Tài liệu Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong đỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Mỹ Trâm XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE DẠNG AGAR CHIẾT TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG ĐỎ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Nha Trang - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Mỹ Trâm XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE DẠNG AGAR CHIẾT TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG ĐỎ Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1 Hướng dẫn 2 PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân PGS. TS. Thành Thị Thu Thủy Nha Trang – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “ Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong Đỏ” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn của PGS. TS Trần Thị Thanh Vân - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và PGS. TS Thành Thị Thu Thủy – Viện Hóa học. Đây không phải là bảng sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do chúng tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này. Nha Trang, ngày 29 tháng 9 năm 2019 HỌC VIÊN Bùi Thị Mỹ Trâm LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn “Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong Đỏ”. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS.TS-Trần Thị Thanh Vân – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và Cô PGS. TS – Thành Thị Thu Thủy – Viện Hóa học Việt Nam đã hết lòng truyền đạt kiến thức khoa học và kinh nghiệm, hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trên con đường nghiên cứu khoa học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ về cơ sở vật chất, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, kiến thức thực nghiệm để tôi hoàn thành tốt đề tài của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng đào tạo đã giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn các bạn học cùng lớp cao học đã luôn đồng hành với tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn gia đình, người thân, đặc biệt là các bạn đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, chia sẻ những khó khăn với tôi trong cuộc sống và trong công việc. Và cuối cùng, xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, trường THPT Lý Tự Trọng - Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa học sau đại học tại Viện Hóa học này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 29 tháng 9 năm 2019 Bùi Thị Mỹ Trâm 1 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................... LỜI CẢM ƠN ............................................................................................. MỤC LỤC................................................................................................. 1 DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................... 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................... 6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................. 10 1.1. RONG ĐỎ ................................................................................... 10 1.1.1. Giới thiệu và phân loại rong Đỏ ........................................... 10 1.1.2. Giới thiệu một số loài rong Đỏ ở Việt Nam: Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia ........................................... 12 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ POLYSACCHARIDE DẠNG AGAR ............................................................................................................. 15 1.2.1. Nguồn gốc, tính chất gel và ứng dụng .................................. 15 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc ................................................................. 20 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE ........................................................................ 22 1.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ....................................... 24 1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .............. 25 1.3.3. Phương pháp phổ hai chiều HSQC, HMBC, COSY ............ 29 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AGAR TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI ........................................................................................... 30 1.4.1. Tình hình nghiên cứu agar trên thế giới ............................... 30 1.4.2. Tình hình nghiên cứu agar trong nước ................................. 