Tài liệu ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI VIỆN SINH HỌC NÔNG NGHIỆP CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 ------------------------------ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ĐỘT BIẾN IN VITRO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG, HOA CÚC Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sinh học Nông nghiệp Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh 8819 Hà Nội - 6/2011 Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   MỤC LỤC Mục lục................................................................................................................... i Danh mục các ký hiệu viết tắt .............................................................................. iv Danh mục bảng..................................................................................................... vi Danh mục hình ....................................................................................................xii ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 3 I. Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng.......................................................... 3 1.1. Nguồn gốc, phân loại ..................................................................................... 3 1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng........................................... 3 1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng ...................................................... 4 1.4. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước .................. 5 II. Giới thiệu chung về cây hoa cúc ...................................................................... 7 2.1 Nguồn gốc và phân loại cây hoa cúc............................................................... 7 2.2 Giá trị của cây hoa cúc .................................................................................... 9 2.3 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới và Việt Nam ................................. 10 III.Ứng dụng của đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc 12 3.1. Khái niệm về đột biến .................................................................................. 12 3.2 Các tác nhân gây đột biến ............................................................................. 12 3.3. Ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc................................................................................................................ 16 3.5 Ứng dụng các phương pháp chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây hoa cẩm chướng, hoa cúc.................................................................................................. 22 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 26 2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 26 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 31 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................ 31 2.3.2. Các phương pháp xử lý đột biến in vitro .................................................. 32 2.3.3. Các phương pháp chọn lọc cá thể đột biến sau xử lý................................ 33   i Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   2.3.4. Phương pháp khảo nghiệm dòng đột biến................................................ 37 2.3.6. Phương pháp phân tích số liệu .................................................................. 39 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.......................... 40 1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY CẨM CHƯỚNG................... 40 1.1. Thu thập và lựa chọn mẫu giống nghiên cứu ............................................... 40 1.2. Nghiên cứu nuôi cấy, tái sinh in vitro cây cẩm chướng............................... 42 1.3. Nghiên cứu tạo cây cẩm chướng gấm đa bội bằng xử lý colchicine in vitro ..................................................................................................................... 54 1.4. Nghiên cứu tạo đột biến bằng xử lý EMS (Ethyl methanesulfonate) in vitro cho cây cẩm chướng ................................................................................... 71 1.5. Nghiên cứu tạo cây cẩm chướng đột biến bằng xử lý chiếu xạ in vitro ............ 96 1.5.1. .Nghiên cứu xử lý chiếu xạ tia gamma, tái sinh và nhân nhanh mẫu sau xử lý chiếu xạ in vitro.............................................................................................. 97 1.5.2. Chọn lọc các dạng đột biến ..................................................................... 101 1.5.3. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột biến đã chọn lọc sau xử lý in vitro. ........................................................................... 107 1.5.4. Đánh giá sự ổn định di truyền của các dòng cẩm chướng đột biến đã được chọn lọc .................................................................................................... 109 1.6. Nghiên cứu chọn tạo giống cẩm chướng đột biến bằng xử lý EMS kết hợp với tia gamma in vitro ................................................................................ 