Tài liệu Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn hà nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Trần Thị Hồng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Hóa phân tích; Mã số: 60 44 29 Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran; tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran; dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tươi sống bằng LC-MS/MS. Ứng dụng phương pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tươi sống cu ̣ thể trong thiṭ lơ ̣n , thịt bò, thịt gà, gan. Tìm hiểu kết quả đạt được. Keywords. Hóa phân tích; Dư lượng kháng sinh; Thực phẩm Content MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang được cả xã hội quan tâm, đặc biệt là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát hiện trong thực phẩm khiến dư luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề đáng lo ngại, như việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dư các hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng. Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng trong thức ăn gia súc như kích thích tăng trưởng và là phương pháp điều trị dự phòng, điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã được sử dụng để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản...Tuy nhiên chúng gây tác hại cho sức khỏe con người, đặc biệt là gây ung thư và đột biến ở người. Năm 2002 – 2003 phát hiện dư lượng chất chuyển hóa của nitrofuran trong số lượng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nước Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nước này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại thực phẩm nhập khẩu có chứa dư lượng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong đó có nitrofuran [9]. Hiện nay việc sử dụng dư lượng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động ảnh hưởng tới sức khỏe con người và động vật. Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn đề đảm bảo VSATTP hiện nay, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp “Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có ch ứa nhóm 5-nitro, thường được sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trưởng, chủ yếu đối với gia súc (như gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng như viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu [12]. Các chất nhóm n itrofuran bao gồ m Furazolidone, furaltadone, furazolidone, nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vâ ̣t nó tạo thành các chấ t chuyể n hóa tương ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kế t trong các mô tồ n ta ̣i trong nhiề u tuầ n sau khi sử du ̣ng [12]. 1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran McCracken và các cô ̣ng sự 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tương ứng liên kết trong các mô. Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa từ nitrofuran đã kìm hãm hoặc phá hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không phát triển và không sinh sản được nữa. Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram dương. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng tố t trong viê ̣c giê ̣t trừ giun đũa [7]. Với n ồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn. Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong viê ̣c diê ̣t khuẩ n salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dưỡng. Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng nhanh. Nitrofuran ảnh hưởng đến sức khỏe con người như gây ung thư và đột biến [7], khi thực phẩ m có tồ n dư nitrofuran và các dẫn xuấ t của nó . Do đó hầ u hế t các nước trên thế giới đã cấ m sử du ̣ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bô ̣ Nông nghiê ̣p và phát triể n nông thôn đã quyế t đinh ̣ cấ m sử dụng nitrofuran cho vào trong thức ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. 1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thường xuyên đươ ̣c phát hiện thấ y trong thịt gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nước EU từ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25]. Hơn nữa, dư lượng nitrofuran cũng được tìm thấy trong sản phẩm gia súc và gia cầm ở Châu Âu như: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm tôm, mật ong và thịt hộp [25]. Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran trong tôm [11]. Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS . Nguyễn Quố c Ân , phó trưởng phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lấ y ta ̣i ao nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lô ̣t) với hàm lươṇ g từ 0 – 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiê ̣n 1 mẫu tôm thẻ chân trắ ng ta ̣i Phú Mỹ – Bình Định nhiễm AOZ với hàm lượng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lô ̣t ta ̣i Cầ n Guô ̣c – Long An nhiễm SEM với hàm lươ ̣ng từ 2 – 2,2 ng/g [1]. 1.4. Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran Hiê ̣n nay có nhiề u phương pháp để xác đinh ̣ kháng sinh nhóm nitrofuran , bao gồ m : phương pháp sắ c ký lỏng với detector UV , phương pháp vi sinh (kỹ thuật Elisa ), phương pháp sắc ký lỏng với detector MS/MS. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các chất chuyển hóa của nitrofuran, bao gồm: AOZ, AMOZ, SEM và AHD. Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tươi sống bao gồm thịt và gan của gia súc gia cầm. Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực phẩm tươi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụ thể như sau: - Xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tươi sống bằng LC-MS/MS. - Ứng dụng phương pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tươi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp  Khảo sát phương pháp bao gồm:  Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,  Điều kiện tách chiết lấ y chấ t phân tić h.  Thẩm định phương pháp:  Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ,  Khoảng tuyến tính,  Độ chụm (độ lặp lại),  Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch). 2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tươi sống đang bán trên địa bàn Hà Nội. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ 2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu Khảo sát phương pháp xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng và chiế t pha rắ n 2.2.3. Thẩm định phƣơng pháp 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 2.3.1. Dụng cụ và thiết bị 2.3.1.1. Thiết bị - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt. - Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm). - Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB). - Máy lắc vortex VELP. - Máy đồng nhất mẫu. - Máy li tâm MIKRO 22R. - Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg). - Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g). - Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt. - Bể điều nhiệt 2.3.1.2 Dụng cụ - Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml. - Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml. - Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 µl; 1000 µl; 5 ml…đầu côn. - Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm. - Vial loại 1,8 ml. - Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml. - Ống nghiệm thủy tinh… 2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích 2.3.2.1 Chất chuẩn - AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5% - d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99% - 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98% 2.3.2.2 Hóa chất - Methanol (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%) - Amoni acetate (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 98%) - 2-NBA (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%) - K2HPO4.3H2O (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%) - NaOH (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%) - HCl 37% (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%) - HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất. - 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng methanol. Dung dịch chuẩn bị hằng ngày. - K2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000 ml bằng nước cất 2 lần. - NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng nước cất 2 lần. - CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng nước cất 2 lần. 2.3.3 Pha chế chất chuẩn - Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 6 tháng. - Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 6 tháng. - Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. - Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 6 