Ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm

  • Số trang: 40 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 84 |
  • Lượt tải: 0
nguyen-thanhbinh

Đã đăng 8358 tài liệu

Mô tả:

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Vì tầm quan trọng của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên nhóm chúng tôi đã lựa chọn ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm làm đề tài báo cáo. 3 DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ Trang Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat.......................... 14 Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá......................................................... 27 Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain)...................................... 6 Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin).................................... 7 Hình 3: Bào tử xạ khuẩn............................................................................... 10 Hình 4: Sản xuất Fomat.................................................................................. 13 Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease............................ 10 Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền........... 25 Sơ đồ 3: qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật.......... 26 Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm................. 28 Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật........ 29 Sơ đồ 6: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp thủy phân......... 30 4 NỘI DUNG Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20 – 30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống. Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%). 1. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 1.1. Giới thiệu chung Nhóm enzyme protease (peptidase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. 5 Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptitd định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,… Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhày thành ruột. Các acid amin tự do và các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thành ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột. Các acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa. Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm đó hay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực phẩm. 6 Trong nhiều trường hợp các tính chất protein thực phẩm được cải thiện nhờ thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy phân hạn chế có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia). Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin) 1.2. Phân loại protease  Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme;  Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase;  Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia thành hai loại:  Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptit;  Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.  Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:  Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động 7 xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.  Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.  Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.  Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.  Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:  Protease acid: pH = 2 – 4;  Protease trung tính: pH = 7 – 8;  Protease kiềm: pH = 9 – 11. 1.3. Nguồn thu protease vi sinh vật Trong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. 1.3.1. Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó 8 protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12. 1.3.2. Nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất fomat. 1.3.3. Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus... 9 Hình 3: Bào tử xạ khuẩn Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. 1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vật Sự thu nhận protease từ vi sinh vật trải qua các giai đoạn chính có thể tóm tắt thành sơ đồ như sau: Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease 10 1.4.1. Tuyển chọn chủng: Yêu cầu tuyển chọn chủng tổng hợp được enzyme cần thiết, với lượng đáng kể và hoạt tính cao. Đối với việc thu protease thì thu từ nguồn như nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn. Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực phẩm…Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp được một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), người ta cần tiến hành gây đột biến bằng phương pháp sinh học, lý, hóa học… để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp enzyme”. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn cần được nhân giống và nuôi trong điều kiện tối ưu để chúng sinh sản và phát triển tốt, tổng hợp nhiều enzyme. 1.4.2. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease: Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. Về phương pháp nuôi cấy hiên nay người ta thường dùng hai phương pháp sau:  Nuôi bề mặt (môi trường nuôi dạng rắn) hay trên bề mặt dạng lỏng;  Nuôi bề sâu (nuôi chìm) – môi trường nuôi dạng lỏng. 1.4.