ 8 1.1.2 Đặc điểm sinh học phân tử............................................................................................ 8 1.1.3 Phân loại HPV ............................................................ Error! Bookmark not defined. 1.2 HPV và ung thƣ cổ tử cung ............................................. Error! Bookmark not defined. 1.2.1 Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới .. Error! Bookmark not defined. 1.2.2 Đường lây truyền của HPV ......................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.3 Các bệnh lý thường gặp do HPV, cách phòng nhiễm và điều trị..... Error! Bookmark not defined. 1.2.4 Chu kỳ nhân lên và cơ chế gây bệnh của HPV ........... Error! Bookmark not defined. 1.2.5 Các phương pháp phát hiện HPV .............................. Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................... Error! Bookmark not defined. 2.1 Vật liệu .............................................................................. Error! Bookmark not defined. 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................. Error! Bookmark not defined. 2.1.2 Sinh phẩm và vật tư tiêu hao ...................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.3 Máy móc và thiết bị .................................................... Error! Bookmark not defined. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................ Error! Bookmark not defined. 2.2.1 Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 .....Error! Bookmark not defined. 2.2.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 .......................................... Error! Bookmark not defined. 2.2.3 Thẩm định phương pháp phát hiện chủng HPV16, 18, và 33/52..... Error! Bookmark not defined. 2.3 Nội dung thực hiện ........................................................... Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................... Error! Bookmark not defined. 3.1 Xây dựng kỹ thuật Realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 . Error! Bookmark not defined. 3.1.1 Kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe ........ Error! Bookmark not defined. 3.1.2 Kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe .......... Error! Bookmark not defined. 3.2. Tạo chứng dƣơng và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52..................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.1 Khuếch đại trình tự đích ............................................. Error! Bookmark not defined. 3.2.2 Nhân dòng gen tạo chứng dương ................................ Error! Bookmark not defined. 3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật Realtime PCR .......... Error! Bookmark not defined. 3.3 Thẩm định phƣơng pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52Error! Bookmark not defined. 3.3.1 Xác định độ chính xác của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 .................................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.2 Xác định độ chụm (hệ số tái lâp và hệ số lặp lại) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 .......................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.2.1 Xác định hệ số lặp lại của phương pháp .................. Error! Bookmark not defined. 3.3.2.2 Xác định hệ số tái lập của phương pháp .................. Error! Bookmark not defined. Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 3.3.3 Xác định độ đặc hiệucủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 .................................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.4 Xác định độ nhạycủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 ............................................................................................. Error! Bookmark not defined. KẾT LUẬN .............................................................................. Error! Bookmark not defined. KIẾN NGHỊ ............................................................................ Error! Bookmark not defined. TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 9 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các type HPV và các bệnh có liên quan............................................................11 Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm HPV trên một số tỉnh thành phố tại Việt Nam...............................13 Bảng 1.3. Các cặp mồi dùng cho PCR phát hiện HPV…………………………………...22 Bảng 2.1. Thành phần kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe...........................29 Bảng 2.2. Thành phần kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe………………….29 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khuếch đại trình tự đích.................................................30 Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng khuếch đại trình tự đích..........................................30 Bảng 3.1. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16….34 Bảng 3.2. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18….36 Bảng 3.3. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52.37 Bảng 3.4. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC…………………..38 Bảng 3.5. Kết quả kỹ thuật realtime PCR 4 cặp primer và probe phát hiện HPV16, HPV18 và HPV33/52……………………………………………………………………………...39 Bảng 3.6. Kết quả phản ứng Realtime PCR đa cặp primer và probe với chứng dương….47 Bảng 3.7.Kết quả thí nghiệm xác định độ chính xác của phương pháp…………………50 Bảng 3.8.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số lặp lại của phương pháp…………………..52 Bảng 3.9. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại…….53 Bảng 3.10.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập của phương pháp…………………55 Bảng 3.11. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập….57 Bảng 3.12. Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của phương pháp…………………58 Bảng 3.13.Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy của phươngpháp……………………..61 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hạt vi rút của HPV ……………………………………………………………...3 Hình 1.2. Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16 ……………………………….4 Hình 1.3. Cây phả hệ của 118 genotype của Papilomavirus dựa trên trình tự gen vùng L1 ORF ......................................................................................................................................9 Hình 1.4. Tỷ lệ nhiễm HPV ở nữ giới trên thế giới .......................................................... .12 Hình 1.5. Chu kỳ nhân lên của HPV …………………………………………………….16 Hình 1.6. Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV ............................................................21 Hình 3.1. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16 ……………………………………………………….35 Hình 3.2. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18 ………………………………………………………………36 Hình 3.3. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 …………………………………………………………...37 Hình 3.4. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC ………………………………………………………………………………39 Hình 3.5. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR 4 cặp primer và probe phát hiện HPV16, 18 và 33/52 …………………………………………………40 Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV16E6-E7, HPV18L1 …………41 Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV52L1 ………………………....42 Hình 3.8. Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tư HPV16E6-E7 ...........................................43 Hình 3.9. Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7 ..............................44 Hình 3.10. Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV18L1 ..............................................44 Hình 3.11. Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV18L1 ..................................45 Hình 3.12. Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV52L1 ..............................................46 Hình 3.13. Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV52L1 ..................................46 Hình 3.14. Kết quả kỹ thuật realtime đa cặp primer và probe với chúng dương ………..48 Hình 3.15. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định độ chính xác …………………………………………………………………………………………….51 Hình 3.16. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số lặp lại …………………………………………………………………………………………….52 Hình 3.17. Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại …………………..53 Hình 3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 1 ……………………………………………………………………………………..56 Hình 3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 2 ……………………………………………………………………………………..56 Hình 3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 3 ……………………………………………………………………………………..56 Hình 3.21. Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập …………………..57 Hình 3.22.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu …………………………………………………………………………………………….59 Hình 3.23. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ nhạy …..62 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 MỞ ĐẦU Human papillomavirus (HPV) là tác nhân thường gặp nhất trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư xếp thứ tư trong các loại ung thư mà nữ giới thường mắc phải và xếp thứ hai với nữ giới độ tuổi 15-44[41]. HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà còn có vai trò quan trọng trong các nguyên nhân dẫn đến ung thư hậu môn, âm đạo, dương vật, ung thư phổi và một số ung thư vùng hầu họng. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh lý lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-hậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinhv.v…[32] Hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 529.000 ca mắc mới UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp, trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở những nước đang phát triển[21]. Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới – đặc biệt ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục[21, 34].Cùng với sự lây nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới. Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2012, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao ở nữ giới, xếp thứ 2 trong số các loại ung thư mà nữ giới độ tuổi 15-44 hay mắc phải, với hơn 5000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 8.1/100.000 phụ nữ) và tử vong hơn 2000 trường hợp mỗi năm[40]. Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn biến từ nhiễm virus đến ung thư thường trải qua thời gian dài. Quá trình tiến triển từ mức dộ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 – 25 năm[22].Đây chính là cơ hội cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm.Hiện nay ở Việt Nam, xét nghiệm tế bào mô bệnh học (Pap smear) đã được đưa vào thành thường quy trong chương trình sàng lọc UTCTC, các xét nghiệm HPV cũng đã phổ biến tuy nhiên chi phí còn cao đối với các kit chẩn đoán đã thương mại hóavà yêu cầu đảm bảo chất lượng xét nghiệm với các xét nghiệm trong nước[8]. 6 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc xác định genotype HPV, cũng như xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài “Xây dựng phƣơng pháp phát hiện một số chủng Human Papillomavirus có nguy cơ cao gây ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR” được thực hiện với mục tiêu sau: 1. 2. Xây dựng phương pháp phát hiện chủng HPV 16, 18 và 33/52 bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR. Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV 16, 18, 33/52 bằng kỹ thuật multiplex realtime PCR trên mẫu dịch quét cổ tử cung. Đề tài nàyđược chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin,ViệnVệ sinh Dịch tễ Trung ương. 7 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 CHƢƠNG1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus Papillomaviruslàcác thành viên trong họ Papillomaviridae, được tìm thấy trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con người. Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó.CácPapillomavirusgây bệnh cho người gọi là Human papillomavirus(HPV). 1.1.1Đặc điểm hình thái của HPV HPV là nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ.Hạt virus có đường kính 5255nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer.Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu). Hình 1.1.Hạt vi rút của HPV[14] Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa[14]. 1.1.2Đặc điểm sinh học phân tử 1.1.2.1 Cấu trúc hệ gen HPV là virus có vật liệu di truyền là ADN, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-ADN).ADN của virus liên kết với histone tạo 8 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. 2. 3. 4. 5. Dung N. T. N. D. (2004), "Khảo sát sự liên quan giữa mẹ nhiễm HPV và con bệnh u nhú thanh quản," Thời sự Y Dược học, 4, 4. Hiếu N. T. H. (2004), "Tần xuất nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh," Thời sự Y Dược học, 4, 5. Trung N. T. H. (2007), "HPV và tổn thương cổ tử cung," Y Học TP. Hồ Chí Minh, 3, 4. Vân P. H. V. (2009), "PCR và real-time PCR: Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp. Sinh học phân tử," Nhà xuất bản Y học, 27. Văn T. T. V. (2010), "PCR và một số kỹ thuật Y sinh học phân tử. Sinh học phân tử," Nhà xuất bản Y học, 68. Tài liệu tiếng Anh 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. A B.-P. (2009), "Molecular Signature of HPV-Induced Carcinogenesis: pRb, p53 and Gene Expression Profiling," Current genomics, 10, 9. Anco M. B. K., Wim Q., Leen-J.D (2005), "Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections," Journal of Clinical Virology, 32, 9. Bao Y.P. S. J. S., Qiao Y.L., ACCPAB members (2008), "Human papillomavirus type distribution in women from Asia: a meta-analysis," International Journal of Gynecologycal cancer, 18, 10. Bernard H.U. B. R. D., de Villiers E.M, et al. (2010), "Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and prodương tínhal of taxonomic amendments," Virology, 401, 10. Boccardo E L. A. V. L. (2010), "The role of inflammation in HPV carcinogenesis," Carcinogenesis, 31, 8. Bodaghi S. W. L. V., Roby G., Ryder C., et al (2010), "Could human papillomaviruses be spread through blood?," Journal of Clinical Microbiology, 43, 7. Bontkes H. J., T.D. deGruijl, J.M.Walboomers, J.T.Schiller, J. Dillner, T.J. Helmerhorst, R.H.Verheijen, R.J.Scheter, and C.J.Meijer (1999), "Immune responses again human papillomavirus (HPV) type 16 virus-like particles in a cohort study of women with cervical intraepithelial neoplasia. II. Systemic but not local IgA responses correlate with clearance of HPV-16," J.Gen. Virol, 80, 9. Burchell AN W. R., de Sanjose S, FrancoEL (2006), "Chapter 6 epiderniology and transmission dynamics of genital HPV infection vaccine 2006," Vaccine, 24, 10. Burd E. M. (2003), "Human papillomavirus and cervical cancer," Clin Microbiol Rev, 16, 1-17. Chan P. K., M.Y. Chan, W.W.Li, D.P.Chan, J.L.Cheung, and A.F.Cheung (2001), "Association of human beta-herpesvirus with the development of cervical cancer; by standers or cofactor?," J.Clin. Pathol, 54, 6. 