Tài liệu ứng dụng phương pháp pcr genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (wssv) trên tôm sú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ đã tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội học tập thêm những kiến thức thực tế. Chân thành cảm ơn anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khoá 14) đã nhiệt tình hỗ trợ cung cấp mẫu tôm thu ở Cà Mau năm 2008. Xin cám ơn tập thể các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy Sản. Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và em gái đã động viên trong suốt thời gian làm luận văn cũng như trong khoảng thời gian học Đại học. Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành công trong cuộc sống. i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm hiểu sự khác nhau về kiểu gen của WSSV ở hai thời điểm và hai khu vực khác nhau bằng phương pháp PCR Genotyping (ORF94 và ORF125). Kết quả cho thấy có sự khác nhau về kiểu gen của WSSV ở năm 2006 và năm 2008 và cả ở 2 khu vực Cà Mau và Bạc Liêu khi phân tích 231 mẫu ở 23 ao, thuộc 2 đợt thả giống liên tiếp trong cùng một ao nuôi ở mô hình quãng canh cải tiến (QCCT) thuộc tỉnh Cà Mau 2008 và so sánh kiểu gen của các dòng virus này với các nghiên cứu trước đây (năm 2006). Kết quả nghiên cứu cho thấy, năm 2008, kiểu gen thuộc ORF94 có 12 nhóm vùng lặp lại (VLL), từ 4 - 16 vùng lặp lại trong đó 11-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (35,8%, 43/120 tổng số mẫu), ORF125 có 8 nhóm vùng lặp lại từ 3 14 vùng lặp lại, trong đó 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (53,8%, 64/119 tổng số mẫu). Năm 2006 cho thấy có 5 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125, từ 4 - 8 vùng lặp lại (Cà Mau) và có 6 nhóm từ 3 - 8 vùng lặp lại (Bạc Liêu), trong đó kiểu gen có 6-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất ở cả hai khu vực (Cà Mau là 59,7%, Bạc Liêu là 24,1%). Sự nhiễm nhiều kiểu gen (ORF94 và ORF125) của WSSV trong cùng 1 ao ở mô hình nuôi QCCT năm 2008 là phổ biến và sự nhiễm kép nhiều kiểu gen trong cùng một mẫu tôm cũng phong phú hơn so với năm 2006. Nghiên cứu còn cho thấy, sự nhiễm bệnh ở các đợt nuôi tôm liên tiếp ở mô hình QCCT chủ yếu là do nguồn tôm giống gây ra. Từ đó có thể thấy khả năng ứng dụng tốt phương pháp PCR Genotying trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................... ……………………………………….i TÓM TẮT .................................................................................................. ii MỤC LỤC................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH ................................................................................. vi Chương I - GIỚI THIỆU ............................................................................ 1 Chương II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 3 2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm.................................................. 3 2.1.1 Trên thế giới .............................................................................. 3 2.1.2 Ở Việt Nam ............................................................................... 4 2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV .............. 5 2.2.1 Hình thái học của WSSV ........................................................... 5 2.2.2 Cấu trúc protein ......................................................................... 5 2.2.3 Gen và phân loai học.................................................................. 6 2.2.4 Sự biến đổi về gen và độc lực của các dòng virus....................... 7 2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm .................................................................... 7 2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật PCR - genotyping................................................................. 8 2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR .......................................................... 9 2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR ......................................................... 9 2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR .................... 