114 1.6.1. Nghiên cứu xử lý đột biến, tái sinh và nhân nhanh mẫu sau xử lý kết hợp tia gamma và EMS ..................................................................................... 114 1.6.2. Chọn lọc các dạng đột biến ..................................................................... 119 1.7. .Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng cẩm chướng sau xử lý đột biến in vitro bằng chỉ thị phân tử SSR ...................................................................... 122 1.7.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ............................................................. 122 1.7.2. ..Đánh giá sự khác biệt di truyền các dòng cẩm chướng đột biến với giống gốc bằng chỉ thị SSR ......................................................................................... 122 2 .CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY CÚC.................................... 129 2.1. Thu thập và lựa chọn mẫu giống cúc ......................................................... 129 2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh thích hợp cho các giống hoa cúc ................... 131 2.2.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu......................................................... 131 2.2.2. Kết quả tạo callus .................................................................................... 132   ii Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   2.2.3. Kết quả nghiên cứu tái sinh cây từ callus ............................................... 134 2.2.4. Kết quả nhân nhanh đối với chồi hoa cúc. .............................................. 136 2.2.5 Kết quả nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh .......................................... 138 2.3 Nghiên cứu xử lý đột biến bằng chiếu xạ tia gamma, tái sinh và chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ gamma............................................................... 140 2.3.1. Kết quả xử lý đột biến bằng tia gamma .................................................. 140 2.3.2. Kết quả ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma đến khả năng tái sinh của callus.................................................................................................................. 141 2.3.3. Chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ gamma............................... 143 2.4 .. Nghiên cứu xử lý đột biến bằng chiếu xạ tia X, tái sinh và chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ X............................................................................... 146 2.4.1 Kết quả xử lý đột biến bằng chiếu xạ tia X.............................................. 146 2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ tia X đến khả năng tái sinh của callus.................................................................................................................. 147 2.4.3 Chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ X......................................... 148 2.5. Trồng và đánh giá các dòng cúc đột biến qua các thế hệ........................... 150 2.5.1 Kết quả đánh giá đặc tính nông sinh học của các dòng cúc đột biến ở thế hệ M1V12............................................................................................................... 150 2.5.2 Kết quả đánh giá về sâu bệnh của các dòng cúc đột biến ........................ 155 2.5.3 Kết quả đánh giá về năng suất hoa của các dòng cúc đột biến ................ 156 2.5.4. Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các dòng cúc đột biến bằng chỉ thị RAPD ........................................................................................................... 161 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 166 4.1. Kết luậnchung: ........................................................................................... 166 4.1.1. Về khối lượng công việc và mục tiêu của đề tài ..................................... 166 4.1.2. Về các nội dung khoa học của đề tài....................................................... 166 4.2. Đề nghị: ...................................................................................................... 168 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 169   iii Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT 1   Ký hiệu αNAA Tên đầy đủ Naphthyl acetic acid 2 3 4 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AP- PCR Arbitrarily Primer Polymerase Chain Reaction Agar Thạch 5 6 7 8 9 BA bp CN CTAB CT 6 – Benzylaminopurin Base pair (cặp bazơ nitơ) Công nguyên Cetyl trimethylammonium bromide Công thức 10 11 12 CS DNA dNTP Cộng sự Deoxyribonucleic acid Deoxynucleotide Triphosphates 13 14 15 ĐB ĐC EDTA Đột biến Đối chứng Ethylen Diamine Tetra Acetic acid 16 17 EMS EtBr Ethylmethane sulphonate Ethidium Bromide 18 19 20 Gy HPLC HSN Gray High-performance liquid chromatography Hệ số nhân 21 22 23 IAA IBA Kinetin 3- Indoleaxetic axit 3-Indolebutyric axit 6 – Furfurylaminopurin 24 25 26 27 28 Krad Kb LD50 MES mRNA Kilorad Kilobase Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm Monohydrate Messenger Ribonucleic acid 29 30 MS M1V12 Murashige and Skoog Mutant 1- Vegetative 12 iv Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc     32 33 34 35 36 NST PCR PVP RNAi RT- PCR Nhiễm sắc thể Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Polyvinyl pyrrolidone Ribonucleic acid interference Reverse transcription PCR 37 38 39 SDS SSR TBE Sodium Dodecyl Sulphate Simple sequence repeats Tris – boric acid – EDTA 40 41 42 TE THT TL Tris – EDTA Than hoạt tính Tỷ lệ 43 TB Trung bình v Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các giống gốc và các dòng đột biến sử dụng trong phân tích khác biệt di truyền bằng chỉ thị phân tử.................................................. 27 Bảng 2.2: Các mồi RAPD sử dụng trong phân tích ............................................ 29 Bảng 2.3: Các mồi SSR sử dụng trong phân tích................................................ 30 Bảng 3.1. Một số đặc điểm của các giống cẩm chướng thu thập....................... 40 Bảng 3.2a: Ảnh hưởng của xử lý đơn chất HgCl2 0,1% đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy (sau 4 tuần nuôi cấy)........................................ 43 Bảng 3.2b: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp HgCl2 0,1% và Javen (4%) đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy (sau 4 tuần nuôi cấy)................ 43 Bảng 3.3a: Ảnh hưởng của BA tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Trắng viền tím (sau 4 tuần theo dõi) ....................... 44 Bảng 3.2b: Ảnh hưởng của BA tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Đỏ (sau 4 tuần theo dõi) .......................................... 44 Bảng 3.4a: Ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Trắng viền tím (sau 4 tuần theo dõi)................... 46 Bảng 3.4b: Ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Đỏ (sau 4 tuần theo dõi)...................................... 46 Bảng 3.5a: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Trắng viền tím (sau 4 tuần theo dõi) .................................................................................................. 47 Bảng 3.5b: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Đỏ (sau 4 tuần theo dõi) ............. 48 Bảng 3.6b. Ảnh hưởng của α NAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới khả năng ra rễ của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Đỏ.............. 49 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của thời gian xử lý HgCl2 1% tới tỷ lệ sống và vô trùng của giống cẩm chướng gấm (theo dõi sau 4 tuần)......................... 51 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và Ki đến sự phát sinh hình thái của đoạn thân có chồi nách (theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy) ........................... 52 Bảng 3.9: Nghiên cứu khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của cây cẩm chướng gấm (sau 3 tuần nuôi cấy) .......................................................... 53   vi Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý cochicine in vitro đến khả năng sống, tái sinh và nhân nhanh mẫu (sau 4 tuần xử lý) ...... 55 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của xử lý colchicine đến sự biến dị của các chồi tái sinh (sau 4 tuần xử lý)............................................................................. 55 Bảng 3.12: Sự sinh trưởng của các dạng chồi biến dị sau xử lý colchicine in vitro ... 56 Bảng 3.13: Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng cây sau xử lý colchicine in vitro ngoài tự nhiên ............................................................................. 58 Bảng 3.14: Tỷ lệ các dạng biến dị phân lập được ............................................... 59 Bảng 3.15: Sự sinh trưởng của các dạng biến dị thu được sau xử lý colchicine ................................................................................................ 60 Bảng 3.16: Một số chỉ tiêu đánh giá khả năng đa bội của các dạng cây ............ 61 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và hệ số nhân in vitro của dòng cẩm chướng D7 và D9 (sau 4 tuần theo dõi) .... 63 Bảng 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng ra rễ in vitro của dòng cẩm chướng D7 và D9 (sau 3 tuần theo dõi) ................................. 64 Bảng 3.19. Một số chỉ tiêu sinh trưởng sinh dưỡng của các dòng cẩm chướng D7 và D9 (vụ Xuân Hè 2010 tạiViện Sinh học Nông nghiệp) ................. 65 Bảng 3.20. Một số chỉ tiêu về năng suất và chất lượng hoa của hai dòng cẩm chướng gấm đa bội (vụ Xuân Hè 2010 tại Viện Sinh học Nông nghiệp) .... 66 Bảng 3.21. Tỉ lệ sâu bệnh hại trên các dòng cẩm chướng .................................. 67 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và tái sinh chồi in vitro của giống Đỏ ........................................................................................... 71 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của chồi giống Đỏ xử lý 1h (sau 4 tuần theo dõi) ......................................... 73 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của chồi giống Đỏ xử lý 2h (sau 4 tuần theo dõi) ........................................ 