37 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 39 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................... 39 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 41 2.2.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide dạng agar ............... 41 2 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của polysaccharide dạng agar ................................................................ 42 2.2.2.1. Xác định hàm lượng Carbohidrate ................................ 42 2.2.2.2. Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactopyranose .. 42 2.2.2.3. Xác định độ ẩm của rong ............................................... 43 2.2.2.4. Xác định hàm lượng sulfate ........................................... 43 2.2.2.5. Xác định hàm lượng Agarose ........................................ 43 2.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc polysaccharide dạng agar . 44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................... 45 3.1. CHIẾT POLYSACCHARIDE VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH ............................................................................. 45 3.1.1. Kết quả của việc chiết polysaccharide và phân tích thành phần hóa học ................................................................................... 45 3.1.2. Kết quả của tính chất gel....................................................... 51 3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ 02 LOÀI RONG GRACILARIA SALICORNIA VÀ GRACILARIA HETEROCLADA................................................................................. 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................... 81 4.1. KẾT LUẬN .................................................................................. 81 4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................. 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 83 3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A A’ AOAC COSY DEAE-C DG DG6M DMSO DSS FTIR G G’ HMBC HSQC LA Me NMR NOESY TMS UV-VIS 2OMeA’ 6OMeG’ : [→4)3,6-anhydro-α-L-galactose (1→] : [→4)2-O-Me-3,6-anhydro-α-L-galactose (1→] : Association of Official Analytical Chemists ( Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống) : Corelation Spectroscopy (phổ tương tác proton) : Diethylaminoethyl cellulose : β – D-galactose : 6-O-Me-β-D-galactose : Dimethyl sulfoxit (CH3)2SO : Acid 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic : Fourier Transform Infrared spectroscopy ( quang phổ hồng ngoại biến đổi) : [→3) β-D-galactose (1→] : [→3)6-O-Me-β-D-galactose (1→] : Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ tương tác dị nhân qua nhiều liên kết) : Heteronuclear Single Quantum Correlation (phổ tương tác dị nhân qua một liên kết) : 3,6-anhydro-α-L-galactose : Methyl : Nuclear Magnetic Resonance ( phổ cộng hưởng từ hạt nhân) : Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy ( phổ hiệu ứng hạt nhân ) : Tetramethylsilane (Si(CH3)4) : Ultraviolet and Visible ( phổ tử ngoại và khả kiến) : nhóm methyl của 2-O-Me-3,6-anhydro-α-L-galactose : nhóm methyl của 6-O-Me-β-D-galactose 4 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Số liệu từ quá trình chiết tách polysaccharide ....................... 45 Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang tương ứng với nồng độ fructozo .......... 47 Bảng 3.3. Thành phần hóa học của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ Gracilaria Heteroclada và rong Gracilaria Salicornia ......................... 49 Bảng 3.4. Bảng thông số thể hiện khả năng tạo gel của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia.................................. 52 Bảng 3.5. Một số dao động đặc trưng của các nhóm nguyên tử và các liên kết trong agar .................................................................................. 54 Bảng 3.6. Một số số sóng đặc trưng trong phổ trong phổ hồng ngoại (IR) của 02 mẫu agar chiết từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia .............................................................................. 56 Bảng 3.7. Tỉ lệ các cường độ hấp thụ của các cặp tần số ....................... 57 Bảng 3.8. Tỉ lệ các cường độ hấp thụ của cặp tần số 930/2920 ............. 58 Bảng 3.9. Các dạng cấu trúc agar ........................................................... 