Vi nhân giống lan gấm anoectochilus formosanus hayata

  • Số trang: 75 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 215 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

LỜI CẢM ƠN Đề tài tốt nghiệp này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi trường, Trường Đại học Lạc Hồng dưới sự hướng dẫn của Ths. Vưu Ngọc Dung và Ths. Mai Hương Trà, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi trường Trường Đại học Lạc Hồng. Để hoàn thành tốt bài báo cáo nghiên cứu này chúng tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể. Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại học Lạc Hồng cho phép chúng tôi thực hiện đề tài này. Cảm ơn cô Vưu Ngọc Dung và cô Mai Hương Trà, người trực tiếp hướng dẫn đề tài nghiên cứu của chúng tôi đã đóng góp nhiều ý kiến và tận tình hướng dẫn cho chúng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, trình bày báo cáo. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ trong suốt quá trình nghiên cứu. Cảm ơn các bạn, anh chị trong nhóm sinh viên thực tập tốt nghiệp đã giúp đỡ chúng tôi hoàn thành đề tài. Và cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn dành sự cảm thông chia sẻ, giúp đỡ và động viên chúng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn! Biên Hòa, ngày 24 tháng 11 năm 2013 Sinh viên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU .......................................................................................... 2 1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI ......................................................................................... 2 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ........................................................... 3 1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ................................ 3 1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 3 1.5. KẾT CẤU CỦA ĐỀ TÀI ....................................................................................... 3 PHẦN II: NỘI DUNG .................................................................................................. 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 4 1.1. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ............................................... 4 1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô.................................................................................. 4 1.1.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro ................................................................... 5 1.1.3. Các bước nhân giống in vitro ........................................................................ 6 1.1.3.1. Tạo thể nhân giống in vitro ................................................................... 6 1.1.3.2. Nhân giống in vitro ............................................................................... 6 1.1.3.3. Chuyển cây in vitro ra vườn ươm ......................................................... 7 1.1.3.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro ............................................................ 7 1.1.4. Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro ....................... 7 1.1.4.1. Ưu điểm................................................................................................. 7 1.1.4.2. Hạn chế ................................................................................................. 8 1.1.5. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô .................................................................. 8 1.1.5.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản ............................................................. 8 1.1.5.2. Về mặt thực tiễn sản xuất ..................................................................... 9 1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY .................................................................................. 9 1.2.1. Một số loại môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô ..................... 9 1.2.2. Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy ...................................... 10 1.2.2.1. Các chất khoáng ................................................................................. 11 1.2.2.2. Các Vitamin ......................................................................................... 11 1.2.2.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy......................................... 11 1.2.2.4. Yếu tố làm đặc môi trường ................................................................. 12 1.2.2.5. Các chất điều hòa sinh trưởng............................................................. 12 1.2.2.6. Các chất kháng sinh ............................................................................ 13 1.2.3. Độ pH môi trường ....................................................................................... 14 1.3. TỔNG QUAN VỀ LAN GẤM ............................................................................ 14 1.3.1. Tình hình sản xuất ....................................................................................... 14 1.3.2. Nhu cầu thị trường lan ................................................................................. 15 1.3.3. Nguồn gốc và kỹ thuật trồng lan ................................................................. 16 1.3.3.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 16 1.3.3.2. Nguồn gốc và phân bố ...................................................................... . 16 1.3.3.3. Đặc điểm hình thái .............................................................................. 17 1.3.3.4. Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến lan Gấm ................................. 17 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ NUÔI CẤY LAN GẤM................................. 18 1.4.1. Trên thế giới ................................................................................................. 