tháng. - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lượt 1 ml chuẩn AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 3 tháng. - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 1 tháng. - d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 6 tháng. - d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 6 tháng. - d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 6 tháng. - d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 6 tháng. - Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l: hút lần lượt 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l và 13C15N2SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 3 tháng. - Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 20 µg/l: hút lần lượt 200 µl hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, 13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng đươ ̣c trong 1 tháng. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS Phân tích dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran. Các chất chuyển hóa của nitrofuran có khối lượng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đặc hiệu cho sự phân mảnh (chủ yếu là mất nước, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện bằ ng MS tương đối thấp. Vì vậy sử dụng 2nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran để có được các hợp chất dẫn xuấ t (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM) với nhiều đặc tính thuận lợi. 3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khố i 3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lượng phân tử nhỏ và phân cực. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chệ độ bắn phá ion dương. Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD, SEM 500 ng/ml đã được dẫn xuất bằng 2nitrobenzaldehyte , sau đó đưa vào detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất, tối ưu hóa từng ion mẹ, thu được điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Khí màn (CUR) 20 psi Khí va chạm (CAD) 8 psi Thế ion hóa (IS) 5000 V Nhiệt độ mao quản (TEM) 4000C Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi Áp suất của luồng khí nóng (GS2) 40 psi Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ có dạng (MH)+ với số khố i m = (M+1) theo phản ứng: M0 + H+ → (MH)+ Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, kết quả được chỉ ra ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ Chuyển hóa nhóm nitrofuran Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+H) 235 236 NPAOZ 334 335 NPAMOZ 208 209 NPSC 248 249 NPAHD 239 240 d4-AOZ 339 340 d5-AMOZ 13 15 211 212 C- N2 SEM.HCl 250 251 D2-AHD.HCl 3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion me ̣ để thu đƣơ ̣c ion con Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê ̣ kh ối phổ 2 lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn được ion con là rất quan trọng. Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp. Dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn đã được dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion con đă ̣c trưng có cư ờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lượng. Mảnh ion con m/z có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh ion con thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích. Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion con đặc trưng có cường độ cao nhất. Kết quả thu được ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất chuyển hóa nitrofuran Chuyển hóa Ion mẹ nhóm Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V) (M+H)+ nitrofuran 80 15 10 134 236 NPAOZ 104 80 27 14 80 15 16 291 335 NPAMOZ 262 80 21 16 80 11 18 192 209 NPSEM 166 80 13 14 80 15 18 134 249 NPAHD 104 80 27 14 240 134 80 17 16 d4-AOZ 340 296 80 15 16 d5-AMOZ 13 C-15N2 212 168 80 13 12 SEM.HCl 251 134 80 15 14 d2-AHD.HCl Nhâ ̣n xét: Theo qui đinh ̣ của Châu Âu 2002/657/EC, số điể m nhâ ̣n da ̣ng (IP) đươ ̣c tiń h đố i với kỹ thuâ ̣t LC/MS/M, tương ứng với 1 ion me ̣ và 2 ion con , số điể m nhâ ̣n da ̣ng (IP) là 4. Như vâ ̣y phương pháp đã đáp ứng đươ ̣c yêu cầ u của Châu Âu [phụ lục 4]. Phù hợp với các nghiên cứu khác của một số tác giả như tác giả Leitner, tác giả D.Tyler của phòng thí nghiê ̣m của Anh… 3.1.2. Lựa chọn cột tách Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thời theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực trung bình như methanol, acetonitrile, nước, acid formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha đảo. Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 với các thông số dưới đây cho các nghiên cứu tiế p theo: - Cột C18 của Agilent có: - Chiề u dài 150mm, - Đường kính 2,1mm, - Cỡ ha ̣t 3,5µm. 3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient pha đô ̣ng Các dẫn xuất của nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát một số chương trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17, 24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol. Cố định các điều kiện sắc ký: - Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm), - Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol, - Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút, - Mẫu phân tích: hỗn hợp dẫn xuấ t nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml. Tiế n hành thí nghiê ̣m theo: a) Chương triǹ h Gradient 1, thu đươ ̣c sắ c đồ như trong hiǹ h 3.1 : Thời gian (phút) 0,01 12,00 14,00 15,00 20,00 % MeOH 20 90 90 20 20 Hình 3.1: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 1 ở nồng độ 20 ng/ml b) Chương triǹ h Gradient 2, thu đươ ̣c sắ c đồ trong hiǹ h 3.2: Thời gian (phút) 0,01 5 8 % MeOH 20 90 90 9 12 20 20 Hình 3.2: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml c) Chương trình Gradient 3, thu đươ ̣c sắ c đồ trong hình 3.3 : Thời gian (phút) 0,01 8 10 13 13,01 % MeOH 20 90 90 20 20 Hình 3.3: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 3 ở nồng độ 20 ng/ d) Chương trình Gradient 4, thu đươ ̣c sắ c đồ trong hình 3.4: Thời gian (phút) 0,01 10 12 15 15,01 % MeOH 20 90 90 20 20 Hình 3.4: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 4 ở nồng độ 20 ng/ml e) Chương triǹ h Gradient 5, thu đươ ̣c sắ c đồ trong hiǹ h 3.5: Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00 % MeOH 20 90 90 20 20 Hình 3.5: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 5 ở nồng độ 20 ng/ml Bàn luận : - Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thời gian ngắn (chương triǹ h gradient 1, gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc của AOZ rất xấu và bị chẻ píc. Hiê ̣n tươ ̣ng chẻ pic này là do hàm lươ ̣ng MeOH cao , AOZ tồ n ta ̣i đồ ng thời ở hai da ̣ng là amin bâ ̣c nhấ t R -NH2 và dạng R NH3+. Do đó , nồ ng đô ̣ MeOH cầ n phải đươ ̣c khố ng chế phù hơ ̣p , đồ ng nghiã với tăng nồ ng đô ̣ CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin thành dạng R-NH3+. - Chương trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng và có tiń hiê ̣u pić rõ ràng . Do đó chúng tôi lựa chọn chương trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có một số quy trình đã và đang được ứng dụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran bao gồm : quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây để tiế n hành thí nghiê ̣m. 3.1.4.1. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng Dự kiến quy trình xử lý mẫu như sau: Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm  Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml  Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống  Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu  Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C  Trung hòa axit bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây  Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấ y dung dich ̣ mẫu  Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấy lớp trên thổi khô bằng N2  Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)  Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằ ng LC/MS/MS 3.1.4.2. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn Thực hiê ̣n theo sơ đồ sau: Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm  Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml  Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống  Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu  Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C  Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây  Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấ y dung dich ̣ mẫu  Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O  Nạp mẫu vào cột, rửa loại chất bẩn bằng 2 x 2,5 ml H2O  Hút chân không cho khô cột SPE  Rửa giải chấ t phân tích bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm  Thổi khô bằng N2  Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)  Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằ ng LC/MS/MS Xử lý mẫu bằ ng 2 quy trình chiế t , so sánh đô ̣ thu hồ i của 2 quy trình chiết được chỉ ra ở bảng 3.6: Bảng 3.6: So sánh độ thu hồi của 2 quy trình chiết: Chiết lỏng-lỏng Chiết SPE Thịt lợn thêm chuẩn H (%) H (%) 42,1 87,7 AOZ 20 ng/g 45,0 92,7 AMOZ 20 ng/g AHD 20 ng/g SEM 20 ng/g 73,3 70,5 33,7 30,6 Nhâ ̣n xét : Nhìn vào bảng trên ta thấy quy trình chiết SPE cho độ thu hồi cao hơn so với quy trình chiết lỏng lỏng và đáp ứng được quy định của Châu Âu 2002/657EC. Do đó chúng tôi chọn quy trình chiết SPE cho các nghiên cứu tiếp theo 3.2. Thẩ m đinh ̣ phƣơng pháp 3.2.1 Tính đặc hiệu Phương pháp trên sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t sắ c ký lỏng khố i phổ 2 lầ n, thực hiê ̣n bắ n phá ion mẹ m/z, đinh ̣ lươ ̣ng theo ion con ta ̣o thành . Theo cách tiń h điể m IP thì với 1 ion me ̣ và 2 ion thu đươ ̣c 4 điể m IP, như vâ ̣y ph ương pháp có tính đă ̣c hiê ̣u đáp ứng đươ ̣c yêu cầ u của châu Âu 2002/657/EC [32]. 3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn 3.2.1.1. Đường chuẩn của các chất nhóm nitrofuran sử dụng nội chuẩn (để phân tích mẫu thực) Bảng 3.7: Phương trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R 1 AOZ y = (0,21426 ± 0,039142) + (0,31607 ± 0,016822)x 0,9992 2 AMOZ y = (0,01807 ± 0,044860) + (0,45988 ± 0,019293)x 0,9995 3 4 y = (0,12446 ± 0,119312) + (1,22034 ± 0,051273)x y = (0,26595 ± 0,262915) + (1,44626 ± 0,112983)x AHD SEM 0,9995 0,9984 Nhận xét: tỉ lệ diện tích pic nitrofuran/diện tích pic nội chuẩn (IS) trong khoảng 0,5 – 5 ng/ml có hệ số tương quan R2 > 0,99. 3.2.1.2. Đường chuẩn của các chất nhóm nitrofuran không sử dụng nội chuẩn (để đánh giá hiệu suất thu hồi) Bảng 3.8: Phương trình hồi quy của 4 nitrofuran không sử dụng nội chuẩn TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R 1 AOZ y = (14569 ± 32560) + (307751 ± 13990)x 0,9994 2 AMOZ y = (42233 ± 53499) + (363895 ± 22988)x 0,9989 3 AHD y = (6879 ± 4425) + (36695 ± 1902)x 0,9993 4 SEM y = (592 ± 4175) + (35485 ± 1793)x 0,9993 Nhận xét: Diện tích nitrofuran với nồng độ trong khoảng 0,5 – 5 ng/ml có hệ số tương quan R2 > 0,99. 3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp LOD của các chấ t kháng sinh nhóm nitrofuran nằ m trong khoảng từ 0,100 – 0,378 ng/g; LOQ từ 0,300 – 1,13 ng/g đáp ứng đươ ̣c yêu cầ u của Châu Âu 2002/657/EC về đô ̣ nha ̣y của phương pháp. Phù hợp với các nghiên cứu tương tự. 3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi Thực hiện thêm chuẩn vào mẫu thịt lợn không chứa nitrofuran ở các mức nồng độ (MRPL; 1,5MRPL; 2MRPL) đối với mỗi chất là: 1 ng/g; 1,5 ng/g; 2 ng/g. Phân tích lặp lại 6 lần mỗi mẫu. Bàn luận: Ta thấ y đô ̣ thu hồ i trung bình của các chất từ 80,5 – 106%, đô ̣ lă ̣p la ̣i tố t (%RSD < 13,7%) đa ̣t yêu cầ u theo quy đinh ̣ của Châu Âu 2002/657/EC. Từ các điề u kiê ̣n đã đươ ̣c tố i ưu ở trên đủ đảm bảo cho phép phân tích xác đinh ̣ 4 chấ t nhóm nitrofuran. 3.3. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích thƣc̣ phẩ m Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng và thẩm định, chúng tôi ứng dụng để phân tích một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội. Các kết quả được trình bày ở bảng 3.16 Bảng 3.16: Kết quả phân tích mẫu thực theo phương pháp thêm chuẩn STT Mẫu Nitrofuran AOZ 1 Thịt lợn chợ Nguyễn Cao AMOZ AHD SEM AOZ 2 Thịt gà chợ Nguyễn Cao AMOZ AHD SEM Lƣợng thêm vào (ng) 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 Lƣợng tìm thấy (ng) KPH 0,87 KPH 0,96 KPH 0,78 KPH 0,72 KPH 1,12 KPH 1,02 KPH 0,95 KPH 0,89 R% 87 96 78 72 112 102 95 89 AOZ 3 Thịt bò chợ Mai Động AMOZ AHD SEM AOZ AMOZ 4 Gan chợ Mai Động AHD SEM AOZ 5 Thịt lợn chợ Cầu Giấy AMOZ AHD SEM AOZ 6 Thịt bò chợ Cầu Giấy AMOZ AHD SEM AOZ 7 Thịt lợn chợ Ngọc Hà AMOZ AHD SEM AOZ 8 Thịt gà chợ Ngọc Hà AMOZ AHD SEM 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 KPH 0,99 KPH 1,05 KPH 1,03 KPH 1,09 KPH 0,88 KPH 0,97 KPH 0,75 KPH 0,69 KPH 1,02 KPH 0,79 KPH 1,01 KPH 1,03 KPH 0,92 KPH 0,88 KPH 0.79 KPH 1,06 KPH 1,05 KPH 1,11 KPH 0,98 KPH 0,67 KPH 0,76 KPH 0,82 KPH 0,97 KPH 0,73 99 105 103 109 88 97 75 69 102 79 101 103 92 88 79 106 