Tài liệu Xây dựng phương pháp phân tích phát hiện nhanh thuốc giả bằng phổ Raman

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: 1. Viện kiểm nghiệm thuốc TW 2. Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu và ThS. Đặng Thị Ngọc Lan đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình để tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ ở Khoa kiểm nghiệm nguyên liệu- Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã hướng dẫn tận tình trong thời gian tôi làm thực nghiệm, hoàn chỉnh nghiên cứu này tốt nhất. Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Trường đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt thời gian học dưới mái trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3 1.1. Tổng quan về thuốc giả ........................................................................... 3 1.2. Tổng quan về Isoniazid và Ethambutol ................................................... 5 1.2.2. Danh pháp ........................................................................................ 5 1.2.2. Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol ........................ 6 1.3. Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman........................................ 7 1.3.1. Lịch sử phát triển .............................................................................. 7 1.3.2. Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman .......................................... 9 1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman.......................... 12 1.3.4. Ưu nhược điểm của quang phổ Raman ........................................... 13 1.3.5. Một số ứng dụng của quang phổ Raman trong thực tiễn ................. 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 18 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................ 18 2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 18 2.1.2. Thiết bị............................................................................................ 18 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 19 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................... 21 3.1. Công thức bào chế viên nén và viên nang của các hoạt chất dùng trong nghiên cứu ............................................................................................ 21 3.1.1. Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Isoniazid .. 21 3.1.2. Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Ethambutol .................................................................................................. 24 3.2. Kiểm tra chất lượng của các mẫu viên nghiên cứu ................................ 27 3.3. Kết quả và bàn luận............................................................................... 27 3.3.1 Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của Isoniazid .................................. 27 3.3.2 Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của Ethambutol .............................. 36 3.3.3 Bàn luận .......................................................................................... 45 3.4. Ứng dụng khảo sát các chế phẩm trên thị trường.................................. 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 49 Kết luận ................................................................................................ 49 Kiến nghị................................................................................................. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT CT Công thức FT Fourier Transform Biến đổi Fourier NIR Near Infrared Hồng ngoại gần IR Infrared Hồng ngoại S/N Signal-to-noise Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu UV-VIS Ultraviolet–visible Tử ngoại-khả kiến TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Nội dung 1 Bảng 1.1 2 Bảng 1.2 3 Bảng 1.3 Tỉ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009-2013 4 4 Bảng 3.1 Công thức bào chế viên nén Isoniazid 21 5 Bảng 3.2 Công thức bào chế viên nang Isoniazid 23 6 Bảng 3.3 Công thức bào chế viên nén Ethambutol 24 7 Bảng 3.4 Công thức bào chế viên nang Ethambutol 26 8 Bảng 3.5 9 Bảng 3.6 10 Bảng 3.7 11 Bảng 3.8 Tỉ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013 Tỉ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng từ năm 2009-2013 Tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ chuẩn Isoniazid Các đỉnh đặc trưng của viên chứa hoạt chất Isoniazid thực chế tạo Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa Isoniazid Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ các thuốc chứa Isoniazid Trang 3 3 32 33 34 34 Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh 12 Bảng 3.9 đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa 50% 36 Isoniazid 13 Bảng 3.10 14 Bảng 3.11 15 Bảng 3.12 Tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ chuẩn Ethambutol Các đỉnh đặc trưng của các viên chứa hoạt chất Ethambutol thực chế tạo. Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa Ethambutol 41 42 43 Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh 16 Bảng 3.13 đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa 50% 44 Ethambutol 17 Bảng 3.14 Bảng kết quả đo phổ Raman của chế phẩm khảo sát có 47 chứa Isoniazid so với thư viện phổ đã thiết lập. 18 Bảng 3.15 Bảng kết quả đo phổ Raman của chế phẩm khảo sát có chứa Ethambutol so với thư viện phổ đã thiết lập 48 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình Nội dung 1 Hình 1.1. 2 Hình 1.2 3 Hình 1.3 4 Hình 2.1 5 Hình 3.1 Phổ Raman chuẩn của Isoniazid 28 6 Hình 3.2 Phổ Raman của viên nang placebo Isoniazid CT4 28 7 Hình 3.3 Phổ Raman của viên nang placebo Isoniazid CT2 29 8 Hình 3.4 Phổ Raman của viên nén placebo Isoniazid CT1 29 9 Hình 3.5 Phổ Raman của viên nén placebo Isoniazid CT3 30 10 Hình 3.6 Phổ Raman của viên nang Isoniazid CT4 30 11 Hình 3.7 Phổ Raman của viên nang Isoniazid CT2 31 12 Hình 3.8 Phổ Raman của viên nén Isoniazid CT1 31 13 Hình 3.9 Phổ Raman của viên nén Isoniazid CT3 32 14 Hình 3.10 Phổ Raman của viên nang chứa 50% Isoniazid CT4 35 15 Hình 3.11 Phổ Raman của viên nén chứa 50% Isoniazid CT1 35 16 Hình 3.12 Phổ Raman chuẩn của Ethambutol 37 17 Hình 3.13 Phổ Raman của viên nén placebo Ethambutol CT1 37 18 Hình 3.14 Phổ Raman của viên nén placebo Ethambutol CT2 38 19 Hình 3.15 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT3 38 20 Hình 3.16 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT4 39 21 Hình 3.17 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT1 39 22 Hình 3.18 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT2 40 23 Hình 3.19 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT3 40 24 Hình 3.20 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT4 41 25 Hình 3.21 Phổ Raman của viên nang chứa 50% Ethambutol CT3 43 Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes m, n, r: các mức năng lượng Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng Renishaw Trang 10 11 12 18 26 Hình 3.22 27 Hình 3.23 28 Hình 3.24 29 Hình 3.25 Phổ Raman của viên nén chứa 50% Ethambutol CT1 Hình ảnh chồng phổ của nguyên liệu Isoniazid với phổ chuẩn Hình ảnh chồng phổ của nguyên liệu Ethambutol với phổ chuẩn Phổ Raman của một số chế phẩm khảo sát 44 46 46 48 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc giả, thuốc kém chất lượng đang là một vấn đề lớn trong xã hội, nó không chỉ gây thiệt hại về kinh tế, gây khó khăn cho ngành công nghiệp dược mà nguy hiểm hơn, nó còn là mối hiểm họa với nhiều người bệnh. Thuốc giả không chỉ làm kéo dài quá trình điều trị, gây biến chứng mà còn gây tử vong. Thuốc giả phong phú về chủng loại, đa dạng về nguồn gốc xuất xứ, chúng ngày càng được sản xuất tinh vi hơn, trà trộn vào từng cửa hàng, hiệu thuốc, và những năm gần đây, thuốc giả còn đi vào cả bệnh viện thông qua đấu thầu. Nhiều trường hợp, thuốc giả đã đến tay bệnh nhân hoặc thậm chí được bán hết rồi mới có quyết định thu hồi, đình chỉ. Việc ngăn ngừa và bài trừ thuốc giả đang là một vấn đề cấp bách với cơ quan chức năng. Vì tình hình thuốc giả ngày càng diễn biến phức tạp, số lượng thuốc trên thị trường ngày càng lớn, các phương pháp phân tích truyền thống thì cho kết quả chính xác nhưng tốn rất nhiều thời gian.... Có một phương pháp phân tích quang phổ trong ngành Dược còn khá mới mẻ là phương pháp phổ Raman. Quang phổ Raman được ra đời từ những năm 30 của thế kỷ trước nhưng do hạn chế về khoa học kỹ thuật nên nó còn phát triển khá chậm. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ về công nghệ laser, phổ Raman ngày càng phát triển và có rất nhiều ưu thế, đặc biệt được ứng dụng vào việc phát hiện nhanh thuốc giả trong ngành Dược. Với ưu điểm nổi bật là phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng, phổ Raman đang được khai thác và đưa vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, một trong số đó là công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc với độ tin cậy, chính xác cao. Isoniazid và Ethambutol là các thuốc chống lao thiết yếu. Chương trình chống lao Việt Nam luôn cung cấp đầy đủ, liên tục thuốc chống lao có chất lượng. Tuy nhiên các thuốc này dễ bị làm giả vì tung ra thị trường dễ tiêu thụ. 2 Mặt khác số lượng các thuốc này lớn nên dễ trà trộn vào thị trường mà cơ quan quản lý khó kiểm soát được hết. Vì vậy rất cần các biện pháp phát hiện nhanh để kiểm soát chất lượng thuốc, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị, nâng cao sức khỏe cộng đồng. Nhằm nâng cao chất lượng thuốc chống lao, nhóm nghiên cứu chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp phân tích phát hiện nhanh thuốc giả bằng phổ Raman” với 2 mục tiêu: 1. Xây dựng bộ dịch chuyển Raman cơ bản của 2 hoạt chất Isoniazid và Ethambutol. 2. Xác định khoảng dao động về vị trí và cường độ của các giá trị dịch chuyển Raman dưới ảnh hưởng của một số tá dược thường dùng trong viên nén và viên nang để xây dựng quy trình định tính các viên nén có hoạt chất trên. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về thuốc giả Tại điều 2 chương 1 của Luật Dược- năm 2005, quy định rõ: Thuốc kém chất lượng là thuốc không đạt tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký với cơ quan có thẩm quyền. Thuốc giả là sản phẩm được sản xuất dưới dạng thuốc với ý đồ lừa đảo, thuộc một trong những trường hợp sau đây: a) Không có dược chất; b) Có dược chất nhưng không đúng hàm lượng đã đăng ký; c) Có dược chất khác với dược chất ghi trên nhãn; d) Mạo tên, kiểu dáng công nghiệp của thuốc đã đăng ký bảo hộ sở hữu công nghiệp của cơ sở sản xuất khác.[6] Ở Việt Nam, tỉ lệ thuốc kém chất lượng chiếm khoảng 2,5% - 3,3%. Năm 2013, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tiến hành lấy 39853 mẫu lấy và phát hiện 1004 mẫu lấy không đạt chất lượng (chiếm 2,52%, thấp hơn năm 2012 là 0,57%), trong đó có 186 thuốc nhập khẩu và 762 thuốc sản xuất trong nước. Bảng 1.1: Tỉ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013 Năm 2009 2010 2011 2012 2013 Tỉ lệ (%) 3,33% 3,12% 2,81% 3,09% 2,52% Nếu tính riêng cho thuốc đông dược, dược liệu thì tỉ lệ này cao hơn nhiều (6,09% - 9,6%). Bảng 1.2: Tỉ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng từ năm 2009 – 2013 Năm Số mẫu lấy Số mẫu không đạt Tỉ lệ mẫu không đạt 2009 5672 518 9,13% 2010 6511 625 9,60% 2011 5801 353 6,09% 2012 6345 524 8,26% 4 2013 8040 576 7,16% Số lượng mẫu giả được phát hiện trong năm 2013 là 8 mẫu, chiếm 0,02% mẫu lấy kiểm tra chất lượng. Bảng 1.3: Tỉ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009 - 2013 Năm 2009 2010 2011 2012 2013 Tỉ lệ (%) 0,12% 0,08% 0,09% 0,10% 0,02% Các loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng phần nhiều là thuốc tân dược như: thuốc điều trị sốt rét, thuốc chống lao, thuốc tránh thai hỗn hợp, thuốc chống cúm H5N1, thuốc kháng virus viêm gan và thuốc AIDS; một số thuốc thông thường, tiêu thụ nhiều như: hạ nhiệt giảm đau, kháng sinh … Đặc biệt gần đây, thuốc đông y vốn là lĩnh vực được coi là an toàn cũng đã có dấu hiệu bị làm giả. Việc trộn các thuốc tân dược vào đông dược để tăng tác dụng tức thì của thuốc đông dược. Nếu thuốc đông dược thành phần có trộn hoạt chất hoá dược (tân dược) nhưng không công bố trên nhãn hoặc tân dược mà ghi nhãn là thuốc đông dược, thực chất là thuốc tân dược thì được coi là thuốc giả. Đây không chỉ là vấn đề riêng của nước ta mà các nước trên thế giới cũng rất quan tâm. Trong những năm gần đây, ở nước ta, cùng với sự phối hợp của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã phát hiện nhiều loại thuốc này. Trong số đó, bao gồm cả thuốc có hoặc không có nguồn gốc, thuốc sản xuất trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là chưa được cấp số đăng ký. Các thuốc này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi: ví dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc,… Điển hình, năm 2010, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phát hiện chế phẩm đông dược “Viên Bổ Thận Hà Thành”, là thực phẩm chức năng, 5 dung để bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lý, có trộn trái phép Isoniazid (một chất ức chế men PDE-5, có tác dụng cương dương) có hàm lượng lên tới 98mg/viên. Năm 2011, phát hiện thấy trộn trái phép Sibutramin trong một số thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm béo như Lishou, Juji hay phát hiện Dexamethason trong bài thuốc gia truyền bổ tỳ chữa chứng biếng ăn, còi xương cho trẻ em. Tháng 3 năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW phối hợp với Quản lý thị trường đã phát hiện thuốc Zinnat giả và gần đây nhất tháng 4 năm 2012, Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm - Thực phẩm Hưng Yên đã phát hiện thuốc tiêm Voltarén® 75mg giả. 1.2. Tổng quan về Isoniazid và Ethambutol 1.2.1. Danh pháp [3] Isoniazid Tên khoa học: pyridine-4-carbohydrazide Công thức: C6H7N3O Khối lượng phân tử: 137,1 Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hay tinh thể không màu, không mùi. Dễ tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, khó tan trong chloroform, rất khó tan trong ether. 6 Ethambutol hydroclorid Tên khoa học: (2S,2’S)-2,2’- (ethylenediimino)dibutan -1-ol dihydrochloride Công thức: C10H26Cl2N2O2 Khối lượng phân tử: 277,2 Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96%. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 2020C. 1.2.2. Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol [3], [4] 1.2.2.1. Định tính Isoniazid Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: B và C. Nhóm II: A và C. A. Phổ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của isoniazid chuẩn hoặc phổ hồng ngoại đối chiếu của isoniazid chuẩn. B. Hòa tan 0,1g chế phẩm trong 2 ml nước, thêm dung dịch nóng của 0,1g vanilin (TT) trong 10 ml nước, để yên và cọ thành ống nghiệm bằng một đũa thủy tinh, sẽ có tủa vàng, tủa này sau khi kết tinh lại bằng 5 ml ethanol 70% và sấy khô ở 100 – 105oC, có điểm chảy từ 226 – 231oC. C. Điểm chảy: 170 – 174oC (Phụ lục 6.7). 