Tài liệu Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao giảo cổ lam 7 lá ( Gynostemma longipes)

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ---------- LÊ MAI PHƢƠNG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO GIẢO CỔ LAM 7 LÁ (GYNOSTEMMA LONGIPES) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ MAI PHƢƠNG XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO GIẢO CỔ LAM 7 LÁ (GYNOSTEMMA LONGIPES) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: Ths. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc liệu HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Phạm Tuấn Anh – Bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Thầy là ngƣời luôn tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi phƣơng pháp nghiên cứu khoa học, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Lê Thanh Bình, ngƣời luôn sẵn sàng giúp đỡ tôi trong quá trình tôi hoàn thành khóa luận tại bộ môn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dƣợc liệu đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khích lệ, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn nhất để tôi có thể đạt đƣợc kết quả ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lê Mai Phƣơng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI GYNOSTEMMA .................................................2 1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma.......................................................................2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma ........................................2 1.1.3. Đặc điểm một số loài trong chi Gynostemma ..................................................3 1.2. THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG CHI GYNOSTEMMA ...............................5 1.2.1. Saponin nhân Dammaran ..................................................................................5 1.2.2. Saponin trong chi Gynostemma ........................................................................6 1.2.3. Tác dụng sinh học .............................................................................................8 1.3. T NG QU N VỀ C O THU C .....................................................................12 1.3.1. Khái niệm ........................................................................................................12 1.3.2. Yêu cầu tiêu chuẩn chất lƣợng cao thuốc .......................................................13 CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................13 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT ..............................................13 2.1.1. Nguyên liệu .....................................................................................................13 2.1.2. Thiết bị và hóa chất .........................................................................................14 2.1.3. Động vật thí nghiệm ........................................................................................15 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................15 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................15 2.3.1. Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá ...........................15 2.3.2. Kiểm tra các chỉ tiêu của cao Gypenosid GCL 7 lá ........................................17 2.3.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan. ................................18 2.3.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu [4] .........................................................................20 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................21 3.1. QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT GYPENOSID .....................................................21 3.1.1. Khảo sát phƣơng pháp chiết xuất ....................................................................21 3.1.2. Tinh chế ...........................................................................................................23 3.2. KIỂM TRA MỘT S CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM GYPENOSID ..................26 3.2.1. Mô tả ...............................................................................................................26 3.2.2. Độ ẩm ..............................................................................................................26 3.2.3. Độ đồng nhất ...................................................................................................27 3.2.4. Định tính..........................................................................................................27 3.2.5. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng .....................................................................28 3.2.6. Định lƣợng saponin toàn phần ........................................................................29 3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN VÀ CH NG OXY HÓA ..........31 3.3.1. Ảnh hƣởng của Gypenosid lên trọng lƣợng gan chuột nhắt trắng bị gây độc bằng paracetamol ......................................................................................................31 3.3.2. Ảnh hƣởng của Gypenosid lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng paracetamol .........................................................................................32 3.3.3. Ảnh hƣởng của Gypenosid lên sự thay đổi hàm lƣợng MDA dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng bị gây độc bằng paracetamol ...................................................33 3.3.4. Ảnh hƣởng của saponin giảo cổ lam lên sự thay đổi mô bệnh học gan..........34 3.4. BÀN LUẬN. ......................................................................................................34 KẾT LUẬN ...............................................................................................................37 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALAT Alanin amino transferase ASAT Aspartat amino transferase AST Ánh sáng thƣờng BuOH Butanol EtOH Ethanol G Gynostemma GCL Giảo cổ lam HDL High density lipoprotein LDL Low density lipoprotein MDA Malonyl diadehyd PAR Paracetamol RSD Độ lệch tƣơng đối SD Độ lệch chuẩn SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TBA Thiobarbituric TCA Tricloacetic TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG ảng 1.1. 3.1 3.2 3.3 TÊN BẢNG Trang Các nhóm thế và hoạt chất tƣơng ứng của các saponin trong G. pentaphyllum Hàm lƣợng saponin toàn phần thu đƣợc khi sử dụng các phƣơng pháp chiết khác nhau ết quả khảo sát dung môi rửa giải 7 22 23 Hiệu suất tinh chế theo quy trình 24 3.4 ết quả xác định độ ẩm của cao gypenosid GCL 7 lá 27 3.5 ết quả định t nh các nhóm hợp chất trong cao giảo cổ lam 28 3.6 Định lƣợng saponin toàn phần trong cao gypenosid GCL 7 lá 30 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Ảnh hƣởng của cao gypenosid GCL 7 lá lên trọng lƣợng gan chuột ị gây độc ằng paracetamol Ảnh hƣởng của saponin giảo cổ lam lên hoạt độ ST trong huyết thanh chuột gây độc ằng paracetamol Ảnh hƣởng của saponin giảo cổ lam lên hoạt độ LT trong huyết thanh chuột gây độc ằng paracetamol Ảnh hƣởng của saponin giảo cổ lam lên hàm lƣợng MDA gan chuột nhắt bị gây độc bằng paracetamol Ảnh hƣởng của saponin giảo cổ lam lên sự thay đổi mô ệnh học gan 31 32 33 33 34 DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH 1.1 TÊN HÌNH Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic TRANG 5 1.2 Cấu trúc saponin trong G.pentaphyllum 6 1.3 Các cấu trúc nhóm R7 6 2.1 2.2 3.1 Quy trình nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá trên mô hình gây tổn thƣơng gan ằng paracetamol Phản ứng tạo phức của MDA Sơ đồ quy trình chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá 19 20 25 3.2 Cao gypenosid GCL 7 lá 26 3.3 Định t nh cao gypenosid GCL ằng S LM 29 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, xu hƣớng trở về với thiên nhiên ngày càng trở nên phổ biến trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Nhiều dƣợc liệu cổ truyền đã đƣợc nghiên cứu sản xuất thành các dạng bào chế hiện đại, tiện lợi để phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho nhân dân. Giảo cổ lam từ lâu đã là một vị thuốc quý đƣợc ngƣời dân ở nhiều nƣớc châu Á trên thế giới sử dụng để nâng cao sức khỏe và tuổi thọ. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu khoa học chỉ ra những tác dụng sinh học của giảo cổ lam nhƣ tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, tác dụng hạ đƣờng huyết, tác dụng hạ cholesterol, tác dụng bảo vệ tim mạch, chống stress… [23], [28], [29], [38], [39]. Ở Việt Nam, các chế phẩm giảo cổ lam ngày càng đƣợc ngƣời dân sử dụng rộng rãi để chăm sóc sức khỏe. Những tác dụng sinh học của giảo cổ lam đƣợc cho là tác dụng của các Gypenosid (các saponin trong giảo cổ lam) [23], [27]. Nhằm mục tiêu ổn định chất lƣợng trong nghiên cứu cũng nhƣ sử dụng làm thuốc chúng tôi nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá; từ đó đánh giá tác dụng chống oxy bảo vệ gan của saponin trong giảo cổ lam 7 lá theo đề tài: “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao Giảo cổ lam 7 lá Gynostemma longipes” với 3 mục tiêu chính: - Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá. - iểm nghiệm và đƣa ra dự thảo tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá - Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa ảo vệ gan của cao gypenosid GCL 7 lá. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI GYNOSTEMMA 1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Theo các tài liệu Thực vật dƣợc và phân loại thực vật [4], Cây cỏ Việt Nam [13], chi Gynostemma đƣợc xếp vào họ Cucurbitaceae (họ bầu bí). Vị trí của chi Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dƣợc. Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Sổ Dilleniidae Liên bộ Hoa tím Violanae Bộ Bí Cucurbitales Họ Bầu bí Cucurbitaceae Chi Gynostemma 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Chi Gynostemma đƣợc mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc điểm hình thái của loài G. simplicifolium [45]. Một số đặc điểm chung của các loài thuộc chi Gynostemma [13],[45]: Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, t khi là lá đơn, lá kh a răng cƣa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con; cuống hoa có đốt. Đài hoa hình ánh xe, chia 5 thùy, ngắn. Tràng hình ánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột. Bao phấn 1 ô, nhƣng nhìn có vẻ nhƣ 2 ô. Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3 đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi. Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Loài G. 3 pentaphyllum là loài phổ biến nhất, nó phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [45]. 1.1.3. Đặc điểm một số loài trong chi Gynostemma Ở Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ [8],[13], chi Gynostemma có 2 loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino và Gynostemma laxum Wall. Cogn. Năm 2009 Ths. Hoàng Văn Lâm đã công ố thêm 1 loài mới thuộc chi Gynostemma, bổ sung vào hệ thực vật Việt Nam là Gynostemma longipes C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K[29]. T nh đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã đƣợc công bố ở Việt Nam. a) Gynostemma pentathyllum (Thunb). Makino. Tên khác: Giảo cổ lam, Thất diệp đởm, Cổ yếm. Đặc điểm thực vật: Cây thảo mọc leo yếu, thân cành mảnh, có góc cạnh không lông hoặc có lông thƣa thớt ở mấu. Lá kép chân vịt, cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7 lá chét với mép có răng dài 3-9 cm, rộng 1,5-3 cm. Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh. Cụm hoa đực dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh, phân nhánh nhiều, cỡ 1015cm. Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, tràng màu xanh nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác cỡ 2,5-3 × 1mm, đỉnh nhọn có 1 gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực. Hoa cái có đài và tràng giống nhƣ hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, núm nhụy có 2 thùy, nhị lép 5 ngắn. Quả không tự mở, hình cầu, đƣờng kính 5-6 mm, khi ch n màu đen, 2 hạt. Hạt hình trứng hoặc hình tim, đƣờng k nh 4mm, màu nâu, đỉnh tù gốc hình tim dẹt [8], [9], [10]. Tại Việt Nam cây mọc ở rừng, rừng thƣa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000 m ở nhiều nơi nhƣ Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, on Tum, Đồng Nai [8], [9]. Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong cây có chứa saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đƣờng khử [7], [12], [11], [18]. Bằng phƣơng pháp đo phổ phát xạ tia X, đã xác định đƣợc trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: l, Si, Mg, 4 P, , Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, P , g. Trong đó, nguyên tố có hàm lƣợng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0,0001%) [10]. b) Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. Tên khác: Cổ yếm lá óng, thƣ tràng thƣa. Đặc điểm thực vật: Dây leo mảnh, gióng dài 10 – 20 cm, mỏng, mép có răng cƣa nhọn, gân phụ 5 – 7 cặp, có lông mịn hoặc không lông. Cây có hoa khác gốc, chùy hoa ngắn hay dài đến 30 cm; cánh hoa rời nhau, cao 3 mm; nhị 5 đ nh liền ở chỉ nhị và bao phấn. Quả tròn, to 6 – 8 mm, hình trái xoan, hơi dẹt, dài và rộng cỡ 4 mm. Ra hoa tháng 5. Cây mọc leo ở các rừng thƣa, savan cỏ, trên đất sét hoặc trong các rừng cây bụi trên núi đá vôi [8]. Ở nƣớc ta cây mọc leo ở rừng thƣa các tỉnh Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình và Quảng Trị [3], [13]. c) Gynostemma longipes C.Y.Wu ex C.Y.Wu et S.K.Chen. Đặc điểm thực vật: Cây dây leo. Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác; mỗi gióng dài 10-20 cm, đƣờng kính 0,2 -0,3 cm, lông dày ở mấu. Lá kép chân vịt. Cuống lá dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm; gốc hình nêm; mép lá răng cƣa to có gai nhỏ ở đỉnh răng; ngọn lá nhọn thuôn dài; mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dƣới nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thƣa. Lá ên nhỏ dần. Tua cuốn mảnh, rẽ đôi muộn. Hoa đơn t nh khác gốc. Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh, dài khoảng 5-15 cm. Hoa đựa rất nhỏ, tỏa tia màu trắng. Cuống 2,3-2,5 mm. Đài 5 rời, hình tam giác, dài 0,5-0,7 mm. Tràng 5, hình tam giác, rời, dài 1,2-1,4 mm, rộng 0,8-1mm, ngọn thƣờng quăn. Nhị 5, chỉ nhị dính thành 1 cột ở trung tâm, phần trên tách 5, hình sao; bao phấn 2 ô, hƣớng ngoài. Cụm hoa cái kép 3 lần chùm, dài 10-18cm. Hoa cái, cuống dài 1,8-2,0 mm, đài và tràng giống nhƣ hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thƣờng bởi 3 lá noãn hàn liền, 2-3 vòi nhụy mập, rời, núm nhụy chia 23;bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt. Quả mọng, khi ch n màu vàng xanh, đƣờng kính 6-7 mm, cuống quả dài 8-15 mm. Hạt hình tim, rộng 3-4 mm, dài 3-4 mm, màu xám nhạt, cạnh hạt lõm vào phía trong, viền hạt có răng cƣa, 2 mặt có hoa văn dạng cục. 5 Đặc điểm sinh thái: ra hoa vào tháng 8-10, quả tháng 11-12. Bộ phận dùng: toàn cây [29]. Phân bố: Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [29] Năm 2010, trong khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học, Phan Thị Thảo nghiên cứu về G.longipes đã chứng minh loài này có chứa flavonoid, saponin, acid amin, acid hữu cơ, đƣờng khử, sterol, polysaccharid, trong đó saponin là thành phần chính và đã phân lập đƣợc một saponin mới có tên là vinagynosteside A [18]. 1.2. THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG CHI GYNOSTEMMA 1.2.1. Saponin nhân Dammaran Theo các nghiên cứu ,[28] [34],[42], saponin là một trong những nhóm chất chính của các loài Gynostemma. Cũng theo các nghiên cứu này, các saponin trong chi Gynostemma chủ yếu thuộc nhóm Dammaran. Do đó, chúng tôi tổng quan sâu hơn về nhóm cấu trúc hóa học này. Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic). Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi. Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax, họ raliaceae. Đặc biệt các saponin trong nhân sâm (Panax ginseng) cho thấy nhiều tác dụng qu đã đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. 22 21 20 12 13 19 11 18 1 2 9 10 3 28 5 4 23 17 26 25 27 16 14 15 8 6 24 7 30 29 Hình 1.1. Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic 6 1.2.2. Saponin trong chi Gynostemma Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran. Đã có trên 100 saponin trong thành phần Gynostemma pentaphyllum đƣợc phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống nhƣ loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng là Rb1 (Gypenosid III) [28], [42], Rc [36], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [36], Rg3 [38], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [28]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [36]. Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm đƣợc tìm thấy ngoài họ Araliaceae. Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gymnema sylvestra [46]. Các saponin còn lại chiếm phần lớn các gypenosid đƣợc phát hiện lần đầu ở loài G. pentaphyllum. Cấu trúc một số saponin trong G. pentaphyllum đƣợc trình bày ở hình 1.2; hình 1.3 và bảng 1.1. R6 R4 18 R3 R2 1 20 R5 R7 17 b CH2OH c OH OH OOH 9 30 R1 a O e d f O 28 29 OCH3 g Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum OH CH2O Glu h O Rha i Hình 1.3. Các cấu trúc nhóm R7 7 Bảng 1.1. Các nhóm thế và hoạt chất tƣơng ứng của các saponin trong G. pentaphyllum Nhóm thế R1 Hoạt chất Đƣờng glu, rham, xyl; có thể 1 hoặc 2, 3 đƣờng kết hợp với nhau -H Gypenosid I, Rb1 - OH Gynos TN1, Gynos TN2 - CH3 Gypenosid I, Rb1 R2 R3 R4 - CH2OH - CHO Gylongiposid I - OH Rb1 -H Gylongiposid I =O Gypentonosid A - OH R5 - đƣờng đôi; thƣờng là glu kết hợp với rha hoặc xyl Rg3, Rf Rb1, gymnemasid II - CH3 R6 - CH2OH Rb1 - CH2O -glu hoặc CH2O –xyl R7 Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i Các ginsenoid đều có cấu trúc a Loại đƣờng chính trong saponin của giảo cổ lam (hầu hết thuộc dạng pyranose là β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, α-L-arabinose nối ở vị trí C3 β và C-20. Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -CH¬3, -CHO, các alcol và ít phổ 8 biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3). Nhóm –OH cũng có ở vị trí C2 α và C-12 β . Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vi trí C-17 cũng đƣợc phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [34]. Các saponin trong giảo cổ lam đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [37]và gynosaponin TN1 [39]. 1.2.3. Tác dụng sinh học Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu khoa học về tác dụng sinh học của Gynostemma pentaphyllum. a. Tác dụng chống oxy hóa Theo Lin J.M., Lin C.C. và cộng sự, Gynostemma pentaphyllum là dƣợc liệu đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị viêm gan, chứng cao huyết áp và chống ung thƣ ở Đài Loan. Các tác giả đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm và bảo vệ tế bào gan của dịch chiết phần trên mặt đất của cây Gynostemma pentaphyllum. Kết quả cho thấy dƣợc liệu có tác dụng chống viêm mạnh hơn indomethacin. Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của tetracloruacarbon (CCl4) và acetaminophen đƣợc thể hiện rõ qua chỉ số AST (aspartate aminotransferase) và ALT (alanine aminotransferase) giảm rõ rệt sau khi dùng thuốc [33], [32]. Các Gypenoside (saponin của cây Gynostemma pentaphyllum) có tác dụng nhƣ là một chất chống oxy hoá đã đƣợc nghiên cứu bằng nhiều mô hình khác nhau để tác động oxy hoá lên các đại thực bào, các microsom gan và tế bào biểu mô nội mạch. Các tác giả cũng thấy rằng các gypenoside bảo vệ các màng sinh học khỏi các tổn thƣơng oxy hoá ằng cách làm đảo ngƣợc sự giảm chất lỏng màng của các microsom gan và các ty lạp thể mitochondria , tăng hoạt tính men của ty lạp thể trong các tế bào biểu mô nội mạch và giảm sự thất thoát của men lactate dehydrogenase nội bào từ các tế bào này. Hiệu quả chống oxy hoá rõ rệt của các 9 gypenoside có thể rất có giá trị trong điều trị và phòng ngừa nhiều bệnh nhƣ xơ vữa động mạch, bệnh gan và các triệu chứng viêm [31]. Các gypenoside chiết xuất từ Gynostemma pentaphyllum có tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của tetracloruacarbon (CCl4) [27]. Nghiên cứu khả năng chống oxy hoá của gypenosid cho thấy dịch chiết (1:1) và flavonoid toàn phần có hoạt tính chống oxy hoá khá cao, đạt 50,11% ở nồng độ dịch chiết (1:25) và 63,80% ở nồng độ 0,3mg flavonoid toàn phần [12]. b. Tác dụng hạ cholesterol Tác dụng hạ cholesterol: các gypenosid trong G. pentaphyllum gây giảm cholesterol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) và rất thấp VLDL , làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao (HDL) và tỉ lệ HDL/LDL [43]. Đã nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu của Giảo cổ lam theo phƣơng pháp gây tăng cholesterol nội sinh, với liều 5 g/kg thể trọng thỏ/ngày dùng trong 4 ngày liền đã chứng tỏ cao lỏng (1:1) có tác dụng hạ cholesterol máu, kết quả có ý nghĩa thống kê với p<0,02 so với lô chứng không điều trị [3], [14]. c. Tác dụng trên đƣờng huyết Trên đƣờng huyết: các dịch chiết gypenosid với liều uống 100 và 200 mg/kg thể trọng chuột trong 2 tháng đã ngăn chặn đƣợc bệnh tăng đƣờng huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện đƣợc khả năng dung nạp đƣờng ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose (2 g/kg) [43]. d. Tác dụng trên tim mạch Các gypenosid đã cho thấy tác dụng bảo vệ chứng loạn nhịp tim ở lợn, giảm phạm vi ảnh hƣởng của chứng nhồi máu cơ tim ở thỏ và tăng cƣờng sự lƣu thông mạch vành trên chó đã gây tê [22] Tác dụng trên tim mạch: gypenosid (nồng độ 50 µg/ml, 100 µg/ml và 200 µg/ml) có tác dụng bảo vệ cơ tim ằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và 10 oxygen đồng thời cũng ức chế việc giải phóng men creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase (LDH) [38] e. Tác dụng trên miễn dịch và ung thƣ hi gây ung thƣ iểu mô tuyến thực quản của chuột cống trƣớc hai tuần rồi cho uống dịch chiết 2% của Gynostemma pentaphyllum và theo dõi thấy số lƣợng chuột uống dịch chiết bị bệnh t hơn so với chuột không uống. Vì vậy các tác giả cho