9 2.3.3 Úng dụng của kỹ thuật PCR ..................................................... 10 Chương III - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................. 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 11 3.2.1 Dụng cụ và hoá chất .............................................................. 11 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................ 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 12 3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV........................... 12 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping ................................................. 14 Chương IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 16 4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008.......................................................... 16 4.1.1 Kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000.................................... 16 4.1.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping ......................................... 19 4.1.2.1 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF94.............. 19 4.1.2.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF125 ............ 25 4.2 Kết quả phân tích mẫu axit nucleic trử năm 2006 với PCR-Genotyping thuộc ORF125 .............................................................................. 30 4.3 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 ............................................... 33 4.4 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 ............................................... 35 Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................. 38 4.1 Kết luận ......................................................................................... 38 4.2 Đề xuất .......................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 39 PHỤ LỤC I .............................................................................................. 42 PHỤ LỤC II ............................................................................................. 43 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 - Tỉ lệ nhiễm bệnh so với tổng số mẫu phân tích ........................... 16 Bảng 4.2 - Các ao có mẫu tôm và mẫu cua dương tính được phân tích ......... 18 Bảng 4.3 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 .... 19 Bảng 4.4 -Số vùng lặp lại của ORF94 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu ............................................................................................................. 24 Bảng 4.5 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 ...................................................................................................... 25 Bảng 4.6 - Số vùng lặp lại của ORF125 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu ........................................................................................................ 29 Bảng 4.7 - Kết quả phân tích số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu axit nucleic trử ở Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 ........................................ 32 Bảng 4.8 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 33 Bảng 4.9 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 34 Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 35 Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 36 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996) .......................... 5 Hình 4.1 - Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5%................. 17 Hình 4.2 - Các vùng lặp lại thuộc ORF94 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 ....... 20 Hình 4.3 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống đợt 1 ............................................................................................. 21 Hình 4.4 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống đợt 2 ............................................................................................. 21 Hình 4.5 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 ..... 26 Hình 4.6 - Sự nhiễm kép của WSSV trong cùng một mẫu thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 ........................................................................ 