Tài liệu Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại hải phòng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ TÂM XÁC ĐỊNH BỆNH VIRUS HẠI ĐẬU ĐỖ TẠI HẢI PHÒNG Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60 62 01 12 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hà Viết Cường NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Tâm i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Hà Viết Cường, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, khuyến khích em nỗ lực trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy, cô giáo bộ môn Bệnh cây – Khoa Nông Học – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Kiểm dịch thực vật Vùng 1 – Hải Phòng, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và đóng góp cho em những ý kiến quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành đề tài này. Em xin gửi lời cảm ơn tới các bà con nông dân đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Tâm ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục .......................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ............................................................................................................... viii Trích yếu luận văn ........................................................................................................... ix Thesis abstract................................................................................................................... x Phần 1. Mở đầu .............................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ............................................................................................................ 2 1.3. Yêu cầu .............................................................................................................. 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................ 3 2.1. Tầm quan trọng của một số cây họ đậu ............................................................. 3 2.2. Đặc điểm chung chi Begomovirus ..................................................................... 5 2.2.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 5 2.2.2. Cấu trúc genome của Begomovirus ................................................................... 5 2.2.3. Cấu trúc của phân tử DNA-A ............................................................................ 6 2.2.4. Cấu trúc của phân tử DNA-B............................................................................. 7 2.2.5. Phân loại các Begomovirus................................................................................ 8 2.2.6. Triệu chứng bệnh do Begomovirus ................................................................... 8 2.2.7. Phạm vi ký chủ .................................................................................................. 8 2.2.8. Lan truyền .......................................................................................................... 8 2.3. Một số virus quan trọng trên cây họ đậu ........................................................... 9 2.3.1. Bean common mosaic virus (BCMV) ............................................................... 9 2.3.2. Soybean mosaic virus (SMV) .......................................................................... 13 2.3.3. Kudzu mosaic virus (KuMV) .......................................................................... 16 2.3.4. French bean seavere leaf curl virus (FbSLCV) ............................................... 17 Phần 3. Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu ......................................... 18 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................. 18 iii 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 18 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 18 3.1.3. Thời gian nghiên cứu: 2016-2017 ................................................................... 18 3.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 18 3.3. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 18 3.3.1. Mẫu bệnh cây, cây thí nghiệm ......................................................................... 18 3.3.2. Các dòng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của KuMV và FbSLCV ........................................................................ 18 3.3.3. Dụng cụ nghiên cứu ......................................................................................... 19 3.3.4. Hoá chất ........................................................................................................... 19 3.