rằng Gynostemma pentaphyllum có tác dụng ngăn ngừa và chống lại ung thƣ đối với chuột cống [23]. Gynostemma pentaphyllum có tác dụng kìm hãm ung thƣ iểu bì của chuột túi vàng sau khi gây ung thƣ ằng dimethylbenzanthracene (DMBA). Các tác giả cũng nghiên cứu ảnh hƣởng của Gynostemma pentaphyllum tới gen đột biến tách từ khối tế ào ung thƣ sau khi gây ung thƣ ằng DMBA. Kết quả cho thấy Gynostemma pentaphyllum có tác dụng chống lại khối u [24]. Tác dụng lên hệ miễn dịch: gypenosid đƣa vào dạ dày chuột nhắt liều 300 mg/kg thể trọng chuột trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh và giảm lƣợng kháng thể tiêu huyết. Lƣợng IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột đƣợc ghép cơ tim [38].  Nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu khoa học về tác dụng sinh học của gypenosid trong giảo cổ lam. Đã tiến hành thử độc tính cấp với mức liều 50g/kg thể trọng chuột tƣơng đƣơng 1250 lần liều dùng cho ngƣời) không có biểu hiện ngộ độc cấp trên chuột và thử độc t nh án trƣờng diễn với mức liều 3g/kg thỏ/ngày, dùng liên tục trong một tháng đối với thỏ không thấy biểu hiện độc [10]. 11 Đã nghiên cứu khả năng chống oxy hoá cho thấy dịch chiết (1:1) và flavonoid toàn phần có hoạt tính chống oxy hoá khá cao, đạt 50,11% ở nồng độ dịch chiết (1:25) và 63,80% ở nồng độ 0,3mg flavonoid toàn phần [12]. Đã nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết, mẫu tách riêng từ phân đoạn chiết bằng ethylacetat với liều 4g/kg ttc sau 124h nồng độ đƣờng huyết là 18,8 mmol/dl giảm không đáng kể so với lô chứng, nhƣng mẫu từ dịch chiết cồn toàn phần với liều 5g/kg ttc sau 124h nồng độ đƣờng huyết là 9,0 mmol/dl giảm rõ rệt so với lô chứng là 20,9 mmol/dl khi gây tăng đƣờng huyết bằng streptozocin với mức ý nghĩa p < 0,001 [1]. Đã nghiên cứu tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch trên cả hai mô hình: ức chế miễn dịch bằng cyclophosphamid và ức chế bằng tia xạ [15] Saponin trong G. pentaphyllum có tác dụng ức chế khối u trong điều kiện thí nghiệm [14] . Một nghiên cứu mới công bố phát hiện ra 7 saponin mới gây độc với một số dòng tế ào ung thƣ phổi, ung thƣ ruột già, ung thƣ vú và ung thƣ uồng trứng [21]. 1.2.4. Sử dụng trong điều trị Theo YHCT, dƣợc liệu có vị đắng, tính hàn, có tác dụng tiêu viêm, giải độc, ngừng ho và long đờm [8]. Gynostemma pentaphyllum là một trong 24 vị dƣợc liệu của Trung Quốc có tác dụng tới acid nucleic, protein và vòng tuần hoàn của bệnh nhân ung thƣ phổi. Dƣợc liệu có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng của cơ thể, dùng làm thuốc tu bổ cƣờng tráng [20]. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, giảo cổ lam đƣợc trồng trên diện rộng ở các địa phƣơng, đƣợc chế biến thành các sản phẩm chè đa dạng và lƣu thông rộng rãi trên thị trƣờng. Giảo cổ lam đƣợc sử dụng để tăng cƣờng chức năng giải độc gan, chống oxy hóa, giảm stress, làm hạ mỡ máu [14], [12], [16]. 12 1.3. TỔNG QUAN VỀ CAO THUỐC 1.3.1. Khái niệm Cao thuốc là chế phẩm điểu chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu đƣợc từ dƣợc liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp. Các dƣợc liệu trƣớc khi chiết xuất, đƣợc xử lý sơ ộ (sấy khô và chia nhỏ đến k ch thƣớc thích hợp). Với một số dƣợc liệu đặc biệt, có chứa men phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trƣớc khi sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất bằng hơi ethanol sôi, hơi nƣớc sôi, hoặc phƣơng pháp th ch hợp khác để bảo vệ hoạt chất trong dƣợc liệu. Cao thuốc đƣợc chia thành 3 loại: - Cao lỏng: thể chất lỏng hơi sánh, mùi vị đặc trƣng của dƣợc liệu dùng để điều chế cao. - Cao đặc: khối đặc quánh, hàm lƣợng dung môi dùng để chiết xuất còn lại trong cao không quá 20%. - Cao khô: một khối hoặc bột khô, đồng nhất, có độ ẩm không lớn hơn 5 . [6] Tiêu chuẩn là quy định về đặc tính kỹ thuật và yêu cầu quản lý, dùng làm chuẩn để phân loại, đánh giá sản phẩm, hàng hóa, dịch vụ, quá trình, môi trƣờng và các đối tƣợng khác trong hoạt động kinh tế, xã hội nhằm nâng cao chất lƣợng và hiệu quả của các đối tƣợng này. Tiêu chuẩn do một tổ chức công bố dƣới dạng văn bản để tự nguyện áp dụng. - Hệ thống tiêu chuẩn và ký hiệu tiêu chuẩn: + Tiêu chuẩn quốc gia, ký hiệu TCVN. + Tiêu chuẩn cơ sở, ký hiệu TCCS. - Căn cứ xây dựng tiêu chuẩn. Tiêu chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên một hoặc những căn cứ sau: + Tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nƣớc ngoài.