26 Hình 4.7 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi đợt 1 .................................................................................................... 27 Hình 4.8 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi đợt 2 ..................................................................................................... 27 Hình 4.9 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở 2 tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 .................................................................................. 30 Hình 4.10 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Bạc Liêu năm 2006 . 31 Hình 4.11 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2006 ... 31 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Chương I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long trong đó, Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng theo thống kế là 3 vùng nuôi tôm lớn ở Miền Nam Việt Nam với nhiều mô hình nuôi phong phú đa dạng. Tuy nhiên, khi dịch bệnh xảy ra (bắt đầu xuất hiện vào năm 1994 và kéo dài đến nay) do nhiều nguyên nhân khác nhau đã dẫn đến thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Trong đó, bệnh đốm trắng là một trong những bệnh gây thiệt hại đáng kể đến năng suất tôm nuôi. Bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus (WSSV) gây ra trên tôm xuất hiện sớm nhất ở Đài Loan năm 1991, sau đó thì phân bố rộng khắp nơi ở các khu vực nuôi tôm trên thế giới. WSSV gây bệnh trên tôm nước mặn, tôm nước ngọt và được phát hiện nhiễm trên nhiều đối tượng khác nhau. Từ khi bệnh xuất hiện đến nay có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về phương thức lan truyền, vật chủ cảm nhiễm, độc lực, thành phần cấu tạo và đã hoàn thành về phân loại học WSSV, vv,…và đặc biệt đã giải trình tự bộ gen ba dòng WSSV ở Đài Loan, Trung Quốc và Thái Lan. Khi so sánh 3 bộ gen này với nhau, tìm thấy sự thay đổi về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 trên 3 dòng virus này. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, vai trò ứng dụng của việc tìm hiểu sự thay đổi kiểu gen thuộc ba vùng mã hoá này là rất lớn. Theo nghiên cứu của Dieu et al., (2004) và Hoa et al., (2005) cho thấy dựa vào sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 của WSSV có thể xác định được nguồn gốc, phạm vi lan truyền của bệnh từ nơi phát sinh và cũng như sự khác nhau của các dòng WSSV. Do đó, các vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu về dịch tể học của WSSV ở Việt Nam. Vì vậy, đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR Genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú” được thực hiện nhằm mục tiêu: Tìm hiểu các vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú thu ở Bạc Liêu và Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008. 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Nội dung nghiên cứu - Phân tích các dòng WSSV thu ở Bạc Liêu và Cà Mau (năm 2006 và 2008) với phương pháp PCR genotyping (thuộc ORF94 và ORF125) - So sánh sự khác nhau về kiểu gen vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu ở năm 2006 và 2008. 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Chương II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm 2.1.1 Trên thế giới Trong khoảng thời gian 1991 - 1992 bệnh đốm trắng xuất hiện và gây chết nhiều tôm nuôi ở một tỉnh của Đài Loan và sau đó đến hai tỉnh của Trung Quốc. Đến năm 1994, bệnh này lan rộng và xâm nhập vào các trại nuôi ở nam Nhật Bản, Thái Lan, Indonesia và bờ biển phía tây của Ấn Độ. Sau đó một năm, bệnh xuất hiện ở cả khu vực Thái Bình Dương đã làm thiệt hại nặng, sau 3 năm bệnh lan khắp nơi trong các trại nuôi qui mô nhỏ ở Bắc Mỹ. Từ năm 1998 đến 1999 bệnh bắt đầu xuất hiện ở Nam Mỹ, đầu tiên là ở Ecuador sau đó là Peru và tiếp tục đến các nước ở khu vực Thái Bình Dương. Không quá 10 năm bệnh xuất hiện và lan rộng khắp toàn cầu, gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế. Ước lượng rằng qua 10 năm bệnh đã làm thiệt hại khoảng 20 - 30 tỉ USD.