1.2.2.1. Định tính Ethambutol Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A và D. Nhóm II: B, C, D. 7 A. Phổ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của Ethambutol hydroclorid chuẩn hoặc phổ hồng ngoại đối chiếu của Ethambutol hydroclorid chuẩn. B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp với vết chính của dung dịch đối chiếu về vị trí, màu sắc và kích thước. C. Hòa tan 0,1g chế phẩm trong 10ml nước, thêm 0,2ml dung dịch đồng (II) sulfat 12,5 % (TT). Thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd 2M (TT), dung dịch có màu xanh da trời. D. Chế phẩm cho phản ứng định tính (A) của ion clorid (phụ lục 8.1) Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol hydroclorid ở trên là các phương pháp dùng các phản ứng hóa học và phương pháp sắc ký lớp mỏng phải sử dụng nhiều dung môi, thuốc thử vừa tốn nhiều thời gian, vừa độc hại. Ngoài ra phương pháp thường được sử dụng rộng rãi để định tính là phương pháp phổ hồng ngoại. Phương pháp phổ hồng ngoại rất nhạy với các chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí vì thế không thể đo phổ hồng ngoại trong dung dịch nước. Mặt khác, khi đo phổ hồng ngoại của một hoạt chất trong viên thì phải chuẩn bị mẫu rất phức tạp như hòa tan, lọc, chiết, tách, bốc hơi đến khô,...chứ không thể đo trực tiếp phổ hồng ngoại trên nền tá dược. Phương pháp phổ Raman là một phương pháp phân tích hiện đại và mới bắt đầu được triển khai để ứng dụng trong Dược và phương pháp này đã khắc phục được hạn chế của các phương pháp trên và có nhiều ưu điểm vượt trội.[5] 1.3. Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman 1.3.1. Lịch sử phát triển. [11], [18] Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ, 8 “detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông, hiệu ứng Raman. Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm 1930. [11] Theo thời gian, những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị đo đạc tán xạ Raman đã diễn ra. Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung vào sự phát triển nguồn ánh sáng kích thích. Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau đã được phát triển (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường độ ánh sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu. Nhiều năm sau đó, người ta nghiên cứu áp dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn không mang lại hiệu quả như mong muốn. Cho tới tận năm 1962, đã có bước ngoặt lớn trong công nghệ Raman, đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn kích thích cho tán xạ Raman. Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó chủ yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar+ (351,1-514,5nm), Kr+ (337,4-674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser IR và NIR được đưa vào sử dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác động mạnh đến việc thu phổ Raman).[18] Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển tương đối chậm. Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hệ thống quang học. Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát hiện Raman. Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, không hội tụ, muốn ghi được chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một thời gian dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu. Vậy nên, mặc dù bản chất là một phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng một vài trường hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá hủy mẫu chất.[18] 9 Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ Raman. Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi hơn. Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát tại thực địa các mẫu cần phân tích.[18] 1.3.2. Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman [11], [18] Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ ánh sáng, quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ. Tán xạ này xảy ra do va chạm giữa các photon và các phân tử. Ánh sáng tới với tần số 0 trên một phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h 0. Ví dụ nguồn laser có bước sóng 500nm và công suất 1W chứa khoảng 2.5x1018 photon trong một giây. Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử. Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là tán xạ Rayleigh. Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số với ánh sáng tới. Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử và trao đổi năng lượng sau va chạm. Nếu phân tử nhận năng lượng h từ photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h( của photon tán xạ khi đó là 0– 0 – ) , và tần số . Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng h từ phân tử, các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h( và tần số của photon tán xạ là 0 0 + ) + . Tán xạ mà có sự trao đổi năng lượng 10 của photon với một phân tử như trên được gọi là tán xạ Raman. Và các tán xạ có tần số 0– và có tần số 0+ được gọi tương ứng là “ tán xạ Stokes ” và “ tán xạ đối Stokes ”. [18], [11] Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu hoặc phát xạ.  Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên tử.  Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết trong phân tử. Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman ta khảo sát sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử. Quá trình trao đổi năng lượng