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19 3.4.1. Phương pháp điều tra ngoài đồng .................................................................... 19 3.4.2. Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lá bệnh .................................................. 20 3.4.3. Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp ......................................... 20 3.4.4. Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR và RT-PCR ........................................ 21 3.4.5. Kỹ thuật Agroinoculation ................................................................................ 24 3.5. Phương pháp tính và xử lý số liệu .................................................................. 25 Phần 4. Kết quả nghiên cứu ........................................................................................ 26 4.1. Điều tra bệnh virus hại đậu đỗ tại Hải Phòng năm 2016-2017 ........................ 26 4.1.1. Tình hình sản xuất đậu đỗ tại Hải Phòng......................................................... 26 4.1.2. Điều tra bệnh virus trên đậu cove tại Hải Phòng năm 2016-2017 ................... 26 4.1.3. Điều tra bệnh virus trên đậu xanh tại Hải Phòng năm 2016-2017................... 29 4.1.4. Điều tra bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng năm 2016-2017..................... 30 4.1.5. Điều tra bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng năm 2016-2017 ................. 30 4.1.6. Điều tra bệnh virus trên đậu đũa tại Hải Phòng năm 2016-2017..................... 32 4.2. Phát hiện virus bằng Elisa trên mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 20162017 ................................................................................................................. 32 4.2.1. Phát hiện Potyvirus bằng ELISA trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng ............................................................................................................... 33 4.2.2. Phát hiện Bean common mosaic virus (BCMV) bằng ELISA trên mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng.......................................................................... 35 iv 4.2.3. Phát hiện Bean yellow mosaic virus (BYMV) bằng ELISA trên các mẫu đậu đỗ ............................................................................................................... 37 4.2.4. Phát hiện Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) bằng ELISA ....... 39 4.2.5. Phát hiện Soybean mosaic virus (SMV) bằng ELISA trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng ................................................................................ 41 4.2.6. Phát hiện Cucumber mosaic virus (CMV) bằng ELISA trên các mẫu đậu đỗ ..................................................................................................................... 43 4.2.7. Phát hiện Bean leaf roll virus (BLRV) bằng ELISA trên mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng............................................................................................ 45 4.3. Đánh giá tính gây bệnh của KuMV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật lây nhiễm bằng vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của KuMV (kỹ thuật Agroinoculation) ............................................................ 47 4.3.1. Phục hồi các dòng vi khuẩn Agrobaterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của KuMV ..................................................................................... 47 4.3.2. Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV bằng phương pháp châm hạt ủ qua đêm ......................................................................................................... 48 4.4. Đánh giá tính gây bệnh của FbSLCV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật lây nhiễm bằng vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của FbSLCV (kỹ thuật Agroinoculation)......................................................... 50 4.5. Phát hiện virus trên các mẫu đậu đỗ ................................................................ 51 4.5.1. Phát hiện Potyvirus bằng RT-PCR trên một số mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng ........................................................................................................ 51 4.5.2. Phát hiện legumovirus bằng PCR trên một số mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng ........................................................................................................ 52 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ..................................................................................... 