(Trích dẫn từ Caleb McClennen, 2004). Khi bệnh xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 1992, sản lượng tôm giảm trên 70%, thiệt hại hơn 2 tỉ USD trong 3 năm liên tiếp. Đến năm 2001 Trung Quốc lại thiệt hại trên 200.000 triệu tấn. Ước đoán tổng thiệt hại lên tới là 15 tỉ USD. Ở Thái Lan, sản lượng thiệt hại khoảng 34.000 triệu tấn/năm. Cho đến năm 1994 làm sản phẩm tồn lại khoảng 265.000 triệu tấn, thiệt hại khoảng 1,6 tỉ USD. Ở Indonesia cũng có tình trạng tương tự, sản lượng tôm khi bệnh chưa bộc phát là 17.000 triệu tấn/năm từ 1985 - 1991. Khi bệnh xuất hiện làm nền công nghiệp bị đình trệ gây tổn thất gần 1 tỉ USD trong 10 năm. Ở Ấn Độ và sau đó là Philippines cũng bị thiệt hại khá nặng khi bệnh bộc phát. Ở Châu Mỹ Latin, dịch bệnh bùng nổ vào năm 1999. Bệnh xảy ra đầu tiên ở Nicaragua nhưng chỉ ở mức nhỏ làm giảm 13% sản lượng, thiệt hại vài triệu USD. Tuy nhiên, ở các quốc gia lân cận thì không may mắn. Ở Ecuador sản lượng giảm hơn 60% trong 2 năm, kết quả là làm thiệt hại hơn 1 tỉ USD từ 1998 - 2001. Ở Panama, sản lượng giảm nhanh gần 90%, trong 3 năm gây thiệt hại trên 100 triệu USD. Tương tự, ở Peru sản lượng trong 2 năm giảm gần 90%, kết quả là thiệt hại 70 triệu USD. Vào thời điểm này các nhà khoa học có nhiều nghiên cứu để làm rõ các ổ dịch ở nhiều vùng khác nhau xảy ra ở Mỹ Latin để đối phó lại sự bộc phát của WSSV. (Trích dẫn từ Caleb McClennen, 2004) 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.1.2 Ở Việt Nam Vào giữa năm 1994, bệnh tôm xuất hiện và xảy ra khắp các tỉnh phía Nam đã gây thiệt hại lớn về kinh tế. Theo báo cáo kết quả NTTS năm 2003 cho thấy, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Chủ yếu là bệnh virus đốm trắng, bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Ở các tỉnh Bắc Trung Bộ theo các số liệu do Trung tâm Môi trường và Dịch bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I) cho thấy: Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh, thường là bệnh do virus đốm trắng, tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như Khu công nghiệp Hoằng Phụ với 70/110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Nghệ An có 9,1- 47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh virus đốm trắng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh có 67 ha bị bệnh virus đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, cũng có đến hơn 100 ha nuôi tôm bị bệnh. Tại các tỉnh miền Trung và Nam Trung Bộ, theo Phòng Bệnh học thủy sản (Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III), địa phương có tỷ lệ diện tích nuôi tôm bị bệnh thấp nhất là Khánh Hoà (14,3%), cao nhất là Ninh Thuận (52,4%). Tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này có giảm. Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Bệnh do virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt làm tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khu vực (http://vietlinh.com.vn/kithuat/benhthuysan/ banvebenhtom.htm). 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV 2.2.1 Hình thái học của WSSV WSSV có hình que, màng bao khép kín. Vỏ virus dài khoảng 210 - 380 nm và rộng nhất khoảng 70 - 167 nm. Có một đuôi phụ nằm ở cuối của virion, đôi lúc không quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996). Màng bao của virus dày 6 - 7 nm và có 1 lớp lipid, cấu trúc của màng với 2 lớp trong suốt phân biệt được nhờ vào 1 lớp đục. Nucleocapsid nằm ở phía trong màng bao gồm có các protein hình cầu với đường kính 10 nm. Khi phóng thích khỏi màng bao, nucleocapsid tăng thêm chiều dài và nằm trong virion. Kích cở của nucleocapsid thay đổi tuỳ theo loài nhưng chiều dài thường trong khoảng 180 - 420 nm và chiều rộng 54 - 85 nm, với bề dày của thành tế bào là 6 nm. Lỏi nhân gồm có ADN gắn với protein VP15 và ADN của virion nằm trong vỏ nucleocapsid (Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008). 2.2.2 Cấu trúc protein Protein của WSSV có hơn 40 loại. Một vài protein không có cấu trúc, có liên quan đến việc kiểm soát sự phiên mã (VP9), virus sinh sản được qui định từ bản sao là ADN. Có ít nhất 38 protein cấu trúc nằm trên virion. Trên màng bao là 21 loại, 10 loại ở nucleocapsid và 5 loại nằm trên vỏ (nằm giữa màng bao và nucleocapsid). Một tế bào phụ giử chức năng xâm nhập của virus được tìm thấy ở màng bao protein VP31, VP110 và VP281. Vỏ protein VP36A và nucleocapsid VP664 và VP136A. Các protein khác như VP28, VP39B, VP41A, VP41B, VP51A, VP51B, VP68, VP124, VP150, VP187, VP281, VP292 và một protein tạo keo nằm trên màng bao. Trong khi các protein VP35, VP466, VP15, VP51, VP76 và những protein khác nằm ở nucleocapsid. Các protein này có chức năng khác nhau. Khi phân tích ở mức độ tế bào sử dụng kháng thể để liên kết với các protein lạ cho thấy rằng nó làm tỷ lệ chết của tôm diễn ra chậm hơn, điều này chứng tỏ các protein như VP28, VP68, VP281, VP466 và cả VP24, có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của virus. 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Nghiên cứu gần đây cho thấy, một protein màng là 25-kDa ở tế bào máu của tôm có thể kết hợp với VP28 hoặc những virion của WSSV. Ở tôm, các protein màng bao VP31, VP33 (cũng như VP36B) và vỏ protein VP36A có khả năng làm hạn chế sự sao mã của WSSV, cho nên các protein này giử vai trò quan trọng để điều kiểm sự phát sinh bệnh đốm trắng trên tôm (Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008). 2.2.3 Gen và phân loại học Bộ gen của WSSV có dạng vòng, phân tử ADN sợi đôi với A+T khoảng 59% được phân bố đồng nhất với nhau. Kích cở gen thay đổi theo từng vùng địa lý như dòng WSSV ở Thái Lan là 293 kbp (van Hulten et al. 2001), Trung Quốc là 305 kbp (Yang et al. 2001) và dòng WSSV ở Đài Loan là 307 kbp (Chen et al. 2002). WSSV có kích thước gen lớn nhất, chỉ nhỏ hơn một số loại virus như virus gây bệnh ở A mip (1 181 404 bp), virus gây bệnh ở canarypox (359 853 bp), virus từ tảo nâu Ectocarpus (335 593 bp) và virus từ trùng đế giày Paramecium (PBCV-1) (330 743 bp)(van Hulten et al. 2001b). Phân tích trình tự gen cho thấy, bộ gen của WSSV nằm trong khoảng 531 đến 684 ORFs với mã mở đầu là ATG. Trong đó, 181-184 ORFs có khả năng mã hoá protein chức năng có kích cở khoảng 51 - 6077 aminoacid, tương ứng với 92% thông tin di truyền nằm trong bộ gen (van Hulten et al. 2001a; Yang et al. 2001). Khoảng 21 - 29% ORF mã hoá cho prôtêin của WSSV hoặc tham gia nhận dạng các protein đã biết khác như DNA polymerase (Chen et al. 2002), các tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ của ribonucleotide, thymidine kinase, thymidylate kinase, chimeric thymidine-thymidylate kinase, thymidylate synthase, dUTPase / 2 PK (Yang et al. 2001),…Ba ORF (151, 366 và 427 của dòng virus ở Thái Lan) có khả năng mã hoá các protein phức tạp của WSSV. Các nghiên cứu gần đây, cho thấy rằng WSSV cũng có 3 gen sớm (immediate early - IE) (ORFs 126, 242 và 418 của dòng virus ở Đài Loan). Các gen này phiên mã độc lập tổng hợp prôtêin trong bộ máy của tế bào vật chủ. Những gen IE có ý nghĩa quan trọng để quyết định vật chủ cảm nhiễm và có chức năng điều chỉnh các yếu tố gây nhiễm bệnh (Liu et al. 2005). Phân tích chuỗi DNA polymerase và thành phần của một vài ORFs đã biết để mã hoá cấu trúc protein của WSSV, tìm thấy sự khác biệt với nhóm baculovirus, điều đó đã chứng minh rằng WSSV không có mối quan hệ với nhóm virus này. WSSV là một loài virus mới thuộc họ virus là Nimaviridae (Vlak et al. 2005). 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.2.4 Sự biến đổi về gen và độc lực của các dòng virus Bộ gen của 3 dòng WSSV ở Thái Lan, Trung Quốc và Đài Loan đã được giải trình tự, sự giống nhau giữa các dòng này là 99,3% (Marks et al., 2003). Dòng virus ở Trung Quốc và Đài Loan có 27 đoạn gen, còn ở Thái Lan chỉ có 25 đoạn, trong đó các đoạn có kích cỡ là 0,3 ; 0,5 ; 0,7 ; 4,2 ; 4,7 ; 5,3 ; 5,4 ; 8,3 và 10,8 kbp đều giống nhau ở cả 3 dòng. Có 2 đoạn gen mà dòng virus ở Thái Lan không có, với kích thước tương ứng là 9 và 20 kbp. Còn lại khoảng 14-16 đoạn có kích cở thay đổi từ 1,2 - 18 kbp có sự khác nhau giữa các dòng. Dựa vào sự khác nhau của các vùng trong bộ gen của WSSV có thể dùng để xác định nguồn gốc, phạm vi lan truyền của bệnh từ nơi phát sinh và cũng như sự khác nhau của các dòng virus (Dieu et al. 2004; Hoa et al. 2005). Một vùng không ổn định là 9,6 kbp trong bộ gen ở dòng WSSV Trung Quốc có hoặc không có hiện diện với kích cở khác nhau tuỳ thuộc vào loài vật chủ. Từ đó cho thấy rằng sự mất đoạn có chức năng quan trọng trong