Tài liệu Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang

Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ DIỆP THANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ DIỆP THANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI – 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn. Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ môn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay. Chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Trịnh Thị Diệp Thanh Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................2 1.1. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN .............. 2 1.1.1. Saponin ..............................................................................................................2 1.1.2. Saponin nhân Dammaran ..................................................................................2 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM ...................................................................................................... 6 1.2.1. Chi Gynostemma Blume ...................................................................................6 1.2.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM ....................... 7 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN ................................................................................................................... 9 1.3.1. Chiết xuất .........................................................................................................9 1.3.2. Tinh chế .............................................................................................................9 1.3.3. Định lượng ......................................................................................................10 1.4. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) ........ 11 1.4.1. Phổ hấp thụ UV-VIS.......................................................................................11 1.4.2. Định luật Lambert – Beer................................................................................11 1.4.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần .................................................................................................................13 1.5. TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ ............................................................... 15 1.5.1. Định nghĩa và phân loại ..................................................................................15 1.5.2. Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin .......................................................15 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................................17 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT .............................................. 17 2.1.1. Nguyên liệu .....................................................................................................17 2.2.2. Dụng cụ thiết bị ...............................................................................................17 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................18 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 18 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 18 2.3.1. Chiết xuất ........................................................................................................18 2.3.2. Tinh chế ...........................................................................................................22 2.3.3. Định lượng bằng phương pháp đo quang ........................................................22 2.3.4. Thẩm định và đánh giá phương pháp ..............................................................24 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................................25 2.3.6. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam. .................................................................................27 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ .............................................................28 3.1. KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ MẪU ............. 28 3.1.1. Khảo sát phương pháp chiết xuất ....................................................................28 3.1.2. Khảo sát phương pháp tinh chế .......................................................................29 3.1.3. Quy trình xử lí mẫu .........................................................................................30 3.3. KHẢO SÁT CỰC ĐẠI HẤP THỤ QUANG VÀ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG .. 31 3.3.1. Khảo sát cực đại hấp thụ quang ......................................................................31 3.3.2. Khảo sát điều kiện phản ứng ...........................................................................32 3.4. THẨM ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP UV-VIS KHI ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM. ............................... 