56 5.1. Kết luận ........................................................................................................... 56 5.2. Kiến nghị.......................................................................................................... 57 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 58 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ATP Adenosine triphosphate Bb Base pair CP Coat protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay IgG Immunoglobulin gamma Kb Kilo base LB Luria and Bertani NPP Nitrophenyl phosphate ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction PTA-ELISA Plate trapped antigen - ELISA RE Restriction enzyme RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction TAE Tris – acetate – EDTA Ti-plasmid Tumor inducing plasmid β- ME Beta- Mercaptoethanol vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus đậu đỗ (Viện DSMZ) .................................. 20 Bảng 3.2. Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu ..................................................... 23 Bảng 4.1. Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu cove tại Hải Phòng 2016-2017 ......................................................................................... 28 Bảng 4.2. Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu xanh tại Hải Phòng 2016-2017 .................................................................................................... 29 Bảng 4.3. Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng năm 2016 ...................................................................................................... 30 Bảng 4.4. Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng 2017 .................................................................................................. 31 Bảng 4.5. Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu đũa tại Hải Phòng 2016-2017 .................................................................................................... 32 Bảng 4.6. Kết quả ELISA phát hiện Potyvirus trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 2016-2017 .................................................................................. 34 Bảng 4.7. Kết quả ELISA phát hiện virus BCMV trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 2016-2017 ............................................................................. 36 Bảng 4.8. Kết quả ......................................................................................................... 38 Bảng 4.9. Kết quả ......................................................................................................... 40 Bảng 4.10. Kết quả ......................................................................................................... 41 Bảng 4.11. Kết quả ......................................................................................................... 43 Bảng 4.12. Kết quả ......................................................................................................... 45 Bảng 4.13. Kiểm tra PCR đối với 2 nguồn vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu ............. 47 Bảng 4.14. Kết quả lây nhiễm agroinoculation của KuMV trên đậu tương DT26 ....... 49 Bảng 4.15. Kết quả lây nhiễm agroinoculation của KuMV trên một số cây họ đậu ...... 50 Bảng 4.16. Kết quả lây nhiễm agroinoculation của FbSLCV trên một số cây họ đậu ......... 51 Bảng 4.17. Kết quả RT-PCR phát hiện Potyvirus trên một số mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng................................................................................................ 52 Bảng 4.18. PCR phát hiện các legumovirus trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng năm 2017 .......................................................................................... 54 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình thái của Begomovirus ........................................................................... 5 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của Begomovirus ................................... 6 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus .................................................. 7 Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus .................................................. 7 Hình 2.1. Triệu chứng BCMV hại trên lá cây đậu đỗ (CABI, 2017a) ......................... 11 Hình 2.2. Triệu chứng do SMV trên đậu tương (CABI, 2017b): (A) triệu trứng trên lá, (B) triệu chứng trên hạt .................................................................... 