độc lực của virus (Lan, Lu & Xu 2002). Các protein của 6 dòng virus được mô tả bởi Lo et al., (1999) và các dòng từ Ấn Độ và Triều Tiên có kết quả tương tự nhau là có ít nhất 3 protein cấu trúc thiết yếu (VP28, VP24 và VP19). Ngoài ra, còn tìm thấy VP15 trên 4 loài. Trình tự amino ở mã kết thúc của các protein này là giống nhau giữa các dòng (Wang et al. 2000). Độc lực của các dòng WSSV khác nhau là khác nhau. Độc lực phụ thuộc vào loài cảm nhiễm, đối với tôm thẻ chân trắng có tỷ lệ chết đến 100% khi nhiễm WSSV. Dòng virus Texas có tính độc cao nhất so với các dòng khác (Wang et al. 1999). Ngoài ra, khả năng gây độc và tính cạnh tranh của virus còn phụ thuộc vào kích cỡ của bộ gen. Dòng virus WSSV (WSSV-TH- 96-II) với kích cở gen lớn nhất (312 kbp), khả năng gây độc chậm hơn [thời gian gây chết (LT50) = 14 ngày] so sánh với dòng virus khác (WSSV-TH) với kích cở gen nhỏ hơn (292 kbp) (LT50 = 3.5 ngày). Kết quả này là do virus có kích cỡ gen nhỏ hơn thuận lợi cho quá trình sao chép của virus (Marks, 2005). 2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm WSSV gây bệnh chủ yếu trên các loài giáp xác 10 chân. Ít nhất 18 loài tôm nuôi hoặc tôm ngoài tự nhiên, 8 loài thuộc nhóm động vật vỏ giáp kín thân (caridean), 7 loài tôm hùm, 7 loài tôm, 38 loài cua, 6 loài giáp xác không thuộc bộ 10 chân, Các thành viên thuộc ngành Chaetognata và Rotifera, giun nhiều tơ và vài loài ấu trùng nước cho kết quả dương tính với kỷ thuật PCR. 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Tuy vậy, trong đó là những loài cảm nhiễm với WSSV ở mức thử nghiệm, trong thực tế chỉ 1 vài loài thu từ ngoài tự nhiên dương tính với WSSV bằng phương pháp PCR. Nhưng nhận định cho thấy các loài này không là vật chủ thiết yếu của WSSV, nhưng chúng có khả năng là vật chủ trung gian gây bệnh. (Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008). 2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật PCR-genotyping Vào năm 2003 Wongteerasupaya et al., ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping để xác định số lần lại của trình tự 54 bp bằng đoạn mồi ORF94. Kết quả cho thấy đã tìm ra được 12 dòng WSSV với số lần lặp lại khác nhau như 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 14-, 15-, 17-, 19-, 20- vùng l ặp lại. Trong đó các mẫu có 8 vùng lặp lại chiếm đa số. Các mẫu tôm này được thu từ 55 ao tôm phát bệnh ở Thái Lan. Qua đó cho thấy tiềm năng sử dụng trong nghiên cứu về dịch tể học của bệnh đốm trắng trong việc tìm hiểu nguồn gốc gây bệnh và ngăn ngừa việc lây lan. Tiếp sau đó Dieu et al., (2004) nghiên cứu dịch tể học phân tử của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở VN. Mẫu được thu ở 8 nơi khác nhau ở Việt Nam, trong đó 6 mẫu thu tại bờ biển miền Trung và 2 mẫu thu tại miền Nam - Việt Nam. Những mẫu dương tính với PCR sẽ được phân tích tiếp theo kỷ thuật PCR-genotyping sử dụng các cặp mồi ORF23/24, ORF14/15, ORF75, ORF94 và ORF125 để xác định dòng WSSV. Kết quả cho thấy, dựa vào cặp mồi ORF14/15 và ORF23/24 đã chứng minh dòng WSSV ở Việt Nam có nguồn gốc từ WSSV ở Thái Lan và Đài Loan. Tác giả đã nhận định rằng có mối quan hệ gần gũi giữa dòng WSSV phân lập ở VN với dòng WSSV ở Thái Lan, rất có thể chúng có cùng một nòi giống. Pradeep et al., 2007 cũng tìm hiểu sự biến về vùng lặp lại của ORF94 ở mẫu cua, tôm giống, tôm thịt và tôm bố mẹ ở Ấn Độ tìm thấy 13 nhóm vùng lặp lại từ 2 -16 vùng (không thấy 11 và 15 kiểu gen), trong đó 7 vùng lặp lại chiếm ưu thế. Vào năm 2005 Hoa et al., đã thiết lập và sử dụng qui trình PCR-genotyping để kiểm tra sự khác nhau của các chủng WSSV phân lập từ tôm và các loài giáp xác thu ở các khu vực khác nhau của đồng bằng sông cửu long. Qui trình PCR-genotyping này phát hiện được sự khác nhau về số lượng cũng như trình tự ribonucleotide ở đoạn gen sao chép nối tiếp có 54 nucleotide. Đoạn sao chép nối tiếp này nằm giữa đoạn gen mã hoá cho hai tiểu đơn vị của ribonucleotide reductase. Kết quả cho thấy rằng qui trình PCR-genotying có 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com thể xác định được những chủng WSSV đặc trưng và có thể giúp tìm hiểu ra nguồn gốc lây lan của mầm bệnh WSSV. 2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR 2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành mạch đơn, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 94 - 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn lai: ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. - Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 72oC tạo điều kiện tốt cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo ngyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymeraza hoạt động. (Trích dẫn từ Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). 