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme: Tách chiết enzyme theo các công đoạn như sau: 11  Phá vỡ màng tế bào để giải phóng enzyme: có thể dùng các phương pháp vật lý, hóa học, cơ học…;  Dùng dung môi chiết enzyme: thường dùng nước, NaCl, dung dịch đệm có pH ổn định và phù hợp với enzyme;  Lọc, ly tâm;  Kết tủa enzyme: có thể dùng dung môi hữu cơ (ethanol, acetol), dùng muối, điểm đẳng điện pH = pI;  Ly tâm, tách tủa;  Sấy kết tủa cho đến khô. Qua các bước như trên ta thu được enzyme chưa tinh khiết, cần qua giai đoạn tinh sạch enzyme để được enzyme tinh khiết. Có nhiều phương pháp tinh sạch như sau:  Phương pháp thẩm tích Dialise: là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấm chỉ cho những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua;  Phương pháp kết tủa phân loại: thay đổi nồng độ chất kết tủa;  Phương pháp điện di;  Phương pháp lọc gel (gel Sephadex);  Phương pháp sắc ký. 2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa 2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa [4]: Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất. Các sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau. Sữa chứa hầu hết các men có trong tự nhiên. Các men này vào sữa theo tuyến sữa và từ các vi sinh vật trong không khí hay dụng cụ chứa sữa như lipase, protease. Protease tham gia vào quá trình thủy phân protein tạo thành các sản phẩm như pepton, acid amin,.... Một số peptone được hình thành có thể gây vị đắng trong sữa. Protease được hình thành tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ 76 ÷ 78oC. 12 Khi điều kiện vệ sinh không tốt, một số men tạo ra từ các nguồn vi sinh vật xâm nhập vào gây tác hại đến sữa. Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượng của sữa ban đầu. Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong kiểm tra chất lượng sữa. Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và tính cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường. Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú và chiếm một vị trí quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa. Có thể kể ra đây là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…do đó các enzyme sử dụng trong công nghiệp sữa ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng, có thể kể đến như rennin (chymosin), pepsin có thể làm đông tụ sữa được dùng trong sản xuất fomat, sữa đông tụ… 2.1.2. Ứng dụng trong việc sản xuất fomat: 13 Hình 4: Sản xuất Fomat Fomat là sản phẩm chế biến từ sữa có sử dụng quá trình lên men lactic. Đây là môt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và thích hợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ. Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ mức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat. Protease được thu nhận từ một số vi sinh vật như Asp. candidus, P. roquerti, Bac. mesentericus,… Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat Nhóm Nguồn gốc Dạ dày bê Dạ dày cừu Dạ dày dê Động vật Chymosin và pepsin Dạ dày heo Thực vật Cynara cardunculus Vi sinh vật Vi sinh vật chuyển gen gastriscin Chymosin và pepsin Pepsin A, B và gastricin Cyprosin 1, 2, 3 hoặc cardosin A, B Aspartic protease Chymosine B Kluyveromyces lactis Chymosin từ bê 2.1.2.1. Rhizomucor miehei R. pusillus Cryphonectria parasitica Aspergillus niger Tên enzyme Chymosin A, pepsin và Rennin:  Khái niệm chung:  Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hoá ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin. 14  Rennin có trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê… mới đẻ), đặc biệt ngăn thứ tư dạ dày bê. Khi con vật lớn hơn 5 tháng tuổi, bắt đầu ăn, hàm lượng rennin giảm dần và được thay thế bằng pepsin.  Từ năm 1971, người ta đã thành công trong việc dung chymotrypsin cố định trên carboxylmethylcellulose để làm dông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền [3].  Phân loại:  Rennin là một protease acid tính, số phân loại E.C.3.4.4.3. Rennin đặc biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu casein của sữa).  Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptit trong protein có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da. Rennin tinh khiết có dạng tinh thể hình lập phương. Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptit có gắn glycine trong mạch có vòng cacbon. Các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt động. Trong thành phần hoá học, rennin chứa nhiều amino acid có tính acid nhưng ít hơn pepsin. Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin.  Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin:  Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin pI = 4,5. Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm qua màng tế bào ở môi trường kiềm.  Đặc hiệu thuỷ phân:  Rennin chỉ thuỷ phân các liên kết peptit và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amin. Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi tyrosine và phenylalanine.  Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính thuỷ phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH = 6,8 rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 số liên kết peptit trong phân tử casein.  Sự hoạt hoá prorennin thành rennin: 15  Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite được giữ lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme.  