9 Luận văn tốt nghiệp 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. Nguyễn Thanh Tâm – K22 Clifford G. F. S., Diaz M., Munoz N., Villa L.L (2006), "Chapter 3: HPV typedistribution in women with and without cervical neoplastic diseases," Vaccine, 24, 9. Daojun Yu Y. C., Shenghai Wu, Baohong Wang, Yi-Wei Tang, Lanjuan Li (2012), "Simultaneous Detection and Differentiation of Human Papillomavirus Genotypes 6, 11, 16 and 18 by AllGlo Quadruplex Quantitative PCR," PLoS One, 11, De Villiers E.M. F. C., Broker T.R., Bernard H.U., zur Hausen H (2004), "Classification of papillomaviruses," Virology, 324, 11. Doorbar J. (2006), "Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer," Clin Sci (Lond), 110, 525-541. EM B. (2003), "Human papillomavirus and cervical cancer," Clinical Microbiology Review, 16, 17. Ferlay J., Shin H. R., Bray F., Forman D., Mathers C. and Parkin D. M. (2010), "Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008," Int J Cancer, 127, 2893-2917. H Z. H. (2011), "Vaccines: what remains to be done?," Vaccine, 10, 3. Hebner C. M. and Laimins L. A. (2006), "Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity," Rev Med Virol, 16, 83-97. Ishizaki A., Matsushita K., Hoang H. T., Agdamag D. M., Nguyen C. H., Tran V. T., et al. (2013), "E6 and E7 variants of human papillomavirus-16 and -52 in Japan, the Philippines, and Vietnam," J Med Virol, 85, 1069-1076. Jenkins A., Allum A. G., Strand L. and Aakre R. K. (2013), "Simultaneous detection, typing and quantitation of oncogenic human papillomavirus by multiplex consensus realtime PCR," J Virol Methods, 187, 345-351. Lehoux M., D'Abramo C. M. and Archambault J. (2009), "Molecular mechanisms of human papillomavirus-induced carcinogenesis," Public Health Genomics, 12, 268-280. Ly Thi-Hai Tran L. T. T., Thanh Cong Bui, Dung Thi-Kieu Le, Alan G Nyitray, Christine M Markham, Michael D Swartz, Chau Bao Vu-Tran and Lu-Yu Hwang (2015), "Risk factors for high-risk and multi-type Human Papillomavirus infections among women in Ho Chi Minh City, Vietnam: A crosssectional study," BMC Women's Health, Martin Moberg I. G., and Ulf Gyllensten (2003), "Real-Time PCR- Based system for Simultaneous Quantification of Human Papillomavirus Types Associated with High Risk of Cervival Cancer," Journal of clinical microbiology, 41, 8. Munoz N., Bosch F. X., de Sanjose S., Herrero R., Castellsague X., Shah K. V., et al. (2003), "Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer," N Engl J Med, 348, 518-527. Munoz N., Castellsague X., de Gonzalez A. B. and Gissmann L. (2006), "Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer," Vaccine, 24 Suppl 3, S3/1-10. Nicol A.F. N. G. J., Dillner J (2010), "A summary of the 25th International Papillomavirus Conference 2009: Vaccines, screening, epidermiology and therapeutics," Journal of Clinical Virology, 47, 8. 10 Luận văn tốt nghiệp 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. Nguyễn Thanh Tâm – K22 Parkin D. M., Bray F., Ferlay J. and Pisani P. (2005), "Global cancer statistics, 2002," CA Cancer J Clin, 55, 74-108. Rachel L. Winer T. G. H., Long Fu Xi, Kathrin U. Jansen, James P. Hughes, Qinghua Feng, Carolee Welebob, Jesse Ho, Shu-Kuang Lee, Joseph J. Carter, Denise A. Galloway, Nancy B. Kiviat, and Laura A. Koutsky (2009), "Quantitative human papilloma virus 16 and 18 levels in incident infections and cervical lesion development," Journal of Medical Virology, 81, 8. Sahiner F K. A., Yapar M, Şener K, Dede M, Gumral R (2014), "Detection of major HPVs by a new multiplex real-time PCR assay using type-specific primers," Journal of Microbiological Method, 97, 7. Sydney (2011), "Verification and Validation Symposium Event - National Institude of Hygiene and Epidemiology," T. C. Dung F. R., N. Becker, P. T. Huong, N. V. Trang, L. M. Tan, P. V. Hung, and N. T. Hien "Prevalence of human papillomavirus (HPV) infection and genotype distribution among women in Vietnam: a meta-analysis," submitted 2015, Tham Chi Dung N. V. T., Frank Roesl, Pham Ngoc Hung, Vu Ba Quyet, Le Quang Thanh, Huynh Xuan Nghiem, Tran Thi Mai Hung, Luong Minh Tan, Nguyen Phuong Anh and Nguyen Tran Hien "Prevalence of high-risk Human Papillomavirus infection among women aged 18-45 in two major cities in Vietnam," submitted 2015, William T Seaman E. A., Marion Couch, Erna M Kojic, Susan Cu-Uvin, Joel Palefsky, Allison M Deal and Jennifer Webster-Cyriaque (2010), "Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR," Virology Journal, 194, Yiqun Liao Y. Z., Qiwei Guo, Xiaoting Xie, Ena Luo, Jian Li,and Qingge Li (2013), "Simultaneous Detection, Genotyping, and Quantification of Human Papillomaviruses by Multicolor Real-Time PCR and Melting Curve Analysis," Journal of Clinical Microbiology. 2013 Feb; 51(2): 429–435., 2, 7. Tài liệu Internet 40. 41. 42. 43. 44. HPV Information Centre (2015), VietNam: Human papilomavirus and Related Diseases, Sumamary Report 2015 http://www.hpvcentre.net/statistics/reports/VNM.pdf (20/12/2015), HPV Information Centre (2015), World: Human papilomavirus and Related Diseases, Sumamary Report 2014. http://www.hpvcentre.net/statistics/reports/XWX.pdf (20/12/2015), http://en.wikipedia.org/wiki/HPV_vaccines, (20/12/2015)," WHO, Human papillomavirus laboratory manual, first edition 2009 http://www.who.int/immunization/hpv/learn/hpv_laboratory_manual__who_ivb_2009_2 010.pdf (20/12/1015) https://www.google.com/webhp?sourceid=chrome-instant&ion=1&espv=2&ie=UT F 8#q=calculate%20copy%20numb 11