2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR như ADN khuôn, enzyme, mồi và nhiệt độ gắn mồi, nồng độ các nucleotide, nồng độ Mg+, số lượng chu kỳ phản ứng,…nhưng đáng quan tâm nhất là cặp mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và DNA thật tinh sạch thì phản ứng PCR mới tối ưu (trích dẫn từ Trần Thị Mỹ Duyên, 2006). 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.3.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR Ngày nay, phương pháp PCR đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu khoa học cũng như y học và khoa học hình sự như xác định trình tự các đoạn ADN, tiến hoá phân tử, phục hồi gen, phát hiện mầm bệnh, vi sinh vật, tạo đột biến gene và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của các loài động vật và thực vật…Trong Thủy sản PCR đã được áp dụng để phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thuỷ sản có chất lượng tốt trong sản xuất giống và ương nuôi. Đồng thời PCR còn được ứng dụng đánh giá xu hướng an toàn hàng thuỷ sản (xuất khẩu) và góp phần vào qui trình xác định trình tự nucleotide đột biến của các tác nhân gây bệnh, hay các loài động vật thuỷ sản (trích dẫn từ Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Chương III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ 25/12/2008 – 30/04/2009 Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ sản - Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ và hoá chất Dụng cụ: - Que nghiền - Eppendorf 1,5ml, 0,5 ml, 0,2ml - Bộ pipette, găng tay - Đầu col 200µl và 1000µl. - Máy ủ - Máy PCR - Thiết bị chụp ảnh gel - Máy ly tâm - Cân điện tử - Máy vortex - Bếp nhiệt khô - Máy sấy chân không - Bộ điện di - Lò vi sóng (microwave),.. Hoá chất: - Ly trích: CTAB Solution, Dissolve solution, ethanol 95%, Chloroform, dung dịch TE. - Khuếch đại: nước cất tiệt trùng, dung dịch Buffer 10X, MgCl2 25mM, dNTP mix 10 mM, Taq ADN Polymerase, mồi ORF 94 - F, mồi ORF 94 - R và mồi ORF 125 flank (Forward, Reverse). - Điện di: Agarose, Ethidium bromide, 6X loading Dye, thang ADN 1 kb plus (Invitrogen) và thang ADN 100 bp plus. 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu axit nucleic trữ năm 2006 (67 mẫu - Cà Mau và 87 mẫu - Bạc Liêu) - Mẫu tôm sú thu ở tỉnh Cà Mau vào năm 2008 (231 mẫu, Cà Mau). 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit IQ-2000 WSSV (Công ty Farming Intelligene Technology Coperation, Đài Loan), gồm các bước sau: Chuẩn bị mẫu Cho khoảng 20mg mang tôm vào ống eppendorf (1,5ml) chứa 0,6ml dung dịch DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền. Ly trích ADN Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 75oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 700 µl Chloroform, vortex kỹ 20 giây và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong ở trên sang ống eppendorf 1,5ml mới, thêm 100µl CTAB Solution và 900 µl nước cất, lắc đều, sau đó ủ ở 75oC trong 5 phút. Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ phần nước trong ở trên, hoà tan phần còn lại bằng 150 µl Dissolve solution, ủ ở 75oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuy ển phần dung dịch trong phía trên sang eppendorf mới có chứa 300 µl ethanol 95%. Lắc đều, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa ADN với 200 µl ethanol 70%, để lắng xuống. Làm khô ADN và hoà tan trong TE. Bảo quản ADN ly trích ở -80oC. Khuếch đại ADN Thực hiện phản ứng PCR 2 bước + Phản ứng PCR bước 1: 8 µl/phản ứng First PCR PreMix IQzyme ADN Polymerase 2 U/µl 7,5 µl 0,5 µl + Phản ứng PCR bước 2: 15 µl/ phản ứng 14 µl Nested PCR PreMix 1 µl IQzyme ADN Polymerase 2 U/µl 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com