15 Hình 2.3. Triệu chứng KuMV trên đậu tương ............................................................. 17 Hình 4.1. Triệu chứng khảm nhăn trên đậu cove tại Hải Phòng 2016-2017 ............... 27 Hình 4.2. Triệu chứng khảm vàng trên đậu cove tại Hải Phòng 2016-2017 ............... 27 Hình 4.3. Triệu chứng bệnh virus trên đậu cove 2016-2017: (A) triệu chứng xoănbiến dạng lá, (B) biểu hiện triệu chứng xoăn- biến dạng lá dữ dội hơn ........... 28 Hình 4.4. Triệu chứng bệnh virus trên đậu xanh tại Hải phòng 2016-2017: khảm nhăn (A), khảm vàng (B). ............................................................................ 29 Hình 4.5. Triệu chứng bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng: Khảm xanh (A), biến vàng (B)................................................................................................ 30 Hình 4.6. Triệu chứng bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng 2016-2017: (A) nhăn-biến dạng lá; (B) khảm; (C) khảm- phồng .......................................... 31 Hình 4.7. Triệu chứng trên đậu đũa thu tại Hải Phòng 2016-2017: (A) khảm, (B) khảm- nhăn................................................................................................... 32 Hình 4.8. Phát hiện virus bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 2016-2017 .................................................................................. 33 Hình 4.9. Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV bằng cách châm hạt ủ............ 48 Hình 4.10. Triệu chứng sau 3 tuần lây nhiễm KuMV trên đậu tương DT26. (A): sau 3 tuần lây; (B): cây đối chứng ............................................................... 49 Hình 4.12. Kết quả kiểm tra PCR phát hiện legumovirus trên các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi chung Leg-CP-F/R. ............................................................... 55 Hình 4.13. Kết quả kiểm tra PCR phát hiện KuMV trên các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi đặc hiệu KuMV (KuA-F1/R1). ............................................................. 55 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Tâm Tên Luận văn: Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại Hải Phòng Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 60 62 01 12 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định được thành phần loài virus hại trên cây đậu đỗ tại Hải Phòng Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh virus hại cây họ đậu được thu thập tại các vùng trồng đậu đỗ tại Hải Phòng, sau đó được làm khô bằng hạt silicagel. Các mẫu được kiểm tra ELISA phát hiện virus bằng các kit ELISA do Viện DSMZ của Đức cung cấp. Các mẫu có triệu chứng đặc trưng được kiểm tra PCR và RT-PCR. Sử dụng cặp mồi chung CI-F/R phát hiện potyvirus và cặp mồi chung LegA-cpF1/R1 phát hiện legumovirus. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu MY-A-F1/R1 và KuA-F1/R1 để phát hiện đặc hiệu MYMV và KuMV. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinoculation) nhằm đánh giá tính gây bệnh của KuMV và FbSLCV trên một số cây họ đậu. Kết quả chính và kết luận Điều tra, thu thập các mẫu bệnh virus trên 5 loại cây họ đậu khác nhau (đậu xanh, đậu tương, đậu cove, đậu đũa và đậu đen) với các loại hình triệu chứng. Trong đó, triệu chứng điển hình nhất là khảm lá. Tỉ lệ bệnh tương đối thấp, cao nhất tại huyện An Dương, dao động chỉ từ 0,7%-7,5%. Kiểm tra ELISA trên 40 mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng, phát hiện 8 mẫu nhiễm BCMV, 8 mẫu nhiễm BYMV, 11 mẫu nhiễm CMV và 5 mẫu BLRV. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo KuMV bằng agroinoculation trên giống đậu tương DT26 ;đậu cove TLP68, PN03; đậu đũa VA009 và đậu xanh DX208. Kết quả tỉ lệ nhiễm KuMV chỉ trên đậu tương với tỉ lệ rât thấp 1/40 (2,5%). Kiểm tra PCR phát hiện legumovirus bằng cặp mồi chung LegA-CpF1/R1 phát hiện 8/13 mẫu dương tính với legumovirus trên các mẫu đậu tương, đậu cove, đậu đũa, đậu đen. Đây là lần đầu tiên chúng tôi phát hiện legumovirus trên đậu cove, đậu đen và đậu đũa. Không phát hiện thấy MYMV; chỉ phát hiện thấy KuMV trên đậu tương. ix THESIS ABSTRACT Master candidate: Tran Thi Tam Thesis title: Identify virus-infected diseases on legumes in Haiphong Major: Plant Protection Code: 60 62 01 12 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Identification of components viruses on legumes in Haiphong Materials and Methods The viral symptomatic samples were collected on the legume fields in Haiphong, then were dried by silicagel. The samples were tested for the presence of viruses by ELISA using kits provided by the DSMZ Institute (Germany). PCR and RTPCR tests to detect