60 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 13C NMR của polysaccharide chiết từ loài rong Gracilaria Salicornia .............................................................. 61 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia ................................................................. 62 Bảng 3.12. Tín hiệu phổ COSY của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia .............................................................................. 65 Bảng 3.13. Tín hiệu phổ HSQC của agar chiết kiềm từ rong Gracilaria Salicornia ................................................................................................ 65 Bảng 3.14. Tín hiệu phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia .............................................................................. 66 Bảng 3.15. Kết quả phân tích phổ 13C NMR của polysaccharide chiết từ loài rong Gracilaria Heteroclada ........................................................... 71 Bảng 3.16. Kết quả phân tích phổ 1H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada .............................................................. 73 5 Bảng 3.17. Tín hiệu phổ COSY của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada .......................................................................... 76 Bảng 3.18. Tín hiệu phổ HSQC của agar chiết kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada ............................................................................................. 77 Bảng 3.19. Tín hiệu phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada .......................................................................... 79 6 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Biểu đồ so sánh các ngành rong trên Thế giới ....................... 10 Hình 1.2. Hình ảnh của rong Gracilaria Heteroclada ........................... 13 Hình 1.3. Hình ảnh của rong Gracilaria Salicornia ............................... 14 Hình 1.4. Cơ chế geling của agar ........................................................... 18 Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của Agarose ................................................ 21 Hình 1.6. Cấu trúc của phân tử Agaropectin ......................................... 22 Hình 2.1. Đầm Cù Mông – Xuân Đài – Phú Yên ................................... 39 Hình 2.2. Hình ảnh bản đồ Hòn Chồng – Nha Trang – Khánh Hòa ...... 39 Hình 2.3. Sơ đồ sơ chế rong và lưu giữ mẫu .......................................... 40 Hình 2.4. Quy trình chiết tách agar cơ bản ............................................ 41 Hình 3.1. Hình ảnh nấu chiết agar từ rong Đỏ tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang ....... 45 Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng agar chiết theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia .............................................................................. 46 Hình 3.3. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng - nước bắt đầu đạt nhiệt độ 80oC ..................................................................................... 48 Hình 3.4. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố định 80oC sau 5 phút ............................................................................... 48 Hình 3.5. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố định 80oC sau 10 phút ............................................................................. 48 Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn Nồng độ (µmol/mL) – Mật độ quang .... 47 Hình 3.7. Phản ứng chuyển hóa của porphyran sang agarose .............. 50 Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết agarose theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia .............................................................................. 51 Hình 3.9. Biểu đồ so sánh sức đông của agar chiết theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia .............................................................................. 52 7 Hình 3.10. Phổ IR của agar từ Gracilaria Heteroclada ......................... 55 Hình 3.11. Phổ IR của agar từ Gracilaria Salicornia ............................ 56 Hình 3.12. Phổ 13C NMR của rong Gracilaria Salicornia ..................... 61 Hình 3.13. Phổ 1H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia ................................................................................................ 