18 1.4.2. Ở Việt Nam .................................................................................................. 19 1.4.3. Kết luận........................................................................................................ 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 22 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.................................................................................. 22 2.1.1. Mẫu mô ........................................................................................................ 22 2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................................ 22 2.1.2.1. Chuẩn bị phòng thí nghiệm ................................................................. 22 2.1.2.2. Chuẩn bị dụng cụ ................................................................................ 22 2.1.2.3. Các thao tác trong phòng cấy .............................................................. 23 2.1.2.4. Điều kiện ............................................................................................. 24 2.2. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ..................................................... 24 2.2.1. Môi trường Knudson C ................................................................................ 24 2.2.2. Các chất điều hòa sinh trưởng ..................................................................... 25 2.2.3. Dịch chiết khoai tây ..................................................................................... 25 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 25 2.3.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 25 2.3.2. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 26 2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi. ............................................................................................. 26 2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi ................................................................................ 27 2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ ......... ................................................................................................................ 29 2.3.3. Xử lý số liệu: ............................................................................................... 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31 3.1. KẾT QUẢ ............................................................................................................ 31 3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi ..................................................................................................... 31 3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi ........................................................................................ 35 3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ .................................................................................................................................. 39 3.2. THẢO LUẬN....................................................................................................... 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 49 4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49 4.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Số chồi tái sinh qua các giai đoạn Biểu đồ 3.2: Biểu diễn số chồi tái sinh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân nhanh chồi và phát triển chồi Biểu đồ 3.4: Biểu diễn số chồi nhân nhanh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.5: Biểu diễn chiều cao của chồi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của môi trưởng đến sự ra rễ và phát triển rễ Biểu đồ 3.7: Biểu diễn số rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.8: Biểu diễn chiều dài rễ phụ thuộc và môi trường nuôi cấy DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần môi trường Knusond C Bảng 2.2: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và Kinetin trong môi trường tái sinh chồi Bảng 2.3: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và NAA trong môi trường nhân nhanh chồi Bảng 2.4: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và NAA trong môi trường phát sinh rễ Bảng 3.1: Kếtquả ảnh hưởng các môi trưởng đến sự tái sinh chồi đến hình thái chồi Bảng 3.2: Kết quả ảnh hưởng các môi trường lên sự nhân chồi Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng các môi trường tới sự ra rễ DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata Hình 1.2: Các dạng sản phẩm lan Gấm thô và lan Gấm chế biến Hình 1.3: Lan Gấm Hình 2.1: Sơ đồ Phòng nuôi cấy mô, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường Hình 2.2: Nồi hấp Autoclave Hình 2.3: Cân phân tích Hình 3.1: Số chồi hình thành trên môi trường TS5 sau 2,4,6 tuần Hình 3.2: Số chồi hình thành trên môi trường KC7 sau 2,4,6 tuần Hình 3.4: Sự phát triển của rễ sau 6 tuần Hình 3.5: Quy trình vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BAP: 6 – Benzylamino – purine IBA: Indol Butyric Acid KT: Forchlorfenuron CĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng CĐHSTTV: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật GA3: Giberellin A3 NT: Nghiệm thức NAA: Naphthaleneacetic acid 2,4- D: 2,4 – diclorophnoxyacetic acid B1: Thiamin – HCl UV: Ultraviolet (tia cực tím) MT: Môi trường 1 LỜI MỞ ĐẦU Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được du nhập vào nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và vào đầu những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại đây công nghệ mô - tế bào mới phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã được xây dựng và triển khai ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nước. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đang không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây giống. Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh trên thị trường quốc tế. Nhiều loài hoa quý được phục tráng nhằm bảo tồn giống. Như các loài hoa khác, hiện nay hoa lan đã được phục hồi rất nhiều chủng loại. Không chỉ bởi vì bảo quản nguồn giống mà bản thân hoa lan cũng mang lại nhiều lợi ích như làm cảnh, chiết xuất dược liệu, làm thuốc,... Trên thị trường hiện nay, bên cạnh những loài hoa truyền thống, hoa lan ngày càng được ưa chuộng bởi vẻ hiện đại, sang trọng, ưu điểm lâu tàn, hương thơm đặc biệt, đa dạng mà hầu như không có loại hương liệu nhân tạo nào sánh được. Lan Gấm (Anoectochilus sp) ngoài những ưu điểm trên, nó còn có giá trị y học và tiềm năng kinh tế rất lớn. Việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Gấm được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn nhằm mục đích đáp ứng nhu cầu về số lượng cũng như chất lượng cây giống loài lan này cho thị trường trong nước và ngoài nước. 2 PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU 1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Sự phát triển của y học cổ truyền đặc biệt là Đông y Trung Quốc đã khiến cho lan Gấm Anoectochilus formosanus trở thành một loài dược liệu quý, đặc biệt Anoectochilus formosanus Hayata là loài có giá trị dược liệu và thương mại cao trên thế giới. Để đáp ứng nhu cầu sử dụng, Trung Quốc đầu tư phát triển nền công nghiệp Anoectochilus. Với nhu cầu nguyên liệu lớn, Trung Quốc tận thu nguồn lan Gấm từ các nước trong khu vực mà chủ yếu ở Việt Nam. Năm 2011, trên những cánh rừng Tây Nguyên, người dân kéo nhau đi săn tìm cây lan Gấm để bán cho thương lái Trung Quốc. Chỉ trong thời gian ngắn loài lan này đã có nguy cơ biến mất khỏi Việt Nam nếu như các cơ quan chức năng không vào cuộc khôi phục lại nguồn giống. Năm 2007, lan Gấm được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, xếp hạng EN A1a, c, d. Tài liệu nghiên cứu của Đài Loan cho biết, đây là loài cây quý giá có tác dụng tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, chữa trị vết thương do rắn độc cắn. Có tính kháng khuẩn, chữa bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính. Ngoài ra còn dùng chữa thần kinh suy nhược, ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận, di tinh, đau lưng, phong thấp, tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt. Dùng cây (khô, tươi) nấu nước uống chữa đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt cao, tăng huyết áp, liệt dương, rối loạn chức năng gan, lá lách và bệnh ung thư…[1] Nhờ quý hiếm và có tính dược liệu quý nên giá cây lan Gấm tươi được bán trên thị trường thế giới từ 200 - 300 USD/kg (thân, rễ, lá, hoa). Cây khô có giá từ 3.200 USD/kg, nếu thu hái trong tự nhiên giá cao gấp 3 lần. Trung Quốc, Đài Loan, Nhật đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu lớn. Tiềm năng sản xuất và xuất khẩu cây lan Gấm rất lớn nếu được đầu tư đúng mức.[1] Ở Việt Nam do việc khai thác quá mức mà loại lan này gần như cạn kiệt ngoài tự nhiên. Chính vì thế để đáp ứng được nhu cầu giống với số lượng lớn của thị trường người ta áp dụng nhân giống bằng nuôi cấy mô. Nhận thức được vấn đề và góp phần đáp ứng nhu cầu thực tiễn chúng tôi thực 3 hiện đề tài “Vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Nhân được số lượng lớn cây lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata, cây khỏe và phát triển tốt trong điều kiện in vitro. 1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Đối tượng nghiên cứu của đề tài là lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata do Viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Phạm vi nghiên cứu của đề tài là xây dựng quy trình nhân giống lan Gấm từ mẫu cây con in vitro. (Cây in vitroTái sinh chồi  Nhân chồi Ra rễ  Cây con ) Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô trường Đại học Lạc Hồng. Hình 1.1: Lan Gấm Anoectochilusformosanus Hayata 1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tổng quan tài liệu Thực nghiệm Bố trí thí nghiệm Nuôi cấy mô thực vật Phân tích và xử lý số liệu thống kê 1.5. KẾT CẤU CỦA ĐỀ TÀI Gồm các chương mục và nội dung sơ lược của chương mục. Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4 PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô [2] Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật đưa một mô, bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có kiểm soát về: thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận đó sinh trưởng, phát triển theo mục đích của người nuôi cấy. Kỹ thuật này dựa trên hai nguyên tắc sau: 1.1.1.1. Tính toàn năng của tế bào Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Năm 1922 con người đã nuôi được đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo trong 12 ngày. Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào được chứng minh bằng thực nghiệm. Sau 43 năm (năm 1965), đã nuôi từng tế bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Kết quả này chứng minh đầy đủ tính toàn năng của tế bào. 1.1.1.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa. Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó thì càng khó xảy ra quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh động vật. Người ta đã kết rằng: những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. 5 Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa. Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc. Các tế bào động vật nói chung khó nuôi cấy hơn do chúng đã được biệt hóa quá sâu sắc và vì thế quá trình phản biệt hóa rất khó thực hiện. 1.1.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro [3] 1.1.2.1. Nuôi cấy đốt thân Sử dụng mẫu cấy là một đoạn thân ngắn có chứa chồi ngủ. Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá được hình thành. Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡng thích hợp đến khi đủ số lượng cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất. 1.1.2.