potyviruses, legumoviruse, MYMV and KuMV were carried out using uivarsal and specific primers. An agroninoculation method using Agrobacterium tumerfaciens cells harboring infectious structures of KuMV and FbSLCV were used to investigate the pathogenicity of these two geminivirses on some legumes. Main findings and conclusions: Investigated and collected virus-infected samples on 5 different legumes (mungbean, soybean, common bean, cowpea and black bean) with different types of symptoms. The most typical symptom was leaf mosaic. The disease incidences were low, ranging from 0.7% -7.5%. ELISA tests on 40 symptomatic legume samples showed 8 samples positive to BCMV, 8 samples positive to BYMV infection, 11 samples positive to CMV infection and 5 samples positive to BLRV. However the OD values of most samples were very low compared with threshold of corresponding viruses. Inoculation of KuMV by agroinoculation on soybean DT26, common bean TLP68, PN03, cowpea VA009 and mungbean DX208 showed this virus infected only soybean DT26 with very low inoculation efficacy (the disease incidence of inoculated plants was as low as 2.5%). PCR and RT-PCR tests of 13 symptomatic samles identified none of them were positive to potyvirus and MYMV, 8 samples were positive to legumovirus and 3 of them, all soybean, were positive to KuMV. The important finding was the detection for the first time in Vietnam of the presence of legumovirus/es on black bean, yard long bean and cove bean. x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây họ đậu (Fabaceae) là loài cây mang lại giá trị dinh dưỡng vô cùng phong phú, đứng hàng đầu cả về hàm lượng và chất lượng protein- thành phần dinh dưỡng ước tính chiếm tới 80% trong bữa ăn hàng ngày của người dân Châu Á có nguồn cung cấp từ thực vật . Bên cạnh đó với một khả năng đặc biệt, là cố định nitơ trong không khí thông qua việc cộng sinh với vi khuẩn nốt rễ - một loại vi khuẩn sống trong đất. Đặc điểm này mang lại lợi ích lớn trong lĩnh vực nông nghiệp và môi trường. Cây họ đậu không đòi hỏi các loại phân bón chứa nitơ, vì thế đã giúp làm giảm chi phí và ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, các loại cây họ đậu thường chịu ảnh hưởng lớn bởi sâu hại, bệnh hại, trong đó có các bệnh về virus. Ít nhất 150 virus đã được công bố nhiễm tự nhiên trên cây trồng họ đậu khắp thế giới, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Edwardson and Christie, 1991; ICTV, 2012, Hema et al., 2014). Năm 2010, ở Việt Nam có 52 virus gây hại thuộc 2 chi chủ yếu là Begomovirus, một số Potyvirus (Hà Viết Cường, 2011). Trong đó gần đây nhất có 2 virus mới được xác định trên cây họ đậu bao gồm 1 Begomovirus là Kudzu mosaic virus (KuMV) gây bệnh khảm lá đậu tương ở Miền Bắc (Hà Viết Cường, 2010). Một virus thứ 2 là French bean severe leaf curl virus (FbSLCV) được phát hiện đầu tiên năm 2012 tại Ấn Độ, gây bệnh cuốn lá dữ dội trên cây đậu cove, và vẫn chưa công bố trên thế giới. Năm 2013, virus này đã được xếp vào một chi mới của họ Geminiviridae là chi Capulavirus. Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và khó kiểm soát bằng hóa chất. Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi quan sát được triệu chứng một cách rõ ràng thì bệnh đã phát triển mạnh. Việc chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh là yếu tố quan trọng giúp cho sự thành công của biện pháp phòng trừ. Hơn nữa cả KuMV và FbSLCV đều là những virus mới nên đặc tính gây bệnh vẫn đang cần được tiếp tục nghiên cứu. Xuất phát từ thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại Hải Phòng”. 1 1.2. MỤC ĐÍCH Xác định được thành phần loài virus hại trên cây đậu đỗ tại Hải Phòng. 1.3. YÊU CẦU - Điều tra thu thập mẫu bệnh có triệu chứng điển hình tại các vùng trồng đậu đỗ tại Hải Phòng; - Phát hiện virus bằng ELISA; - Lây nhiễm nhân tạo đánh giá tính gây bệnh của KuMV và FbSLCV trên các cây đậu đỗ; - Phát hiện virus bằng PCR và RT-PCR. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TẦM QUAN TRỌNG CỦA MỘT SỐ CÂY HỌ ĐẬU Nhóm cây đậu đỗ được khai thác để đáp ứng nhu cầu sử dụng dầu thực vật, protein cho người và nguyên liệu thức ăn gia súc đặc biệt là ở các nước phát triển trên thế giới. Đây cũng là loại cây trồng có tác dụng tốt trong việc luân xen canh và cải tạo đất. Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill là một trong những cây trồng quan trọng và phổ biến nhất để cung cấp và dầu thực vật trên thế giới. Cây đậu tương ó nguồn gốc ở Đông Nam hâu Á. Hiện nay đậu tương có diện tích, năng suất và sản lượng lớn nhất trong tất cả các cây đậu đỗ (Duke, 2012). Đây là cây trồng có giá trị dưỡng cao được các nhà khoa học xếp vào một trong những “thực phẩm chức năng và đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protêin. Lượng dầu của cây đậu tương đứng ở vị trí thứ nhất trong tổng số dầu thực vật được tiêu thụ ở thế giới. Diện tích đậu tương tập trung chủ yếu ở Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Argentina và Ấn Độ, trong đó riêng nước Mỹ thường chiếm 1/3 diện tích đậu tương của toàn cầu (31 triệu ha hằng năm). Xu thế diện tích trồng đậu tương trên thế giới thường gia tăng do nhu cầu sử dụng chính sách quản lý và thương mại của các quốc gia, đặc biệt trong hoàn cảnh ngày càng có nhiều quốc gia sử dụng các giống biến đổi gen (GMO) (Masuda and Goldsmith, 2009). Đậu xanh (Vigna radiata (L) Wilezek) trên thế giới được phân bố ở vùng Nhiệt đới và Á nhiệt đới, chủ yếu tập trung ở châu Á trong đó Bangladesh, Ấn Độ, Pakistan, Philippine, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan được coi là các nước sản xuất chủ yếu. Trong những năm trước đây, tại Thái Lan và Philippine đậu xanh là cây đậu đỗ quan trọng hàng đầu (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998). Trên thị trường, cây đậu xanh được sản xuất để khai thác protein, dạng bột trong nguyên liệu thực phẩm, nước giải khát và làm giá sống cung cấp vitamin cho con người. Bột cũng như protein của đậu xanh là dạng rất dễ tiêu, có thể phối trộn với nhiều dạng nguyên liệu khác để tạo sản phẩm do đó có nhu cầu tiêu thụ rất lớn trên thị trường, chủ yếu là các nước châu Á. Trung bình trong 100g bột đậu xanh cho ta 24,2g protein; 1,3g dầu; 3,5g khoáng; 59,9g hyđratcacbon; 75mg Ca; 405mg P; 8,5mg Fe; 49,0mg Caroten; 0,72 mg B1; 3 0,25mg B2 và 348 Kcalo. Với những giá trị về dinh dư ng như trên, từ lâu đậu xanh đã được coi là cây thực phẩm, sử dụng rộng rãi và chế biến thành nhiều sản phẩm rất phong phú phục vụ cho cuộc sống con người. Tại Việt Nam, hàng năm phải nhập nguồn nguyên liệu để chế biến dầu thực vật và thức ăn gia súc với tổng giá trị lên đến 3,7 tỷ USD, trong đó riêng khô dầu đậu tương đã có 2,7 triệu tấn (tương đương 5,4 triệu tấn hạt, cao gấp 15 lần so với sản lượng sản xuất được tại Việt Nam) chủ yếu từ Mỹ và Argentina, trong khi 60% diện tích của cây trồng này trên thế giới đang sử dụng giống GMO (Bùi Chí Bửu, 2012). Hiện nay, chính phủ đang có nhưng ưu tiên để nghiên cứu phát triển cây trồng này thông qua Quyết định 899/QĐ-TTg ngày 10/6/2013 phê duyệt đề án tái cơ cấu ngành nông nghiệp theo hướng nâng cao giá trị gia tăng và phát triển bền vững. Cùng với chính sách chuyển dịch cơ cấu cây trồng ở một số địa phương, cây đậu xanh đang được sự quan tâm của nhiều công ty phân phối và được trồng rất phổ biến khắp cả nước (Phan Xuân Thiệu và cs., 2006). Đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) có nguồn gốc từ miền Nam Mexico, Trung Mỹ. Ngày nay, đậu côve vàng được trồng phổ biến ở nhiều vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Sản lượng đậu côve vàng của thế giới (1979) ước tính khoảng 8.3 triệu tấn và Brazil là nước sản xuất nhiều đậu cove nhất thế giới với sản lượng đậu giai đoạn 1973- 1975 là 2,3 triệu tấn (Lewis, 2005). Cây đậu đũa (Vigna sesquipedalis Wight) có nguồn gốc từ Đài Loan hay miền Nam Trung Quốc hay từ Bangladesh. Đậu đũa là một trong 10 loại rau quan trọng ở vùng Đông Nam Á, hiện nay được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới như một vụ rau nhỏ, sản lượng đậu đũa ở Đông Nam Á thường cao hơn ở Châu Phi (Lewis, 2005). Cây đậu đen (Vigna cylindrica Skeels), thuộc họ cánh bướm Fabaceae (Papilionaceae).Tên khoa học của đậu đen hiện nay chưa được xác định chính xác, nó còn có tên gọi là Vigna catiang Endl.var. Hiện nay cây đậu đen cũng được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và kể cả Hoa Kỳ (ở Hoa kỳ cây đậu đen được trồng làm nguồn thức ăn gia súc) ( Lewis, 2005). Hạt đậu đen có giá trị dinh dưỡng cao. Ngoài việc dùng làm thực phẩm, đậu đen còn được dùng để bào chế thuốc và làm thuốc, ngâm tẩm các vị thuốc để giảm bớt độc tính của thuốc như Ban miêu, Bã đậu… giảm vị chát của Hà thủ ô. 4 2.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CHI BEGOMOVIRUS 2.2.1. Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni et al., 2003; Zhang et al., 2001). Hình 2.1. Hình thái của Begomovirus Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov 2.2.2. Cấu trúc genome của Begomovirus Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước khoảng 2.6- 2.8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A (Hà Viết Cường, 2011). 