105 110 98 67 76 82 97 73 KPH: không phát hiện < LOD của phương pháp, R %: Phần trăm độ thu hồi. Bàn luận: Qua quá trình phân tích một số mẫu thực trên địa bàn Hà Nội, không phát hiện mẫu nào có chứa các chất nhóm nitrofuran. Độ thu hồi hầu hết các chất từ 67 – 112% đáp ứng đươ ̣c qui đinh ̣ của Châu Âu 2002/657/EC. Từ kế t quả đô ̣ thu hồ i này cho thấ y có thể mở rô ̣ng phương pháp cho các sản phẩ m thực phẩ m tươi số ng khác. 3.4 Hƣớng phát triển của đề tài Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định được dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS trong một số mẫu thực phẩm tươi sống (thịt gà, thịt lợn, thịt bò, gan). Phương pháp còn có thể được mở rộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau như: thức ăn chăn nuôi, mẫu sinh học, mẫu sữa…Vì vậy rất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển phương pháp và áp dụng phu ̣c vu ̣ phân tić h mẫu vào thực tiễn. KẾT LUẬN Trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng kỹ thuâ ̣t sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS để tách và xác định các kháng sinh nhóm nitrofuran trong mẫu thực phẩm tươi sống, chúng tôi đã thu được các kết quả sau: 1. Đã nghiên cứu được các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ để xác định 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran bao gồm: - Khảo sát được các điều kiện đo phổ khố i (thế phân nhóm (DP), năng lượng va chạm (CE)..) để thu được các ion khố i đặc trưng của từng chất nitrofuran. - Khảo sát cho ̣n được các điều kiện sắc ký lỏng: cột sắc C18 Agilent (150mm × 2,1mm × 3,5µm); pha động với kênh A amoniacetat 10mM trong nước và kênh B là metanol; chương trình rửa giải gradient. 2. Đã khảo sát được điều kiện tách và làm sạch các nitrofuran ra khỏi nền mẫu thịt lợn bằng chiết pha rắn với cột chiết oasis HLB. 3. Đã thẩm định các thông số của phương pháp bao gồm: - Khoảng tuyến tính: trong khoảng từ 0,5 – 5 µg/kg với hệ số tương quan tuyến tính R2 > 0,996. - Giới hạn phát hiện AOZ (0,100 µg/kg), AMOZ (0,119 µg/kg), AHD (0,223 µg/kg), SEM (0,378 µg/kg), đáp ứng yêu cầu về độ nhạy để phân tích các chấ t nhóm nitrofuran. - Độ thu hồi trung bình từ 80,5 – 106% cho thấy phương pháp có độ đúng tốt. - Độ lệch chuẩn tương đối thấp (RSD% < 13,7%) cho thấy phương pháp có độ lặp lại và chính xác cao. 4. Đã ứng dụng phương pháp để phân tích các mẫu thực phẩm tại các chợ trên địa bàn Hà Nội, cho thấy phương pháp có thể ứng dụng để phân tích xác đinh ̣ d ẫn xuất nhóm nitrofuran trong thực phẩm tươi sống. References Tiếng Việt 1. Nguyễn Quố c Ân (2009), Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y ở Viê ̣t Nam , Cục thú y. 2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 3. Nguyễn Đức Huệ (2005), Các phương pháp phân tích Hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội. 4. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC),Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 5. Nguyễn Đình Thành (2011), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 6. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 7. Bùi Thị Tho (2003), Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi, Nhà xuất bản Hà Nội. 8. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 9. Số 54/2002/QĐ-BNN, ngày 20 tháng 06 năm 2002 về việc cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 10. 28 TCN 194:2004,Các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản – Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ - khối phổ, Bộ Thủy Sản. 11. Trang web (2008), http//vietbao.vn/Kinh-te/My-kiem-tra-thuy-san-nuoi-Trung-QuocViet-Nam-lo-ngai/55154852/93. Việt Báo Tiếng Anh 12. Alexander Leitner, Peter Zollner, Wolfgang Lindner (2001),“Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, Volume 939, pp. 49-58. 13. Caroline Douny, Joelle Widart, Edwin De Pauw, Frederic sivestre, Packtrick Kestemont, Huynh Thi Tu, Nguyen Thanh Phuong (2012), Development of an analytical method to detect metabolites of nitrofurans: Application to the study of furazolidone elimination in Vietnamese black tiger shrimp (Penaeus monodon), Aquaculture, Volume 376-379, pp. 5458. 14. C. Bock, C. Stachel, P.Gowik (2007), Validation of a confirmatory method for the determination of residues of four nitrofurans in egg by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with the software interval, Analytica Chimica Acta, Volume 586, pp. 348-358. 