62 Hình 3.14. Phổ HSQC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia ................................................................................................ 63 Hình 3.15. Phổ COSY của agar có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia ................................................................................................ 64 Hình 3.16. Phổ 0 của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia ................................................................................................ 67 Hình 3.17. Cấu trúc phân đoạn agarose ................................................. 68 Hình 3.18. Phổ 13C NMR của rong Gracilaria heteroclada .................... 69 Hình 3.19. Phổ 13C NMR mở rộng của rong Gracilaria Heteroclada ... 70 Hình 3.20. Phổ 1H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada ............................................................................................. 72 Hình 3.21. Phổ 1H NMR mở rộng của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada .......................................................................... 72 Hình 3.22. Phổ HSQC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada ............................................................................................. 74 Hình 3.23. Phổ HSQC mở rộng của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada .......................................................................... 75 Hình 3.24. Phổ COSY của agar có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada ............................................................................................. 76 Hình 3.25. Phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Heteroclada ............................................................................................. 78 Hình 3.26. Cấu trúc phân đoạn agarose ................................................. 80 Hình 3.27. Cấu trúc phân đoạn agaropectin .......................................... 80 8 MỞ ĐẦU Rong biển là nguồn các hoạt chất sinh học bao gồm carotenoid, các acid béo, vitamin, muối khoáng ….[1]. Trong số các hoạt chất sinh học trên thì polysaccharide là chất thu hút các nhà nghiên cứu và nhà sản xuất thực phẩm chức năng nhất do có cấu trúc đa dạng và hoạt tính sinh học phong phú. Polysaccharide dạng agar được tách chiết từ các loài rong thuộc ngành rong Đỏ (Agarophyte). Nhờ khả năng tạo gel đặc biệt và hoạt tính oxi hóa cao mà nó được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghệ chế biến thực phẩm, nông nghiệp, y dược và công nghệ sinh học. Nguyên liệu chủ yếu để chế biến agar trên thế giới là các loài rong thuộc họ Gracilariales (Gracilaria và Hydropuntia) chiếm 60% sản lượng nguyên liệu và họ Gelidiales (Gelidium và Pterocladia) chiếm 40% sản lượng nguyên liệu [2]. Đã có nhiều công trình công bố về cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số loài rong Agarophytes tại các vùng biển khác nhau trên thế giới. Kết quả cho thấy tùy theo loài và vị trí địa lý nơi rong sinh sống mà cấu trúc hóa học, tính chất gel và hoạt tính sinh học của polysaccharide chiết từ các loài rong là rất khác nhau. Tuy nhiên hầu như tất cả các polysaccharide dạng agar đều thể hiện một số hoạt tính sinh học như kháng u, kháng khuẩn và chống oxi hóa [3], [4], [5], [6]. Vùng biển nước ta có nguồn tài nguyên rong biển Agarophytes hết sức phong phú. Chúng gồm tất cả các loài rong thuộc chi Gracilaria và một vài loài thuộc chi Hydropuntia và Gelidiella. Đặc điểm hóa học, tính chất gel và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các polysaccharide chiết từ các loài rong thuộc chi Hydropuntia , Gracilaria và Gelidiella đã được công bố [7], [8] [9]. Tuy nhiên chưa có công trình nghiên cứu về polysaccharide từ rong Gracilaria Heteroclada (rong câu cước) và Gracilaria Salicornia, mặc dù đây là các loài rong phân bố rộng rãi ở vùng biển miền Trung và đã được dân ven biển thương mại hóa để làm thực phẩm với các hình thức khác nhau. Do vậy chúng tôi chọn đề tài “ Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar từ một số loài rong Đỏ”, với mục tiêu nghiên cứu chiết tách, xác định đặc trưng cấu trúc, và hơn thế nữa là để góp phần định hướng cho việc sử 9 dụng trong công nghiệp với những điều kiện như thế nào để đạt được hiệu quả cao nhất từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada, và rong Gracilaria Salicornia từ quá trình khảo sát tính chất gel của polysaccharide chiết tách từ loài rong này. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu đặt ra, chúng tôi đặt ra các nội dung nghiên cứu cụ thể là: 1. Thu thập và định danh rong Đỏ Gracilaria Salicornia và Gracilaria Heteroclada. 2. Chiết tách, tinh chế polysaccharide từ các loài rong này. 3. Nghiên cứu đặc trưng cấu trúc của polysaccharide thu được. 4. Khảo sát tính chất gel của polysaccharide thu được. 10 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. RONG ĐỎ 1.1.1. Giới thiệu và phân loại rong Đỏ Rong biển là một nhóm thực vật thủy sinh bậc thấp, có kích thước và hình dạng rất phong phú. Chúng còn được gọi là seaweed, marine algae hay marine plant. Rong biển sống thành quần thể ở biển hoặc vùng nước lợ ven biển, mọc trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, hoặc có thể mọc dưới tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. Rất đặc biệt so với nhóm thực vật bậc cao, toàn bộ cơ thể của rong có chung một chức năng tự dưỡng, có khả năng quang hợp, hô hấp, trao đổi khí và hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường. Các bộ phận của rong biển như lá, thân và rễ giả của chúng chưa có chức năng riêng biệt, ví dụ như rễ chỉ là một bộ phận tế bào có nhiệm vụ đính cơ thể rong với vật bám, không hút được chất dinh dưỡng ở vật bám, thân và lá có cùng chức năng tự dưỡng. Quá trình phát sinh không có giai đoạn phôi thai mà chỉ có hợp tử, hợp tử có khả năng phát triển độc lập với cơ thể mẹ [10]. Nhờ có chất diệp lục, rong biển thu nhận nguồn năng lượng từ ánh sáng mặt trời, carbon dioxide (CO2) và nước (H2O) để tổng hợp các chất hữu cơ thông qua quá trình quang hợp. Do có sinh khối lớn nên rong biển đã tạo ra nguồn vật chất dồi dào cho hệ sinh thái biển và lượng lớn oxygen cho sự hô hấp của con người và động vật trên cạn. Qua quá trình nghiên cứu, các nhà thực vật học đã chia giới thực vật này ra thành những bậc phân loại cơ bản sau: ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài. Trong tiến trình phát triển, phân loại học thực vật nói chung và phân loại rong nói riêng liên tục được cải tiến để ngày càng hoàn thiện hơn các phương pháp nghiên cứu và hoàn thiện dần các hệ thống phân loại [11]. Hình 1.1. Biểu đồ so sánh các ngành rong trên Thế giới 11 Có nhiều quan điểm khác nhau về cách phân loại rong biển. Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành nhiều ngành khác nhau. Trong đó, ba ngành rong chính có giá trị kinh tế cao là rong Lục (Chlorophyta), rong Nâu (Phaeophyta) và rong Đỏ (Rhodophyta) [10]. Rong Đỏ có mặt ở hầu hết các đại dương nhưng chỉ tập trung ở các vùng biển ấm nhiệt đới. Rong Đỏ khi tươi thường có màu hồng lục, hồng tím, hồng nâu, do có chứa các sắc tố phycoerythrin và phycocyanin, chlorophyll, β-carotene và một số xanthophyll. Mức độ màu sắc của rong phụ thuộc vào sự phối hợp về tỷ lệ và thành phần giữa các sắc tố này. Điểm khác biệt với hầu hết các loài rong khác là rong Đỏ có sắc tố phycobilin gồm hai sắc tố phycoerythrin và phycocyanin. Thường phycoerythrin chiếm ưu thế hơn phycocyanin ở hầu hết các loài. Rong Đỏ thường có màu sắc rực rỡ ở những loài sống ở vùng dưới triều hoặc ở vùng bị che bóng. Ngay trong một loài, theo chiều phân bố thẳng đứng, rong cũng thay đổi màu tùy theo chất lượng ánh sáng tới chúng [12]. Khi khô tùy theo phương pháp chế biến, rong chuyển sang màu nâu hay nâu vàng đến vàng [13]. Ngành rong Đỏ có khoảng 2.500 loài, gồm 400 chi thuộc nhiều họ khác nhau, phần lớn chúng được cấu tạo từ nhiều tế bào, còn lại được cấu tạo bởi dạng một tế bào hay quần thể. Phần lớn rong Đỏ sống ở biển sâu, nơi có thủy triều thấp [10], [13]. Trên thế giới, rong Đỏ được sử dụng với khối lượng lớn để phục vụ cuộc sống con người tùy vào thành phần mà nó cung cấp. Cụ thể, một số loài có hàm lượng cao về agar, carrageenan, furcellaran được sử dụng để chế biến keo rong biển. Các loài rong Đỏ được chia thành các nhóm chính [13]: - Nhóm rong cho agar (Agarophite): Bao gồm các chi như Gelidium, Gracilaria, Gelidiella, ... - Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophite): Bao gồm các chi như Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea... Ngoài ra, còn có nhóm rong furcellaran (Gelan): điển hình của nhóm này là Furcellaria. 