36 3.4.1. Thẩm định phương pháp .................................................................................36 3.4.2. Đánh giá phương pháp. ...................................................................................41 3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VỪA XÂY DỰNG VÀO ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU GIẢO CỔ LAM ..............................................................................42 3.5.1. Quy trình định lượng .......................................................................................42 3.5.2. Xây dựng công thức tính hàm lượng saponin toàn phần trong GCL ..............44 3.5.3. Kết quả ............................................................................................................44 3.6. BÀN LUẬN ....................................................................................................... 45 3.6.1. Về phương pháp chiết xuất và tinh chế mẫu ...................................................45 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3.6.2. Về khảo sát điều kiện đo quang ......................................................................45 3.6.3. Về thẩm định phương pháp định lượng...........................................................45 3.6.5.Về kết quả định lượng saponin trong các mẫu Giảo cổ lam ............................47 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...............................................................48 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 48 4.2. ĐỀ XUẤT .......................................................................................................... 49 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C chuẩn, Cthử : Nồng độ của chất chuẩn, chất thử D : Mật độ quang ELSD : Detector tán xạ bay hơi (Evaporative light scattering detector) ESI : Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization) EtOH : Ethanol G. : Gynostemma GCL : Giảo cổ lam HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH : Methanol RI : Chỉ số khúc xạ (Refractive Index) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD : Độ lệch chuẩn(Standard Deviation) SKLM : Sắc kí lớp mỏng STT : Số thứ tự TT : Thuốc thử tt/tt : Thể tích/thể tích UV – VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) V : Thể tích Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC BẢNG BIỂU STT 1 2 Tên bảng biểu Bảng 1.1. Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G. pentaphyllum Bảng 3.1. Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ GCL bằng các phương pháp và dung môi chiết khác nhau Trang 4 28 3 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi rửa giải 29 4 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng 33 5 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 33 6 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 34 7 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric 35 8 Bảng 3.7. Kết quả xây dựng đường chuẩn 37 9 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 38 10 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 40 11 12 Bảng 3.10. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong GCL bằng phương pháp cân và phương pháp UV-VIS Bảng 3.11. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong các mẫu Giảo cổ lam 41 44 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT 1 Hình 1.1. Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic Trang 3 2 Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum 4 3 Hình 1.3. Các cấu trúc nhóm R7 4 4 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Ginsenoside Rb1 5 5 Hình 1.5. Ảnh của cây Giảo cổ lam 7 6 Hình 1.6. Kĩ thuật thêm đường chuẩn 14 7 Hình 2.1. Bộ dụng cụ chiết soxhlet 19 8 Hình 2.2. Bộ dụng cụ chiết hồi lưu 20 9 Hình 2.3. Máy chiết siêu âm 20 10 11 Hình 2.4. Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp cân bằng các phương pháp chiết và dung môi khác nhau Hình 3.1. Quy trình tinh chế saponin bằng chiết lỏng-rắn và chiết lỏng-lỏng 21 31 12 Hình 3.2. Phổ hấp thụ của sản phẩm phản ứng 32 13 Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 33 14 Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng 34 15 Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử Vanilin 35 16 Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric 36 17 18 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước sóng 550nm Hình 3.8. Đồ thị xác định hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu GCL theo kỹ thuật thêm đường chuẩn 37 39 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Giảo cổ lam là một vị thuốc quý được người dân ở nhiều nước châu Á sử dụng từ lâu đời nhằm tăng cường sức khỏe và tuổi thọ. Nhiều báo cáo khoa học chứng minh một số tác dụng sinh học của Giảo cổ lam như: hạ đường huyết, giảm cholesterol, giảm triacylglycerol máu …, trong đó saponin được cho là thành phần tạo nên các tác dụng sinh học này. Trên thị trường Việt nam hiện nay xuất hiện rất nhiều chế phẩm Giảo cổ lam dưới dạng trà và được người dân sử dụng rộng rãi. Vì vậy việc quản lí chất lượng dược liệu là một vấn đề cần được chú trọng để đảm bảo chất lượng của các sản phẩm cũng như việc sử dụng thuốc trong dân gian có hiệu quả. Tuy nhiên Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận về dược liệu Giảo cổ lam nên quá trình đánh giá còn gặp nhiều khó khăn. Với mục đích xác định hàm lượng saponin trong Giảo cổ lam, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng saponin trong các chế phẩm Giảo cổ lam đang được sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện thực tế nơi làm việc, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang” với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu Giảo cổ lam. 2. Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang. 3. Thẩm định phương pháp xây dựng được và ứng dụng để định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam. Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN 1.1.1. Saponin [15] • Định nghĩa Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao. • Phân loại, cấu trúc hóa học. - Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia thành saponin triterpenoid và saponin steroid. - Saponin triterpenoid có loại trung tính và loại acid, saponin steroid có loại trung tính và loại kiềm. - Saponin triterpenoid có phần genin gồm 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpene, chia làm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic. + Saponin triterpenoid pentacyclic: gồm 4 nhóm là olean, ursan, lupan hopan. +Saponin triterpenoid tetracyclic: gồm 3 nhóm là dammaran, lanostan và cucurbitan. - Saponin steroid được chia thành 5 nhóm: nhóm spirostan, nhóm furostan, nhóm aminofurostan, nhóm spirosolan và nhóm solanidan. 1.1.2. Saponin nhân Dammaran Theo các nghiên cứu [24], [27], [32] saponin là một trong những nhóm chất chính của các loài trong chi Gynostemma, trong đó chủ yếu là các saponin thuộc nhóm Dammaran. Do đó, chúng tôi tổng quan sâu hơn về nhóm cấu trúc này. Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic). Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi. Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax, họ Araliaceae. Đặc biệt saponin trong nhân sâm (Panax ginseng) có nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3 22 21 20 12 13 19 11 18 1 2 9 10 3 28 5 4 6 24 23 17 26 25 27 16 14 15 8 7 30 29 Hình 1.1. Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic • Tác dụng sinh học của các saponin nhân Dammaran Có rất nhiều các nghiên cứu về tác dụng của triterpenoid dammaran trong nhân sâm và các loài thuộc chi Gynostemma, trong đó nổi bật là các tác dụng - Chống mệt mỏi và tăng sức đề kháng: các saponin triterpenoid tetracyclic nhóm dammaran của nhâm sâm có tác dụng cải thiện rõ rệt tinh thần cũng như thể chất, tác dụng kéo dài thời gian sống trên động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh cũng đã được chứng minh. - Tác dụng hạ cholesterol đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm. - Tác dụng hạ đường huyết do các saponin này có khả năng chuyển glucose thành glycogen và ngăn ngừa hiện tượng giảm glycogen. • Các saponin trong chi Gynostemma Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran. Đã có trên 100 saponin trong thành phần G. pentaphyllum được phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng là Rb1 (Gypenosid III) [24], [32], Rc [27], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [27], Rg3 [29], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [24]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [27]. Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ Araliaceae. Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gymnema sylvestra [35]. Các saponin còn lại chiếm phần lớn các Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 4 gypenosid được phát hiện lần đầu ở loài G. pentaphyllum. Cấu trúc một số saponin trong G. pentaphyllum được trình bày ở hình 1.2, hình 1.3 và bảng 1.1. R6 R4 20 R5 18 R7 17 b CH2OH OH c OH R3 R2 1 OOH 9 30 R1 a O e d f O 28 OCH3 29 Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G.pentaphyllum g OH CH2O Glu h O Rha i Hình 1.3. Các cấu trúc nhóm R7 Bảng 1.1. Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G. pentaphyllum Nhóm thế R2 R3 R4 R5 R6 R7 Một số saponin tương ứng -H Gypenosid I, Rb1 - OH Gynos TN1, Gynos TN2 - CH3 hoặc - CH2OH Gypenosid I, Rb1 - CHO Gylongiposid I - OH Rb1 -H Gylongiposid I =O Gypentonosid A - OH Rg3, Rf - đường đôi Rb1, gymnemasid II - CH3 hoặc - CH2OH - CH2O -glu hoặc CH2O –xyl Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i Rb1 Các ginsenoid đều có cấu trúc a Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 5 Loại đường chính trong saponin của GCL (hầu hết thuộc dạng pyranose) là βD-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, α-L-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20. Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -CH3, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3). Nhóm –OH cũng có ở vị trí C-2(α) và C-12(β). Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vi trí C-17 cũng được phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [26]. Các saponin trong GCL đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [28] và gynosaponin TN1 [30]. • Saponin Ginsenoside Rb1 - Tên IUPAC: (20S)-3β-[(2-O-β-d-Glucopyranosyl-β-d- glucopyranosyl)oxy]20-[(6-O-β-d-glucopyranosyl-β-d- glucopyranosyl)oxy]-5α-dammar-24-en-12β-ol. OH HO OH HO O HO O HO HO HO O HO - Độ tan: tan tốt trong MeOH, EtOH, H O O H2O. - Tác dụng dược lý: tác dụng an thần, O HO - Trọng lượng phân tử: 1109.29448 (g/mol). O HO HO O H OH - Công thức phân tử: C54H92O23 H OH OH tốt cho đường tiêu hóa, tăng sức chịu đựng, bảo vệ gan và là chất chống oxy hóa, chống mệt mỏi, chống co giật, giảm đau và chống loét [17]. Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Rb1 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 1.2.1. Chi Gynostemma Blume • Vị trí phân loại chi Gynostemma Theo các tài liệu [10], [13], chi Gynostemma được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ bầu bí). Vị trí của chi Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dược: Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Sổ Dilleniidae Liên bộ Hoa tím Violanae Bộ Bí Cucurbitales Họ Bầu bí Cucurbitaceae Chi Gynostemma • Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Chi Gynostemma được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc điểm hình thái của loài G. simplicifolium [34]. Từ đó đến nay, đã có thêm nhiều loài được mô tả. Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung [10], [34]: Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía răng cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con; cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn. Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột. Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô. Bầu hình cầu nhỏ, 2-3 ngăn, 2-3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2-3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi. Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Loài G. pentaphyllum là loài phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [34]. Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 7 • Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam Ở Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ [5], [10], chi Gynostemma có 2 loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino và G. laxum (Wall.) Cogn. Năm 2009 Ths. Hoàng Văn Lâm đã công bố thêm 1 loài mới thuộc chi Gynostemma, bổ sung vào hệ thực vật Việt Nam là G. longipes C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Chen [22]. Tính đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố ở Việt Nam. 1.2.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM • Đặc điểm thực vật. Cây thảo mọc leo, yếu, thân cành mảnh, có góc cạnh không lông hoặc có lông thưa thớt ở mấu. Lá kép chân vịt, cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7 lá chét với mép có răng. Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh. Cụm hoa đực Hình 1.5. Ảnh cây Giảo cổ lam dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh, phân nhánh nhiều, cỡ 10-15cm. Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, đỉnh nhọn, tràng màu xanh nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác cỡ 2,5-3 × 1mm, đỉnh nhọn có 1 gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực. Hoa cái có đài và tràng giống như hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, núm nhụy có 2 thùy. Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5-6 mm, khi chín màu đen, 2 hạt. Hạt hình trứng hoặc hình tim, màu nâu, đỉnh tù gốc hình tim dẹt [5], [6], [7]. • Phân bố, thu hái Tại Việt Nam cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000m, ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Đà Lạt, Đắc Nông, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Nai [5], [6]. Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 8 • Thành phần hóa học Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong cây có chứa saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử [4], [9], [11], [14], [20]. Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định được trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: Al, Si, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag. Trong đó, nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0.0001%) [7]. • Tác dụng dược lý Trên thế giới loài G. pentaphyllum đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh học, trong đó [19]: - Tác dụng hạ cholesterol: các gypenosid trong G. pentaphyllum làm giảm cholesterol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) và rất thấp (VLDL), làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao (HDL) và tỉ lệ HDL/LDL. - Trên đường huyết: các dịch chiết gypenosid với liều uống 100 và 200 mg/kg thể trọng chuột trong 2 tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose (2g/kg). - Tác dụng trên tim mạch: gypenosid (nồng độ 50, 100 và 200 µg/ml) có tác dụng bảo vệ cơ tim bằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và oxygen, ức chế giải phóng men creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase (LDH). - Tác dụng lên hệ miễn dịch: gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300 mg/kg thể trọng trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh, giảm lượng kháng thể tiêu huyết. Lượng IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim. - Tác dụng chữa khối u: tác dụng này do một vài saponin có trong G. pentaphyllum. Khi dùng gypenosid liều 30mg/kg và 300mg/kg qua dạ dày hoặc 120mg/kg tiêm phúc mạc theo dõi trong 10 ngày nhận thấy tác dụng cản trở quá trình gây u sarcoma (S180) ở chuột nhắt. - Cao G. pentaphyllum (450 mg/kg) ức chế những hoạt động tự phát của chuột nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột đang ở trên tấm kim loại nóng. Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 9 Các nghiên cứu về loài G. pentaphyllum ở Việt Nam cho thấy dược liệu GCL có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống khối u và tăng đáp ứng miễn dịch [2], [7], [8], [11], [12]. 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN 1.3.1. Chiết xuất [15] - Saponin loại trung tính và acid: bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, chiết saponin bằng methanol-nước (4:1). Loại methanol dưới áp suất giảm. Hoà cặn trong nước được dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp nbutanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm rồi hoà cặn với methanol để chấm sắc ký. Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng lớn gấp 10-15 lần (có thể dùng aceton hoặc n-hexan thay ether). - Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bột dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy. Dịch lọc đem bốc hơi đến khô. Cắn được hoà tan trong acid acetic 5%, đun nóng đến 800C rồi kiềm hoá bằng amoniac. Tủa được ly tâm rồi hoà tan vào ethanol 96% để chấm sắc ký. 1.3.2. Tinh chế [15] Ðể tinh chế, có thể thực hiện với các phương pháp sau: - Thẩm tích. - Dùng bột MgO hoặc bột polyamid để tách saponin ra khỏi tanin: hòa saponin vào nước, trộn với bột polyamid hoặc bột MgO trên nồi cách thủy 10 phút để có khối nhão, chiết saponin từ khối nhão này bằng ethanol 80% nóng. Lọc rồi bốc hơi. - Dùng Sephadex loại G-25, G-50, G-75: lượng Sephadex dùng gấp 50 lần saponin, đem ngâm nước cất cho trương lên, gạn lượng nước thừa, cho gel vào cột sắc ký. Dung dịch đậm đặc saponin trong nước cho lên phần trên cột rồi khai triển bằng nước cất. Saponin có phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trước saponin có phân tử nhỏ. - Saponin steroid có thể tinh chế bằng cách kết hợp với cholesterol: 1g saponin hoà trong 200ml ethanol đun nóng đến 50-600C rồi cho tác dụng với một dung dịch Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 10 chứa 2g cholesterol trong 200ml ethanol đã đun nóng, tủa phức sẽ tạo thành. Lọc tủa, sấy khô, phá phức bằng cách hoà tan trong pyridin. Saponin tinh khiết được tủa trong ether. Hoà tan trong methanol để loại hết cholesterol rồi lại tủa với ether. 1.3.3. Định lượng [15]. • Phương pháp cân Bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, sau đó chiết saponin bằng MeOH:H2O = 4:1. Loại MeOH dưới áp suất giảm. Hòa cặn trong nước để có dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp n-butanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, để trong bình hút ẩm, cân đến khi khối lượng không đổi. Thực hiện thao tác chiết, cân, lấy trung bình 3 lần và suy ra lượng saponin thô toàn phần trong dược liệu. Công thức: Hàm lượng saponin toàn phần Cân cắn và tính hàm lượng các cắn theo công thức: S= a × 100% M × (1 − x) Trong đó S: hàm lượng saponin (%) a: khối lượng saponin toàn phần (g) M: khối lượng dược liệu (g) • Phương pháp HPLC Đây là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính, định lượng các chất nói chung và saponin nói riêng. - Pha tĩnh cho HPLC dùng kiểm nghiệm các saponin thường là pha đảo RP-18. Pha tĩnh theo cơ chế rây phân tử cũng có thể được dùng. - Hệ dung môi được sử dụng trong HPLC là hỗn hợp nước-methanolacetonitril với các tỉ lệ khác nhau, có hay không có dung dịch đệm. Chương trình dung môi có thể là isocratic hoặc gradient. Detector dùng để phát hiện gồm xác định chỉ số khúc xạ (RI) hay tán xạ bay hơi (ELSD). Detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khối phổ (MS hay Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 11 MS/MS với kĩ thuật ion hóa ESI hay APCI). Do các saponin ít có các nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 195-210 nm, do đó việc sử dụng detector UV tương đối hạn chế trong phân tích saponin. 1.4. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 1.4.1. Phổ hấp thụ UV-VIS [1] Khi tia bức xạ tương tác với vật chất có thể xảy ra một số quá trình: phản xạ, tán xạ, hấp thụ, huỳnh quang và quang hóa. Khi đo quang phổ tử ngoại khả kiến, người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra. Vì bức xạ điện từ là các hạt mang năng lượng nên khi phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ electron của phân tử và làm tăng nội năng của nó. Năng lượng tổng của một phân tử bao gồm: năng lượng chuyển động tịnh tiến của phân tử (Et), năng lượng của điện tử (Ee), năng lượng của các dao động (Ev) và năng lượng của chuyển động quay (Er). Etổng = Et + Ee + Ev + Er (Ee >> Ev >> Er) Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại-khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng điện tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS. Do đó phổ UV-VIS được gọi là phổ điện tử. 1.4.2. Định luật Lambert – Beer [1]. Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là L. Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng sẽ bị hấp thụ lại, một phần bị phản xạ, phần còn lại sẽ đi qua dung dịch với cường độ I . Mối quan hệ giữa phần ánh sáng I và thể hiện bằng định luật Lambert - Beer Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch. * Điều kiện ứng dụng của định luật. - Chùm tia sáng phải đơn sắc. - Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp).