Tài liệu Xác định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Hoàng XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT, ĐẶC TRƢNG TÍNH CHẤT CỦA DỊCH OLIGO CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII THỦY PHÂN BẰNG AXIT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Nha Trang - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Hoàng XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT, ĐẶC TRƢNG TÍNH CHẤT CỦA DỊCH OLIGO CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII THỦY PHÂN BẰNG AXIT Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hƣớng dẫn 1 Hƣớng dẫn 2 TS. Phạm Trung Sản TS. Đào Việt Hà Nha Trang – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Hoàng LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Phạm Trung Sản và TS. Đào Việt Hà đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn đề tài mã số: TN18/C06 thuộc chương trình Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ cấp quốc gia đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh chị em trong phòng Nghiên cứu ăn mòn và Công nghệ điện hóa trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Hoàng 1 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục........................................................................................................ 1 Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ......................................................... 6 Danh mục các bảng ..................................................................................... 7 Danh mục các hình vẽ, đồ thị ...................................................................... 9 MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 11 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. RONG SỤN.............................................................................................. 13 1.1.1. Giới thiệu về rong sụn ....................................................................... 13 1.1.2. Thành phần hóa học của rong sụn ..................................................... 13 1.2. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN . 14 1.2.1. Giới thiệu chung về carrageenan ....................................................... 14 1.2.2. Phân loại ............................................................................................ 15 1.2.3. Cấu trúc ............................................................................................. 16 1.2.4. Đặc trƣng hóa học của carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii ....................................................................................................... 17 1.2.5. Oligo Carrageenan và ứng dụng ........................................................ 18 1.2.5.1. Oligo carrageenan ...................................................................... 18 1.2.5.2. Ứng dụng của oligo carrageenan ............................................... 20 1.2.6. Các phƣơng pháp thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan .. 23 1.2.6.1. Phương pháp hóa học ................................................................. 23 2 1.2.6.2. Phương pháp vật lý ..................................................................... 24 1.2.6.3. Phương pháp sinh học ................................................................ 25 1.2.6.4. Các phương pháp kết hợp ........................................................... 26 1.3. THỦY PHÂN CARRAGEENAN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA HỌC ......................................................................................................................... 27 1.3.1. Ƣu điểm ............................................................................................. 27 1.3.2. Nhƣợc điểm ....................................................................................... 28 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ...................................................... 29 1.4.1. Phân tích thành phần hóa học rong sụn ............................................. 29 1.4.1.1. Phân tích protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl ............. 29 1.4.1.2. Phân tích hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Folch ... 29 1.4.1.3. Phương pháp phân tích hàm lượng tro ...................................... 30 1.4.1.4. Phương pháp phân tích độ ẩm của rong biển khô ..................... 30 1.4.2. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng sau thủy phân.30 1.4.3. Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng phân tử của oligo carrageenan. 30 1.4.3.1. Bằng nhớt kế ............................................................................... 30 1.4.3.2. Sắc ký rây phân tử ...................................................................... 31 1.4.3.3. Tán xạ ánh sáng tĩnh .................................................................. 32 1.4.4. Phƣơng pháp phân tích cấu trúc oligo carrageenan .......................... 35 1.4.4.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ............................................. 35 1.4.4.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).................... 36 1.4.4.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) ............................................ 37 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 39 2.2. HÓA CHẤT: ............................................................................................ 39 3 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 39 2.3.1. Phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn ....................... 39 2.3.1.1. Phân tích protein thô .................................................................. 39 2.3.1.2. Phân tích lipid thô ...................................................................... 39 2.3.1.3. Phân tích hàm lượng tro ............................................................. 41 2.3.1.4. Phân tích độ ẩm ......................................................................... 42 2.3.2. Phƣơng pháp chiết carrageenan......................................................... 42 2.3.3. Phƣơng pháp thủy phân tạo oligo carrageenan ................................. 43 2.3.4. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng ....................... 43 2.3.5. Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ............................................................................... 43 2.3.6. Phƣơng pháp phân tích đặc trƣng cấu trúc carrageenan bằng phổ IR ..................................................................................................................... 43 2.4. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 44 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...................................................................... 44 2.4.1.1. Thu và xử lý nguyên liệu ............................................................. 45 2.4.1.2. Chiết carrageenan ...................................................................... 45 2.4.2. Thủy phân rong sụn bằng các axít ở các điều kiện khác nhau .......... 47 2.4.2.1. So sánh hiệu suất thủy phân theo nồng độ axit .......................... 47 2.4.2.2. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo thời gian ........... 48 2.4.2.3. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo nhiệt độ ............ 49 2.4.3. Thu hồi oligo carrageenan ................................................................. 49 2.4.4. Phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng ............................................. 49 2.4.5. Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lƣợng phân tử dịch thủy phân ..................................................................................................................... 50 2.4.6. Đƣa ra điều kiện thủy phân tối ƣu cho dịch chiết sau thủy phân ...... 50 4 2.4.7. Khảo sát khả năng kích thích sinh trƣởng của dịch oligo carrageenan trên cây ngô. ................................................................................................ 50 2.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU ..................................................................................... 51 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG SỤN ............................................... 52 3.2. HIỆU SUẤT THỦY PHÂN THEO CARBOHYDRAT TỔNG ............. 53 3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ axit ............................................................. 53 3.2.1.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit ......................... 53 3.2.1.2. Lựa chọn nồng độ axit thích hợp ................................................ 56 3.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân .................................................. 57 3.2.2.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit ......................... 57 3.2.2.2. Lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp .................................... 59 3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ .................................................................... 60 3.2.3.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân ..................................................... 60 3.2.3.2. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp ....................................................... 62 3.3. TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII BẰNG AXÍT VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN THÍCH HỢP............................................................................ 63 3.3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân .................................................. 63 3.3.2. Đề xuất quy trình thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp hóa học sử dụng xúc tác axit .. 70 3.4. TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ TRUNG BÌNH CỦA OLIGO CARRAGEENAN........................................................................................... 72 3.5. ĐẶC TRƢNG CẤU TRÚC CỦA OLIGO CARRAGEENAN ............... 76 3.6. KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG CỦA DỊCH OLIGO CARRAGEENAN TRÊN CÂY NGÔ ............................................................ 80 5 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 85 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 87 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 94 6 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 3,6 AG 3,6-AnhydroGalactose 3,6-AnhydroGalactose GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel HMF HydroxyMethylFurfural HydroxyMethylFurfural IR InfraRed Phổ hồng ngoại NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân PGR Plant growth regulator SLS Static Light Scattering Tán xạ ánh sáng tĩnh XRD X-ray diffraction Nhiễu xạ tia X Chất điều hòa trƣởng thực vật sinh 7 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn .................................................. 13 Bảng 3.1. Thành phần hóa học của rong Sụn – Kappaphycus alvarezii ........ 52 Bảng 3.2. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loại axit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v) bột carrageenan .............................................................................. 54 Bảng 3.3. Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theo nồng độ axit ............................................................................................. 56 Bảng 3.4. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) ) sau thủy phân của các loại axit theo thời gian, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v) bột carrageenan, nồng độ axit 0,2 M ............................................................................................ 58 Bảng 3.5. Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theo thời gian thủy phân .................................................................................. 59 Bảng 3.6. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loại axit theo nhiệt độ thủy phân, thời gian 90 phút, 2 % (w/v) bột rong carrageenan trong 80 mL axit 0,2 M ....................................................... 61 Bảng 3.7. Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theo nhiệt độ thủy phân ................................................................................... 62 Bảng 3.8. Giới hạn phạm vi và mức biến đổi của các yếu tố ......................... 63 Bảng 3.9. Kết quả xác định hàm mục tiêu theo phần mềm qui hoạch thực nghiệm ..................................................................................................... 64 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phƣơng sai với hàm mục tiêu là hiệu suất thủy phân bằng axit ascorbic ................................................................... 65 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phƣơng sai với hàm mục tiêu là hiệu suất thủy phân bằng axit sulfuric .................................................................... 65 Bảng 3.12. Kết quả phân tích thống kê sự phù hợp của các yếu tố ................ 66 8 Bảng 3.13. Các điều kiện ràng buộc của yếu tố ảnh hƣởng và hàm mục tiêu ........................................................................................................... 68 Bảng 3.14. Giải pháp tối ƣu thuật toán đề nghị .............................................. 69 Bảng 3.15. Kiểm chứng kết quả theo mô hình và thực nghiệm...................... 69 Bảng 3.16. Kết quả tối ƣu hóa điều kiện thủy phân ........................................ 69 Bảng 3.17. Trọng lƣợng phân tử trung bình Mw (kDa) của oligocarrageenan khi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa) bằng axit ascorbic (C6H8O6) ở nồng độ và thời gian khác nhau, nhiệt độ 90 OC ................................................................................................... 73 Bảng 3.18. Trọng lƣợng phân tử trung bình Mw (kDa) của oligocarrageenan khi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa) bằng axit sulfuric (H2SO4) ở nồng độ và thời gian khác nhau, nhiệt độ 90 OC ........................................................................................................ 75 Bảng 3.19. Một số dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử và các liên kết trong phổ hồng ngoại của kappa carrageenan [62] .................................. 78 Bảng 3.20. Điều kiện thủy phân và tính chất của dịch oligo carrageenan ...... 80 Bảng 3.21. Chiều cao cây (cm) sau các đợt phun dịch chiết thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii từ axit ascorbic với nồng độ carbohydrat trong dịch phun lá khác nhau ................................................................... 80 Bảng 3.22. Chiều cao cây (cm) sau các đợt phun dịch chiết thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii từ axit sulfuric với nồng độ carbohydrat trong dịch phun lá khác nhau ................................................................... 82 Bảng 3.23. Giá trị trung bình của chiều cao cây (cm) và năng suất hạt của bắp (tạ/ha) sau 3 đợt phun (60 ngày) với nồng độ carbohydrat trong dịch phun lá khác nhau ............................................................................ 83 9 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của carrageenan................................................... 15 Hình 1.2. Cấu trúc của kappa carrageenan...................................................... 16 Hình 1.3. Cấu trúc của iota carrageenan ......................................................... 16 Hình 1.4. Cấu trúc của lamda carrageenan ..................................................... 16 Hình 1.5. Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan............. 18 Hình 1.6. Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành galactobiose ............................................................................................. 19 Hình 1.7. Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc ..................................... 19 Hình 1.8. Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzyme, trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ. .................................... 19 Hình 1.9. Hình học tán xạ và dao động cƣờng độ tại máy dò......................... 33 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.................................................................... 44 Hình 2.2. Qui trình xử lý rong biển trƣớc khi chiết carrageenan .................... 45 Hình 2.3. Qui trình chiết carrageenan từ bột rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ............................................................................... 46 Hình 2.4. Sản phẩm bột oligo carrageenan trƣớc và sau khi thủy phân ......... 47 Hình 2.5. Qui trình thủy phân các loại axit theo nồng độ ............................... 47 Hình 2.6. Qui trình thủy phân các loại axit theo thời gian.............................. 48 Hình 2.7. Qui trình thủy phân các loại axit theo nhiệt độ ............................... 49 Hình 3.1. Hiệu suất thủy phân (%) theo carbohydrat tổng của các loại axit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v) bột carrageenan ........................................................................................ 55 10 Hình 3.2. Hiệu suất thủy phân theo carbohydrat tổng của các loại axit theo thời gian, nhiệt độ ở 90 OC, 2 % (w/v) bột carrgeenan, nồng độ axit 0,2 M .............................................................................................................. 58 Hình 3.3. Hiệu suất thủy phân (%) theo carbohydrat tổng của các loại axit theo nhiệt độ, thời gian 90 phút, 2% (w/v) bột carrageenan, nồng độ axit 0,2M .................................................................................................. 61 Hình 3.4. So sánh giá trị từ thực nghiệm và từ mô hình dự đoán ................... 67 Hình 3.5. Đồ thị dạng 3D bề mặt đáp ứng và đƣờng đồng mức cho biết ảnh hƣởng của hai yếu tố nồng độ axit và thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân bằng axit ascorbic (a, c) và axit sulfuric (b, d) ....................... 68 Hình 3.6. Quy trình đề xuất thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp hóa học sử dụng xúc tác axit ........................................................................................................... 71 Hình 3.7. Phổ GPC của mẫu carrageenan ....................................................... 73 Hình 3.8. Phổ GPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 OC) ........................................................... 74 Hình 3.9. Phổ GPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 OC) ............................................................ 74 Hình 3.10. Phổ hồng ngoại IR của mẫu carrgeenan ....................................... 76 Hình 3.11. Phổ hồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 OC) .. 77 Hình 3.12. Phổ hồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 OC).... 77 11 MỞ ĐẦU Trong số các loại rong biển đƣợc nghiên cứu để phát triển thành các dạng phân bón, rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc đặc biệt quan tâm vì thành phần dinh dƣỡng vƣợt trội cùng mức tăng trƣởng, khả năng đáp ứng tốt của cây trồng. Hàng loạt các công bố trên thế giới đã khẳng định khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng, khả năng chống chịu bệnh và năng suất tăng cao khi sử dụng phân bón từ rong sụn so với các loại rong khác và so với đối chứng không sử dụng phân bón rong biển. Carrageenan đƣợc chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii là thành phần chủ yếu của thành tế bào rong, chiếm khoảng 40% trọng lƣợng khô, chúng bao gồm galactose sulfate và trong một số trƣờng hợp còn có cả anhydrogalactose. Carrageenan đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm với các tính chất nhƣ tạo gel, làm dày, ổn định. Carrageenan biến tính (trọng lƣợng phân tử thấp hay ở dạng oligo) từ rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong mỹ phẩm, dƣợc phẩm và phân bón. Oligo carrageenan với vai trò là phân bón sinh học không chỉ bởi tác dụng của nó nhƣ một chất kích thích sinh trƣởng tự nhiên mà còn có khả năng tăng sức đề kháng cho cây trồng chống lại sâu bệnh, sự thay đổi của thời tiết. Cũng nhƣ một số polysacchride khác, carrageenan có thể thủy phân hay cắt mạch thành oligo bằng phƣơng pháp vật lý (chiếu xạ, dùng sóng siêu âm), phƣơng pháp hóa học (tác nhân axit, bazơ, tác nhân oxy hóa...) hay phƣơng pháp sinh học (enzyme) với những ƣu/nhƣợc điểm riêng. Một trong những hạn chế của phƣơng pháp hóa học là thƣờng tạo ra các sản phẩm phụ trong quá trình thủy phân. Tuy nhiên, thủy phân bằng axit lại có một số lợi thế về tốc độ phản ứng nhanh, giá thành rẻ và nguồn hóa chất dễ có hơn. Với mục tiêu xây dựng quy trình thủy phân phù hợp nhằm sử dụng rong sụn làm chất kích thích sinh trƣởng trong nông nghiệp, phƣơng pháp thủy phân bằng axit đƣợc xem là phƣơng pháp thích hợp để thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii. 12 Các oligosaccharide của carrageenan điều chế bằng việc thủy phân axit hoặc bẽ gãy mạch bằng enzyme là các chất sinh học kích thích sinh trƣởng, thụ tinh, các chất này có khả năng kích thích cho sự tích lũy dinh dƣỡng và tái tạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa và tạo quả tốt hơn. Các oligosaccharide sulphat đã đƣợc công nhận để kích thích cho cơ chế bảo vệ cây, do đó oligocarrageenan có thể sử dụng nhƣ một chất tăng trƣởng tự nhiên. Đặc trƣng chất lƣợng của dịch sau thủy phân phụ thuộc nhiều vào các điều kiện thủy phân nhƣ nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian. Do đó, “Xác định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit” đƣợc chọn là đề tài luận văn nhằm đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích sử dụng sản phẩm từ rong sụn làm chất kích thích sinh trƣởng cho cây trồng. Mục tiêu của luận văn Xác định hiệu suất chiết, trọng lƣợng phân tử và đặc trƣng cấu trúc của oligo carrageenan thu đƣợc bằng phƣơng pháp thủy phân rong sụn trong axit vô cơ (axit sulfuric) và axit hữu cơ (axit ascorbic) ở các điều kiện khác nhau (nồng độ axit, nhiệt độ, thời gian), từ đó đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích làm chất kích thích sinh trƣởng trong nông nghiệp. Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: - Khảo sát hiệu suất thủy phân ở các điều kiện thủy phân khác nhau. - Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân với hiệu suất thủy phân tối ƣu. - Phân tích trọng lƣợng phân tử trung bình và đặc trƣng cấu trúc của dịch oligo carrageenan thu đƣợc sau quá trình thủy phân. - Thử nghiệm hiệu quả kích thích sinh trƣởng của dịch chiết oligo carrageenan trên cây ngô. 13 1CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. RONG SỤN 1.1.1. Giới thiệu về rong sụn Rong sụn thuộc ngành Tảo hồng (Rhodophyta), phân lớp: Rhodophyceae, bộ: Gigartinales, họ: Solieriaceae, giống: Kappaphycus, loài: alvarezii, trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là loài có sản lƣợng lớn nhất [1]. Macxxell Doty là ngƣời đầu tiên tìm thấy rong sụn ở vùng biển Philippines vào năm 1972. Ngƣời có công thu mẫu cùng với ông là Alvarezii, do vậy Macxxell Doty đã đặt tên rong này là Euchuma alvarezii Doty. Khi phân tích thành phần hóa học của rong này ông đã đổi tên Echuma alvarezii Doty thành Kappaphycus alvarezii. Sau đó ông cùng với các nhà nghiên cứu tại trƣờng đại học Hawaii bắt đầu nghiên cứu phát triển phƣơng pháp nuôi trồng rong sụn ở Hawaii. Từ đó, rong sụn đƣợc nuôi trồng và phát triển rộng rãi ở nhiều nƣớc nhƣ Indonesia, Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam … Rong sụn đƣợc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang di nhập từ Philipines về Việt Nam vào tháng 3 năm 1993, và đƣợc nhân giống nghiên cứu các đặc tính sinh học, giải pháp kỹ thuật và mô hình trồng rong Sụn ở các loại thủy vực khác nhau của nƣớc ta. 1.1.2. Thành phần hóa học của rong sụn Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn [2] Tên thành phần hóa học % (khối lƣợng) Protein 2,4 Cellulose 4,0 Ẩm 19,4 Tro tổng 20,0 Carrageenan 40,0 Thành phần khác 14,2 14 Khi ở dạng tƣơi, rong sụn thƣờng có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll. Đây là loài đơn trụ bao gồm 2 phần: Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn. Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thƣớc lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dƣỡng (car). Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố. Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lƣợng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong. Thành phần hóa học chính của rong sụn là carrageenan có thể chiếm đến 40% trọng lƣợng khô. Trong đó, carrageenan tan chiếm khoảng 33%, carrageenan không tan chiếm 7%. 1.2. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN 1.2.1. Giới thiệu chung về carrageenan Carrageenan là một loại colloid thuộc nhóm phycocolloid cùng với agar và alginat. Carrageenan đƣợc chiết xuất từ rong biển đỏ có cấu trúc là một polysaccharite. Carrageenan đã đƣợc biết đến từ rất lâu đời ở các nƣớc phƣơng Tây. Vào những năm 1842-1862, các nhà khoa học đã phát hiện ra carrageenan có trong một loài tảo đỏ có tên là Chondrus cripus và loài Irish moss thuộc họ Rhodophyceae, nhƣng những khám phá của họ còn thô sơ, chƣa xác định đƣợc những tính chất cũng nhƣ đặc điểm của nó. Mãi đến những năm khi chiến tranh thế giới thứ nhất bùng nổ, khi mà nhu cầu chiết xuất gelatin để phục vụ quân đội trở nên cấp thiết đòi hỏi cần phải có chất thay thế, rất nhiều các nghiên cứu đã đƣợc tiến hành và cuối cùng carrageenan đã đƣợc tìm ra [3]. Tên Carrageenan hay Carrageenan – irish moss là tên của một thị trấn ven biển Irish thuộc Carrageenan. Cùng với sự tiến bộ về khoa học kỹ thuật 15 cũng nhƣ thiết bị hiện đại, ngày nay chúng ta đã khám phá ra những điều hữu ích mà carrageenan đã mang lại. Từ những loài tảo đỏ (Rhodophyceae) ngƣời ta đã phát hiện ra nhiều loại carrageenan khác nhau, bao gồm: kappacarrageenan, lamda-carrageenan, iota-carrageenan [4]. Carrageenan là một polysaccharide dị thể của galactose –galactan. Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfat đƣợc gắn vào carrageenan ở những vị trí và số lƣợng khác nhau. Vì vậy, carrageenan không chỉ là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà là các galactan sulfat. Mỗi galactan sulfat là một dạng riêng của carrageenan và có ký hiệu riêng. Ví dụ: λ – , κ –, ι –, ν – carrageenan [4] Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của carrageenan [5] 1.2.2. Phân loại Phần lớn các carrageenan có phân tử lƣợng từ 500 – 1000 kDa, nhƣng trong đó chúng có thể chứa tới 25% polysaccharide với phân tử lƣợng nhỏ dƣới 100 kDa. Carrageenan có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của β-D-galactopyranora qua liên kết 1,3 và α-D galactopyranora qua liên kết 1-4 [6]. Các công trình nghiên cứu bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân cho thấy carrageenan có nhiều cấu trúc hóa học khác nhau [7]. Do đó, phân loại theo cấu trúc hóa học có các loại carrageenan sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi. Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sulphat hóa, vị trí sulphat hóa, mức độ dehydrat hóa của chuỗi polysacharide. Cấu trúc của chúng đều có những thành phần về số lƣợng sulphat của carrageenan chiếm 18 ÷ 40 % phân tử carrageenan. 16 1.2.3. Cấu trúc Kappa-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn xen kẽ giữa Dgalactose-4- sulphat (Gal S) và 3,6 – Anhydro-D-galactose (GalA). Cấu trúc phân tử kappa carrageenan là một vòng xoắn kép bậc 3 Hình 1.2. Cấu trúc của kappa carrageenan Iota-carrageenan: cũng giống nhƣ kappa-carrageenan nhƣng gốc 3,6Anhydrogalactose lại ở vị trí cacbon thứ 2. Iota –carrageenan là carrageenan có nhóm SO42- nhiều nhất trong mạch phân tử, cấu trúc là vòng xoắn kép bậc 2. Gel iota- carrageenan có tính đàn hồi. Hình 1.3. Cấu trúc của iota carrageenan Lamda-carrageenan: trong mạch phân tử, các đơn vị monomeric đƣợc xen kẽ với nhau: đơn vị D-galactose-2-sulphat (1,3) và D-galactose 2,6disulphat Hình 1.4. Cấu trúc của lamda carrageenan Các phân đoạn này đều có tính đa phân tán nhƣng chúng khác nhau về thành phần ester sulphat và gốc quay quang. Lamda-carrageenan có khối