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh trưởng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 – 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh. 1.1.2.3. Gieo hạt in vitro Hạt giống lan Gấm gieo trên môi trường nền có bổ sung các chất hữu cơ, hạt giống sẽ nảy mầm sau 4 tháng nuôi cấy. Cấy chuyển sang môi trường thích hợp có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, sau 4 tháng cấy chuyển qua môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Khi cây được 10 tháng tuổi, chuyển cây lan Gấm in vitro ra trồng trong khay ngoài vườn ươm có hệ thống làm mát (cooling pad hoặc phun sương). 6 Để nâng cao tỉ lệ nảy mầm của hạt lan gấm, hiện nay người ta dùng nấm Rhizoctonia cộng sinh với hạt, đã làm tăng tỉ lệ nảy mầm lên 80% trong môi trường OMA, gồm bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar. 1.1.3. Các bước nhân giống in vitro [4] Để nhân giống được một cây con hoàn chỉnh có khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên bằng phương pháp nhân giống in vitro thì trải qua 4 bước: Tạo thể nhân giống in vitro Nhân giống in vitro Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Chuyển cây in vitro ra vườn ươm. 1.1.3.1. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi và thể cắt đốt, ngoài ra còn có thể giò. Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác. 1.1.3.2. Nhân giống in vitro Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. 1.1.3.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây con phải mạnh khỏe nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy 7 ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Thường dùng các chất thuộc nhóm Auxin kích thích ra rễ. 1.1.3.4. Chuyển cây in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo thành trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ. 1.1.4. Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro [4] 1.1.4.1. Ưu điểm So với các phương pháp nhân giống khác thì phương pháp nhân giống in vitro có một số thuận lợi là: Những cây nhân giống in vitro đồng nhất về di truyền. Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn… mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. Hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. Được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm... Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. Tạo dòng toàn cây cái hoặc toàn cây đực theo mong muốn. Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen. 8 Ngoài ra, phương pháp vi nhân giống còn giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dữ trữ lâu dài và chiếm ít thời gian so với phương pháp nhân giống truyền thống. 1.1.4.2. Hạn chế Hạn chế chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quí hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo tồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy mô và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp. Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiêu hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. 1.1.5. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô [5] 1.1.5.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản Nuôi cấy mô đã sớm mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào chúng ta đã tiến hành so sánh đặc tính của cơ thể và các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể. Thực tế đã chứng minh là cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó là nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo và từ mô sẹo có thể kích thích thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương pháp nuôi cấy mô chúng ta có thể tiến hành tìm hiểu và nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ vì vậy mà bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. 9 1.1.5.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng giống và nhân nhanh giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy mô còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học. Bằng phương pháp nuôi cấy mô sau một thời gian có thể tạo thành một sinh khối lớn các hoạt chất: alkaloic, glycoside, các steoid, các chất dính dùng trong thực phẩm. Những lợi ích trong nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp: Kiểm soát được dịch bệnh hại cây trồng, ta có thể loại bỏ được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh. Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất. Kiểm soát được từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch. Tạo sự đồng loạt về giống, cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch. Làm tăng năng suất chất lượng cao giúp tiêu thụ nhanh và đem lại thu nhập cao. 1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY [6] 1.2.1. Một số loại môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu gen, các kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường. Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp. Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô như: Môi trường Murashige và Skoog (1962) (môi trường MS). Môi trường Lloyd và McCoown (1981) (môi trường WP). Môi trường White (1954) (môi trường W). Môi trường Nitsch (1951). 10 Môi trường Gamborg, Miller và Ojima (môi trường B5). Môi trường Schengk và Hilderbrant (1972) (môi trường SH). Môi trường Nitsch và Nitsch (1969). Môi trường Ahuja’s Aspen Culture (1983). Môi trường Chu (1975). Môi trường Knop (1884). Môi trường Knudson C (1946). Môi trường Heller (1953, 1955). Môi trường Vacin và Went (1949). 1.2.2. Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy phải cung cấp các nguyên tố quan trọng và dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây in vitro. Sự lựa chọn hay phát triển môi trường nuôi cấy là một bước quan trọng trong bất cứ đề tài nuôi cấy mô tế bào nào. Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng Các vitamin Các amino acid Nguồn carbon: một số loại đường Các chất điều hoà sinh trưởng Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây,... Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar) Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro. Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố: Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường. 11 Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…) Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…) 1.2.2.1. Các chất khoáng Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Nguyên tố đa lượng bao gồm N, P, K, Mg, S và Ca. Các nguyên tố đa lượng này thường tồn tại ở dạng muối và tồn tại trong dung dịch. Đây là nguyên liệu để những tế bào hình thành nên cấu trúc của mình. Nguyên tố vi lượng điển hình thường sử dụng như các nguyên tố Fe, Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co. Nhờ các nguyên tố vi lượng này mà cây mới sinh trưởng và phát triển bình thường. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào thành phần của enzym xúc tác cho phản ứng sinh hóa diễn ra trong tế bào. 1.2.2.2. Các Vitamin Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau. Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Trong các loại vitamin, B1 được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng có thể được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy tăng cường sức sinh trưởng của mô. 1.2.2.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% (w/v). Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích 12 phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v). Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp: Nước cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết nấm men (yeast extract), casein thuỷ phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy. 1.2.2.4. Yếu tố làm đặc môi trường Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường dùng một số vật liệu làm giá thể để nâng đỡ mô và chồi, giữ cho cây đứng vững trong môi trường. Nguyên liệu phổ biến nhất trong nuôi cấy mô là agar. Người ta hoà agar vào trong môi trường, làm tan ở nhiệt độ cao (trên 60C) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra tuỳ thuộc từng vật liệu nuôi cấy mà người ta sử dụng các vật liệu khác làm giá thể như: giấy lọc, vải, một số màng nhân tạo. Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidum. Bởi vì agar là sản phẩm lấy từ tảo biển, nên nó có những tác động sinh lý trên mô thực vật. Loại agar sử dụng để làm đông môi trường có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60 - 1000 C, đặc lại khi nhiệt độ còn 350C vì vậy agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân huỷ bởi enzym thực vật. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường. 1.2.2.5. Các chất điều hòa sinh trưởng Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như Auxin, Cytokinin và Giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây: 13 Nhóm Auxin: Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái… đặc biệt có hoạt tính cao khi phối hợp sử dụng với các Cytokinin. Nhóm Cytokinin: Các Cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Chức năng chủ yếu của các Cytokinin là kích thích phân chia tế bào, tạo và nhân callus, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô... Nhóm Gibberellin: Trong đời sống thực vật Gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý của thực vật. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Gibberellin có các chức năng cơ bản như kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, phá ngủ hạt giống, kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. 1.2.2.6. Các chất kháng sinh Chất kháng sinh là chất được sản xuất bởi các loài vi sinh vật khác nhau, hoặc làcác chất kháng sinh tổng hợp. Chúng có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác và cuối cùng làm tiêu huỷ chúng. Vai trò của các loại thuốc kháng sinh trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật: Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy. Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi môi trường và mô nuôi cấy (sau nuôi cấy, hỗn hợp Agrobacterium với tế bào thực vật để chuyển gen hoàn thành). Sử dụng kháng sinh trong môi trường chọn lọc để chọn các tế bào hoặc mô đã được chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh). Các tế bào không được chuyển gen sẽ bị chết trong môi trường có kháng sinh ở nồng độ thích hợp. 14 1.2.3. Độ pH môi trường Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm. Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi khử trùng. Nhìn chung nếu độ pH cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn 5 thì agar khó đông. 1.3. TỔNG QUAN VỀ LAN GẤM 1.3.1. Tình hình sản xuất [7] Theo y học cổ truyền Đài Loan, A. formosanus Hayata tươi hoặc khô nấu nước uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực (Lin và Wu 2007). Đại học Công nghệ Y dược và Cao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã sử dụng A. formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ thể và kháng virus cúm A. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện A. formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch. Dịch chiết A. formosanus Hayata có khả năng kháng virus, kháng sung viêm và bảo vệ gan. Chiết xuất của cây A. formosanus khô có chứa 4-hydroxycinnamic acid, βsitosterol, β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid (Takatsuki,S., 1992). Trung Quốc, Đài Loan, Nhật đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu lớn. Sau hơn hai mươi năm nghiên cứu, đầu tư và phát triển, lan Gấm dần trở thành đặc sản của Đài Loan. Đài Loan trở thành nơi cung cấp giống chất lượng cao và chuyển giao công nghệ cho các thành phố khác của Trung Quốc, cũng như các nước trong khu vực. Nam Kinh với hàng trăm công ty sản xuất lan Gấm với giá trị sản lượng hàng năm trên sáu trăm triệu đô la Mỹ. Phúc Kiến đã đầu tư 160 triệu nhân dân tệ cho việc xây dựng các nghiên cứu và phát triển nuôi cấy mô, trồng trọt, sản xuất, chế biến và khai thác với sản lượng hàng năm là 5 tỷ cây. [19]
- Xem thêm -