5 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của Begomovirus Nguồn: http://education.expasy.org/images/Begomovirus_genome.jpg 2.2.3. Cấu trúc của phân tử DNA-A Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame) được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2 mã hóa Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm có 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh (Rep protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2 (TrAP- Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái sinh (REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với protein ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ ký chủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Hà Viết Cường, 2011). 6 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus 2.2.4. Cấu trúc của phân tử DNA-B DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều ngược kim đồng hồ chứa gen BC1. BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm soát bởi CP. BC1 là một protein vận chuyển : (MP-Movement protein) có chức năng vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ. CR=Common Region CR DNA-B ~2.7kb BV1 (NSP) BC1 (MPB) Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus Nguồn: Hà Viết Cường (2011) 7 2.2.5. Phân loại các Begomovirus Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đông bán cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam et al., 1999; Rybicky et al., 1994). Các Begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các Begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các Begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các Begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005). Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay. Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế giới. 2.2.6. Triệu chứng bệnh do Begomovirus Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào già cỗi, quá trình này sẽ chậm lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của bệnh do các Begomovirus. Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2 - 4 tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). 2.2.7. Phạm vi ký chủ Begomovirus có phạm vi ký chủ khá phong phú gồm các loại cây trồng và cỏ dại. Riêng đối với một số virus hại cây họ đậu như BYMV, BGYMV, BcaMV, SbCLV... chủ yếu tìm thấy trên đậu, tuy nhiên SiMoV tìm thấy đầu tiên trên cây Sida rhombifolia và Leonurus sibiricus, sau đó 3 năm virus này được tìm thấy trên đậu tương tại Brazil (Mello et al., 2002). 2.2.8. Lan truyền Tất cả các Begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant). Bọ phấn là loài đa thực với phổ ký chủ khoảng 500 loài thực vật, là vector của nhiều loại virus thuộc 8 họ Geminivirus, Closterovirus, Nepovirus và Carlavirus (Brunt et al., 1996). Bọ phấn chích nạp Begomovirus trên cây bệnh trong khoảng 15-30 phút, chích truyền trên cây khoẻ cần thời gian ít nhất là 15 phút và có thời gian tiềm tàng là 8-24 giờ. 2.3. MỘT SỐ VIRUS QUAN TRỌNG TRÊN CÂY HỌ ĐẬU 2.3.1. Bean common mosaic virus (BCMV) 2.3.1.1. Phân bố Bệnh được phát hiện, quan sát và mô tả lần đầu tiên ở Mỹ từ năm 1917 (Brunt et al., 1996). Ngày nay BCMV có thể được tìm thấy trên khắp thế giới, bất cứ nơi nào đậu được trồng, bao gồm nhiều khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới (CABI, 2017a). 2.3.1.2. Phân loại BCMV có bộ gen ARN sợi đơn dương (ssRNA), họ Potyviridae, chi Potyvirus, loài Bean commom mosaic virus. Virus còn có một số tên khác như Bean common mosaic potyvirus, Bean mosaic virus, Bean virus 1, Bean western mosaic virus, Phaseolus virus 1, Mungbean mosaic virus, Common bean mosaic virus (Morales and Bos, 1988). Tên thường được dùng phổ biến là Bean commom mosaic virus, viết tắt BCMV. Theo kết quả nghiên cứu của Berger et al. (1997), khi phân tích trình tự đầu 3’ không mã hoá và gen CP của 13 chủng của BCMV và 1 chủng của Bean common necrosis mosaic virus (BCNMV) để phân tích phả hệ gen đã cho thấy rằng BCNMV là một chủng khác biệt của BCMV. Các virus hại đậu đỗ được sắp xếp vào nhóm BCMV, BCNMV và các nhóm phụ khác. Sự khác biệt trong các triệu chứng của cây kí chủ, huyết thanh học, tế bào học, chiều dài hạt virus và trọng lượng phân tử của protein vỏ (CP) giữa các chủng hoại tử và không hoại tử của Bean commom mosaic virus (BCMV) và sự khác biệt trong các chuỗi đầu N của protein CP của các chủng gây triệu chứng hoại tử (NL8) và không hoại tử (NL4) của BCMV kết luận rằng BCMV nên phân loại lại thành hai potyviruses riêng biệt. Các chủng hoại tử được phân loại như chủng Bean necrosis mosaic virus (BNMV) và chủng không hoại tử vẫn được phân loại như BCMV (Vetten et al., 1992) Công bố kết quả nghiên cứu dựa vào phân tích peptide bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatographic) và trình tự gen 9