15. C. Chang, D.P. Peng, J.E. Wu, Y.L. Wang, Z.H. Yuan (2008), Development of an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in animal edible tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.53, pp 8934-8939. 16. Chung-Wei Tsai, chuan-ho tang and Wei-Hsien wang (2010), “Quantitative Determination of Four Nitrofurans and Corresponding Metabolites in the Fish Muscle by Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry”, Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 18, No. 2, pp. 98-106. 17. D. Tyler (2009), Analysis of nitrofurans in animal tissues a food of animal origin by LC/MS/MS, sop FSG341. 18. E. Horne, A. Cadogan, M. OKeeffe, Hoogenboo, L.A.P. (1996), Analysis of proteinbound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high performance liquid chromatography and liquid chromatography mass spectrometry. Analyst, Vol.121, 14631468. 19. E. Verdon, P. Couedor, P. Sanders (2007), Multi-residue monitoring for the simultaneous determination of five nitrofurans (furazolidone, furaltadone, nitrofurazone, nitrofurantoine, nifursol) in poultry muscle tissue through the detection of their five major metabolites (AOZ, AMOZ, SEM, AHD, DNSAH) by liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry – Inhouse validation in line with Commission Decision 657/2002/EC. Analytica Chimica Acta, Vol.586, pp 336-347. 20. I. Diblikova, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, M. Franek (2005), Monoclonal antibodybased ELISA for the quantification of nitrofuran metabolite 3-amino-2-oxazolidinone in tissues using a simplified sample preparation. Analytica Chimica Acta, Vol.540, 285-292. 21. K.M. Cooper, P.P. Mulder, van Rhijn J.A. van Rhijn, L. Kovacsics, R.J. McCracken, P.B. Young, D.G. Kennedy (2005), Depletion of four nitrofuran antibiotics and their tissue-bound metabolites in porcine tissues and determination using LC-MS/MS and HPLC-UV. Food Additives and Contaminants, pp 405-414. 22. Lech Rodziewicz (2008), Determination of nitrofuran metabolites in milk by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal of chromatography, Vol.864, pp. 156-160. 23. Mayda I.Lopez (2007), “Determination and confirmation of Nitrofuran residues in honey using LC-MS/MS”, Journal of agricultural and food chemistry, Vol.55, pp. 1103-1108. 24. M. O’Keeffe , A. Conneely, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, L. Kovacsics, A. Fodor, P.P.J. Mulder, J.A. van Rhijn, G. Trigueros (2004), Nitrofuran antibiotic residues in pork the FoodBRAND retail survey. Analytical Chimica Acta, Vol.520, 125-131. 25. M. Vass*, K. Hruska, M. Franek (2008), “Nitrofuran antibiotics: a review on the application, prohibition and residual analysis”, Veterinarni Medicina, Vol.53, pp. 469–500. 26. Pascal Mottier, Seu-Ping Khong, Eric Gremaud, Janique Richoz, Thierry Delatour, Till Goldmann, Philippe A.Guy (2005), Quantitative determination of four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry, Journal of chromatography A, Volume 1067, pp. 85-91. 27. P. Vinas, N. Campillo, L. Carrasco, M. Hernandez-Cordoba (2007), Analysis of nitrofuran residues in animal feed using liquid chromatography and photodiode-array detection, Chromatographia, Vol.65, pp. 85-89. 28. Randox laboratory (2008), “Measurement of four nitrofuran metabolites with elisa kits using multi-analyte reagents”, Randox life sciences. 29. Sujittra Phongvivat, Bangkok, Thailand (2004), “Nitrofurans Case Study: Thailand’s experience”, Joint FAO/WHO Technical Workshop on, Residues of Substances without ADI/MRL in Food. 30. Tao Ding, Jingzhong Xu, Chongyu Shen and Kefei Wang (2007), “Determination of trace level nitrofuran metabolites in crawfish meat by electrospray LC-MS/MS on the TSQ quantum discovery MAX, Thermo fisher scientific, San Jose, CA, USA. 31. W. Lui, C. Zhao, Y. Zhang, S. Lu, J. Liu, R. Xi (2007), Preparation of polyclonal antibodies to a derivative of 1-amonihydantoin (AHD) and development of an indirect competitive ELISA for the detection of nitrofurantoin residue in water. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Vol.55, 6829-6834. 32. 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results.