12 Tại Việt Nam, có khoảng 827 loài rong biển đã được báo cáo, trong đó, ngành rong Đỏ Rhodophyta chiếm số loài cao nhất (412 loài), tiếp theo là rong Lục (180 loài), rong Nâu Phaeophyceae (147 loài) và cuối cùng là vi tảo Cyanobacteria (88 loài). Số loài này ít hơn so với Philippines (1011 loài), nhưng nhiều hơn so với Đài Loan (288 loài), Thái Lan (182 loài) và Malaysia (241 loài) [14]. Các loài rong Đỏ chứa agar hiện có ở Việt Nam khoảng 51 loài. Chúng thuộc các chi Gracilaria (12 loài), Gracilariopsis (2 loài), Hydropuntia (6 loài), Gelidium (9 loài), Gelidiella (5 loài), Pterocladia (4 loài), Hypnea (13 loài) ... Trong đó, nhiều loài có tiềm năng khai thác và nuôi trồng [15]. Các tỉnh thuộc khu vực miền Trung Việt Nam như Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận ... có bờ biển dài với đa dạng các kiểu thủy vực như đầm, phá, cửa sông, vũng, vịnh và các loài nền đáy khác nhau như nền đáy cát, sỏi, đá tảng, san hô chết ... rất thuận lợi cho các loài rong sinh trưởng và phát triển, đặc biệt là các loài rong Đỏ [14]. 1.1.2. Giới thiệu một số loài rong Đỏ ở Việt Nam: Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia Cả hai loại rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia đều thuộc chi rong Câu – Gracilaria, họ Gracilariaceae, bộ Gracilariales, lớp Florideophyceae, ngành rong Đỏ - Rhodophyta. Hai loại rong này được đánh giá là có giá trị kinh tế lớn, đang được các ngành tập trung nghiên cứu để khai thác tiềm năng. Chúng có thể được sử dụng ở cả hai dạng khô và tươi. 1.1.2.1. Gracilaria Heteroclada Gracilaria Heteroclada có tên tiếng Việt là rong câu cước, được phát hiện bởi J.F.Zhang và B.M.Xia năm 1988. Gracilaria Heteroclada phân bố ở vùng pH trung tính (pH từ 7 -8). Các thủy vực nơi có xuất hiện của rong có độ mặn dao động trong khoảng 20-27 ppt. Rong Gracilaria Heteroclada có sinh khối lớn, sinh trưởng tốt vào giai đoạn từ tháng 4 đến tháng 6, chúng có thể phát triển trong ao nước lợ và đầm phá, cũng như ở các bãi dưới triều trên nền đất đá, phát triển tốt vào mùa đông - xuân. Loài rong này được sử dụng dạng tươi lẫn dạng khô. 13 Trồng Gracilaria Heteroclada bắt đầu ở Việt Nam vào cuối những năm 80 của thế kỷ trước. Rong này bắt gặp trong tự nhiên (miền Trung Việt Nam) ở hai dạng: sinh sản hữu tính và vô tính, cũng như nhân bản vô tính. Dạng thứ nhất của Gracilaria phát triển ở vùng biển, trên nền đáy cứng, trong vùng triều, dạng thứ hai - trong các đầm phá nước lợ, trên đáy cát và bùn, thường ở dạng không bám. Hình 1.2. Hình ảnh của rong Gracilaria Heteroclada Trồng Gracilaria Heteroclada tại các tỉnh miền Trung và miền Nam chủ yếu ở các tỉnh Phú Yên và Bà Rịa Vũng Tàu. Những loài này của Gracilaria không chỉ trồng thâm canh và bán thâm canh, mà còn nuôi ghép với tôm. Rong giống rải trên đáy cát hay bùn. Rong phát triển nhanh nhất ở độ mặn 25 - 30 ‰ và ở nhiệt độ 26 – 32oC với tốc độ 5-7%/ngày. Độ mặn thấp hơn 20‰ và nhiệt độ cao hơn 34oC thì sự tăng trưởng bị kìm hãm (Phạm Văn Huyên,1998). Nếu độ mặn ở các vùng đầm phá trong năm không giảm xuống dưới 20 ‰, thì Gracilaria Heteroclada có thể trồng được quanh năm. Rong được trồng trong ao nuôi tôm làm gia tăng thu hoạch cả tảo và động vật giáp xác. Hiện nay, Gracilaria Heteroclada trồng khoảng 100 ha. Năng suất là 1,5 - 2,0 tấn khô/ ha. Rong biển này được trồng chủ yếu để sản xuất agar thực phẩm chất lượng cao. 14 1.1.2.2. Gracilaria Salicornia Gracilaria Salicornia lần đầu tiên được phát hiện ở bến cảng Hawaii và các khu vực lân cận (Smith Hunter và Smith 2002). Hình 1.3. Hình ảnh của rong Gracilaria Salicornia Gracilaria Salicornia thay đổi màu sắc từ màu vàng sáng ở đầu đến màu cam, xanh lá cây hoặc nâu ở gốc. Thân có dạng hình trụ (đường kính 0,5 cm) và phân nhánh nhị phân với các co thắt ở đáy của mỗi nhị phân. Ở Hawai, nó thường phát triển rất mạnh ở mọi địa hình, bám chặt vào lớp nền cứng và có thể dày tới 25-40 cm; trong môi trường tĩnh, nó có thể phát triển ở dạng thẳng đứng và phân nhánh dễ dàng hơn, phát triển khá tự do. Gracilaria Salicornia sinh sản chủ yếu thông qua sự phân nhánh và nhân giống tự nhiên (Smith Pers. Comm. 2003). Gracilaria Salicornia mọc trên đất đá, trên san hô chết ở những khu vực bãi triều và dưới triều vào mùa xuân và đầu mùa hè. Ở vùng nhiệt đới, Gracilaria Salicornia có thể gây ra mối đe dọa đối với cả môi trường sống san hô và sinh vật biển (Smith Hunter và Smith 2002) vì nó phát triển với quy mô rộng. Một vài nghiên cứu đã được thực hiện về hệ sinh thái của Gracilaria Salicornia ở các phạm vi khác nhau. Và các nhà nghiên cứu đã rút ra được rằng hình thái hình thành thảm độc đáo của Gracilaria Salicornia dễ dàng thích nghi và chịu được nhiều điều kiện ánh sáng khác nhau (Beach et al. 1997, trong Smith et al. 2004). Ngoài ra, nó cũng thích nghi với những loại chất dinh dưỡng khác nhau (Larned 1998, trong Smith et al. 2004). Dựa trên các thí nghiệm điều tra thì rong Gracilaria 15 Salicornia có thể chịu đựng các môi trường sống vô cùng khắc nghiệt. Nếu nhiệt độ nước biển hơn 41oC cùng với dung dịch muối bão hòa 75% hay 50%, Gracilaria Salicornia mới có thể chết (Smith et al. 2004). Khả năng chịu đựng này cho phép Gracilaria Salicornia phát triển mạnh trong các điều kiện từ nước ngọt đến nước biển, nhiệt độ chịu đựng được dao động từ dòng chảy nước mát đến cả các khu vực ấm (Smith et al. 2004). Với sức sống mãnh liệt như vậy, Gracilaria Salicornia thậm chí có thể đe dọa các rạn san hô và các sinh vật đáy ở Hawaii cũng như các nơi khác. Bởi vì nó có thể làm giảm sự đa dạng hoặc thay đổi cấu trúc các loài sinh vật biển. Trong nhiều trường hợp, Gracilaria Salicornia trở nên chiếm ưu thế về mặt sinh thái và phát triển trên các rạn san hô, làm giảm số lượng và giá trị của các rạn san hô (Hughes 1994, trong Smith Hunter và Smith 2002). Ví dụ, tại các khu vực của Hawaii như Waikiki, Gracilaria Salicornia đã trở thành loài sinh vật đáy chiếm phần diện tích lớn nhất trong khi ở khu vực này, trước đây có hơn 60 loài tảo khác nhau sinh sống (Doty 1969, trong Smith et al. 2004). Gracilaria Salicornia sinh sản chủ yếu thông qua sự phân nhánh và nhân giống tự nhiên (Smith Pers. Comm. 2003). Chính vì vậy, việc sử dụng được loại rong này trong công nghệ thực phẩm sẽ phần nào giải quyết được những vấn đề về môi trường mà các nhà khoa học quan tâm, đồng thời đem lại những giá trị vô cùng to lớn về cả kinh tế và sức khỏe cộng đồng. 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ POLYSACCHARIDE DẠNG AGAR 1.2.1. Nguồn gốc, tính chất gel và ứng dụng 1.2.1.1. Nguồn gốc Agar là chất dinh dưỡng được rong Đỏ tích lũy theo thời gian sinh trưởng, dưới dạng polymer phức tạp liên kết với các ion khoáng có trong cây rong [13]. Agar hay còn gọi là agar-agar, là phycocolloid có nguồn gốc cổ xưa nhất (giữa thế kỷ XVII). Tại Nhật Bản, agar được phát hiện bởi Minoya Tarozaemon năm 1658 [16]. Tuy nhiên, tên agar-agar lại xuất phát tại Malaysia. Ngoài ra, agar còn được gọi là kanten (Nhật Bản), dongfen (Trung Quốc), gelose (các nước nói tiếng Pháp và Bồ Đào Nha) [17]. 16 Agar có thể được chiết xuất từ các loài rong nhóm Agarophyte thuộc các chi khác nhau như: Gelidium (Gelidium sesquipedale, Gelidium amansii, Gelidium robustum ...), Gracilaria (Gracilaria chilense, Gracilaria tenuistipitata, Gracilaria edulis, Gracilaria acerosa ...), Gracilariopsis (Gracilariopsis lamaneiformis, Gracilariopsis sjostedtii... [18]. 1.2.1.2. Tính chất gel Agar là một chất vô định hình, dạng gel không màu, không vị, dạng bột hoặc dạng sợi có màu trắng hoặc trắng ngà. Agar không tan trong nước lạnh, trương phồng đáng kể trong nước, hòa tan trong nước nóng và khi làm nguội thì đông lại tạo thể gel khối có tính đàn hồi. Agar kết tủa trong ethanol, trong acetone, amylic alcohol. Agar có khả năng tạo gel khi để nguội hay khi làm lạnh dung dịch. Khác với carragenan và alginate, gel agar không cần dùng các ion tạo gel [13], [17]. Một số tính chất đặc biệt của agar là có khả năng hình thành gel một cách thuận nghịch với nhiệt độ (hình 1.4) và sự trễ nhiệt tạo gel (gelation hysteresis) –sự khác biệt lớn giữa nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ tạo gel. Agar từ các loài rong khác nhau thì tính chất gel chịu ảnh hưởng bởi những nhiệt độ khác nhau. Agar từ Gelidium đông đặc khoảng từ 28oC đến 31oC và nhiệt độ tan chảy từ 80oC đến 90oC. Agar từ Gracilaria đông đặc ở nhiệt độ khoảng từ 29oC đến 42oC và tan chảy ở nhiệt độ từ 76oC đến 92oC. Hàm lượng methoxy ảnh hưởng đến nhiệt độ tạo gel của agar. Khi hàm lượng methoxy trong agarose Gracilaria tăng, nhiệt độ tạo gel tương ứng cũng tăng lên [17]. Ở thể gel, agar có thể chịu lực (sức đông). Đây là một số thông số chất lượng quan trọng của gel agar. Các yếu tố ảnh hưởng đến sức đông gel agar là loài rong môi trường sinh thái, thời gian thu hoạch và phương pháp xử lý rong. Agar có thể bị thủy phân cắt mạch khi gặp các yếu tố thủy phân như acid, kiềm, enzyme. Từ tính chất này, cần đặc biệt lưu ý khi cho rong tiếp xúc với môi trường acid hay kiềm, nhiệt độ cao trong quá trình gia công xử lý, nấu chiết và tẩy trắng. Khi hòa tan, agar tạo dung dịch có độ nhớt cao, có tính keo. Độ nhớt của các dung dịch agar thay đổi phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và các điều kiện chiết xuất agar [13].