Quá trình hoạt hoá prorennin giống sự hoạt hoá pepsinogen, ở pH < 3 quá trình chuyển hoá từ prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh. Nhưng quá trình hoạt hoá prorennin không phải là quá trình tự xúc tác và peptit được giải phóng ra không thể có tác động kìm hãm với rennin.  Các yếu tố ảnh hưởng:  Hoạt động xúc tác tối ưu của rennin ở pH = 3,7; pH tối ưu của rennin nằm ở vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tuỳ theo cơ chất vào khoảng 3,4 – 4. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH = 3,7, các ion Ca2+ làm tăng hoạt độ rennin, những cation hoá trị 1+ làm giảm hoạt độ của nó.  Ở pH = 7 có sự tự phân huỷ và hoạt tính thuỷ phân của rennin ở pH này rất thấp. Hoạt tính bị giảm khi pH > 6 kèm theo sự xuất hiện protein kết tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao.  Rennin tiếp xúc trong môi trường kiềm yếu pH = 9 sẽ bị bất hoạt dần nhưng trong môi trường acid mạnh sẽ bất hoạt nhanh chóng.  Bảo quản rennin:  Dịch rennin có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu trắng đến nâu nhạt.  Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15oC. Dịch rennin được bảo quản ở nồng độ cao 14 – 20% và có thể thêm Na – benzoate và propylene – glycol để bảo quản.  Thu nhận enzyme rennin:  Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi.  Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh , không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%. 16  Xay nhuyễn: Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng nhỏ khoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo điều kiện cho quá trình trích ly.  Chiết enzyme và chỉnh pH = 4:  Bản chất của quá trình chiết tách enzyme từ màng nhầy dạ dày động vật là sự phối hợp của ba giai đoạn: phá vỡ tế bào, hoạt hoá và chiết tách enzyme.  Có hai phương pháp là: phương pháp chiết và phương pháp tự phân. Cả hai phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: enzyme rennin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid.  Phương pháp 1: phương pháp chiết: dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền ngâm vào nước 5% butanol hay glycerin có cloroform để tránh nhiễm khuẩn, thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường. Sau đó chế hoá bằng etanol để rennin kết tủa.  Phương pháp 2: phương pháp tự phân:  Niêm mạc dạ dày xay nhỏ, dùng HCl hay H 3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hoá prorennin thành rennin. HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật giúp prorennin được hoạt hoá thành rennin. Thời gian tự phân 30 giờ ở 40 – 42oC.  Dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường về 4 sẽ cho hoạt tính enzyme cao, khả năng hoà tan tốt.  Chiết enzyme dựa theo phương pháp tự phân do phương pháp này có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào, hiệu suất thu enzyme cao hơn phương pháp chiết 5–7 lần.  Phối trộn NaCl 12% vào dạ dày bê theo tỉ lệ 1: 3 giúp cho quá trình chiết tách .  Khuấy: khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri benzoat 1% để tránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hoá,.. 17  Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn để thu được dịch enzyme.  Kết Tủa: tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối NaCl nồng độ bão hoà 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ đến khi dung dịch bão hoà, để tủ lạnh 20 phút. Tủa bằng muối trung tính có nồng độ cao để kết tủa thuận nghịch enzyme mà không làm giảm hoạt tính của chúng. Ngoài ra, có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulfate, cồn tuyệt đối, aceton, izopropanol… Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính enzyme. Do đó, dung dịch sau tự phân đã lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5–10 phút, nhiệt độ thấp 0–5oC.  Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm lạnh ở 4oC, trong 45 phút, tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa.  Tinh sạch enzyme rennin: Có thể sử dụng hai phương pháp sau:  Phương pháp1: thẩm tích bằng màng bán thấm (cellophan) Nguyên tắc: Màng bán thấm (cellophane) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dùng để tách muối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất có phân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến khi đạt cân bằng nồng độ. Cho dịch rennin thô vào giấy cellophan, đặt vào nước cất lạnh có nhiệt độ 0–4oC, khuấy và thay nước cất lạnh cho đến khi thử âm tính với AgNO3, thời gian thẩm tích khoảng 2 ngày đêm.  Phương pháp 2: phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G–50 Nguyên tắc: Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình 18 tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau. Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau đó, chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng. Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau.  Sấy đông khô:  Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: Nguyên tắc của phương pháp sấy đông khô là tách nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng (nước). Nhờ vậy, nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu.  Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1– làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm eutectic - điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha rắn cùng tồn tại - đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đoạn kế tiếp. Giai đoạn 2– sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống -40oC để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh. Giai đoạn 3– sấy bậc 2: giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn sấy bậc 1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hoá lý. Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tục thúc đấy quá trình thăng hoa.  Tính chất của sản phẩm sấy đông khô: Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng, mất đi tính chất ban đầu thì phương pháp này giúp cho enzyme giữ nguyên được tính chất hoá lý và có thể bảo quản trong thời gian dài. Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặc phớt hồng. 2.1.2.2. Quy trình chế biến fomat:  Giai đoạn lên men sữa, kết tủa casein: 19 Sữa sau khi đã thanh trùng Pasteur ở 85 – 95 oC từ 15 - 20 phút, dùng chế phẩm men Rennin và vi khuẩn lactic để kết tủa sữa. Vi khuẩn lactic lên men sinh ra acid lactic, làm giảm pH môi trường tạo điều kiện thuận lợi để casein kết tủa và enzyme Rennin giúp cho sự kết tủa casein tốt hơn, casein lắng xuống và thu được fomat. Ngoài tác dụng kết tủa, Renin còn thủy phân một phần casein thành pepton, acid amin… Chú ý: Thanh trùng để tiêu diệt các loại vi trùng là cần thiết. Tuy nhiên, thanh trùng đã phá vỡ cân bằng giữa các muối, làm giảm hàm lượng muối calci mà kết quả là làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng men sữa (rennin). Để khắc phục nhược điểm này, người ta phải bổ sung calci dưới dạng CaCl 2.  Giai đoạn ép nén tách huyết thanh: Phần casein kết tủa được ép từ 20 - 24 giờ, ở nhiệt độ 35 – 50 oC. Trong thời gian này sự lên men lactic vẫn tiếp tục mạnh mẽ. Sau khi ép huyết thanh ra khỏi cục sữa kết tủa, Fomat lúc này có thành phần chủ yếu là casein và lipid. Huyết thanh sữa bị loại ra chứa lacto, lactalbumin, lactoglobulin…  Giai đoạn muối fomat: Khối fomat sau khi tách huyết thanh sẽ cho vào bể nước muối nồng độ 24% ngâm trong vài ngày để tăng vị mặn, tạo sự đồng nhất về thành phần cho khối fomat và kìm hãm vi sinh vật có hại phát triển chủ yếu là trực khuẩn đường ruột.  Giai đoạn ủ chín: Sau khi muối xong, khối fomat được chuyển vào hầm lên men ở nhiệt độ 18 – 22oC, độ ẩm 80 - 90%. Quá trình lên men chậm dần do đường lactoza đã bị tách hầu hết trong giai đoạn ép nén. Trong khối fomat, vi khuẩn Propionic hoạt động mạnh, lên men lactic thành acid propionic, acid acetic và CO 2. Cả hai acid này làm cho Fomat có vị chua, hăng đặc biệt. Sự lên men propionic sẽ kết thúc sau 2 – 2,5 tháng. Giai đoạn này gọi là quá trình ủ chín. Tuy vậy, quá trình ủ chín Fomat vẫn được tiếp tục một thời gian nữa cho fomat hoàn toàn chín. Trong thời gian này casein tiếp tục được phân giải thành đạm dưới tác dụng của enzyme Rennin và vi 20 khuẩn lactic. Khi fomat chín thì 2/3 casein được phân giải thành pepton, acid amin và một ít NH3. Fomat được bảo quản lạnh, bao gói bằng một số vật liệu thích hợp, cách ẩm và chống oxy hóa tốt để sử dụng lâu dài và vận chuyển đi xa. 2.2. Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm Nước mắm là loại thực phẩm, gia vị giàu dinh dưỡng, chứa nhiều loại acid amin, đặc biệt là các loại acid amin không thay thế. Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ vi sinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành acid amin, peptid. Thành phần đạm có trong nước mắm: Đạm toàn phần 13 – 30g/l Đạm formon 12 – 18g/l Đạm NH3 4 – 6g/l 2.2.1. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm Gồm 3 hệ enzyme lớn:  Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase): Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích từ 5–7, pI = 4–5, nó ổn định với ion Mg 2+, Ca2+và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+..  Hệ enzyme serin-protease: Điển hình là enzyme trypsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín (protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng pepton). Hệ enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều 21 lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5–10, mạnh nhất ở pH=9.  Hệ enzyme acid-protease: Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm. 2.2.2. Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha  Pha 1 (trong khoảng 25 ngày đầu): Có sự gia tăng thể tích của phần chất lỏng nổi ở trên bề mặt sản phẩm và protein hòa tan.  Pha 2 (80 – 120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp xúc với enzyme, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng thích. Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120 – 140 ngày.  Pha 3 (140 – 200 ngày): Enzyme phóng thích và tấn công vào các phần protein hòa tan. Đây là nguyên nhân làm thay đổi hợp chất Nitơ. Ngoài ra đường, chất béo cũng bị phân giải thành rượu và các acid hữu cơ. 2.2.3. Nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm  Nhiệt độ: Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó sẽ không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệ enzyme serin–protease mất hoạt tính. Quá trình thủy phân kém. Vì vậy phải tạo một nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động. Nhiệt độ 30 – 47oC thích hợp cho quá trình chế biến chượp. Chượp càng phơi nắng nhiều nước mắm càng ngon, càng rút ngắn đườc thời gian “chượp chín” tăng hiệu suất thủy phân. Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các hệ enzyme trong cá mất hoạt tính. 22
- Xem thêm -