73 Bảng 3.25: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của chồi giống Đỏ xử lý 3h (sau 4 tuần theo dõi) ......................................... 74 Bảng 3.26: Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và tái sinh của chồi in vitro giống Trắng viền tím ...................................................................... 75 Bảng 3.28: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi giống Trắng viền tím xử lý 2h (sau 4 tuần theo dõi) ....... 77   vii Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   Bảng 3.29: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi giống Trắng viền tím xử lý 3h (sau 4 tuần theo dõi) ....... 78 Bảng 3.30: Sự sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm chướng sau xử lý EMS ở điều kiện tự nhiên ....................................................................... 80 Bảng 3.31: Tỷ lệ biến dị của một số dòng cẩm chướng sau xử lý EMS............. 81 Bảng 3.32: Một số đặc điểm nông sinh học của các dạng đột biến và giống gốc ................................................................................................ 83 Bảng 3.33: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng (BA và Ki) đến khả năng nhân nhanh của các dòng cẩm chướng đột biến sau xử lý EMS in vitro ..... 84 Bảng 3.34: Nghiên cứu khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của 2 giống cẩm chướng MDC- 1 và MDC-2 (sau 3 tuần nuôi cấy) ......................... 85 Bảng 3.35: Đặc điểm nông sinh học của dòng cẩm chướng đột biến và giống gốc trồng tại Đại học Nông nghiệp Hà Nội vụ Đông xuân (2009 – 2010) .......................................................................................... 86 Bảng 3.36: Đặc điểm nông sinh học của dòng cẩm chướng đột biến và giống gốc trồng tại Đà Lạt GAP – Lâm Đồng vụ Hè thu 2010 .............. 87 Bảng 3.37: Đặc điểm nông sinh học của dòng cẩm chướng đột biến và giống gốc trồng tại Sapa – Lào Cai vụ Hè thu 2010............................... 87 Bảng 3.38: Tình hình sâu bệnh hại trên dòng cẩm chướng MDC-1 và MDC-2 (vụ Đông - Xuân 2009 - 2010, tại Đại học Nông nghiệp Hà Nội).............. 89 Bảng 3.39: Tình hình sâu bệnh hại trên dòng cẩm chướng MDC-1 và MDC-2 (vụ Hè Thu 2010, tại Đà Lạt, Lâm Đồng) .................................... 89 Bảng 3.40: Tình hình bệnh hại trên dòng cẩm chướng MDC-1 và MDC-2 (vụ Hè Thu 2010, tại Sapa - Lào Cai) ........................................................ 90 Bảng 3.41. Thu nhập thuần của trồng hoa cẩm chướng tại Đà Lạt năm 2010 (tính trên một sàoBắc bộ/vụ)................................................................... 92 Bảng 3.42. Diện tích trồng thử nghiệm cẩm chướng MDC-1 và MDC-2 tại các địa phương ........................................................................................ 92 Bảng 3.43: Ảnh hưởng của tia gamma đếnkhả năng sống,tái sinh và nhân nhanh của giống Trắng viền tím (sau xử lý 4 tuần) ............................... 97 Bảng 3.44: Ảnh hưởng của tia gamma đếnkhả năng sống,tái sinh và nhân nhanh của giống Đỏ (sau xử lý 4 tuần) .................................................. 97   viii Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   Bảng 3.45: Đặc điểm các dạng chồi tái sinh của giống Đỏ thu được sau xử lý chiếu xạ (sau 4 tuần) ......................................................................... 100 Bảng 3.46: Đặc điểm các dạng chồi tái sinh của giống Trắng viền tím thu được sau xử lý chiếu xạ (sau 4 tuần)..................................................... 100 Bảng 3.47: Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm chướng sau xử lý tia gamma in vitro của giống Trắng viền tím .............................. 101 Bảng 3.48: Tỷ lệ các dạng biến dị ở các dòng cẩm chướng Trắng viền tím sau xử lý tia gamma in vitro.................................................................. 102 Bảng 3.49. Một số đặc điểm nông sinh học của các dạng biến dị và giống gốc..... 104 Bảng 3.50. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm chướng Đỏ sau xử lý tia gamma in vitro.................................................................. 105 Bảng 3.51: Tỷ lệ biến dị của các dòng cẩm chướng Đỏ sau xử lý tia gamma in vitro ...................................................................................... 106 Bảng 3.52: Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và hệ số nhân của hai dòng cẩm chướng SP2 và SP4 in vitro (sau 4 tuần theo dõi) .......... 107 Bảng 3.53: Khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng SP2 và SP4 (sau 3 tuần nuôi cấy) ............................................................................. 108 Bảng 3.54: Đặc điểm nông sinh học của hai dòng cẩm chướng biến dị SP2, SP4 và giống gốc tại một số địa điểm trồng khảo nghiệm .................. 109 Bảng 3.55: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp tia gamma và EMS đến khả năng sống, sự sinh trưởng in vitro giống Đỏ (sau 4 tuần) ............................ 114 Bảng 3.56: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp tia gamma và EMS đến khả năng sống,sự sinh trưởng in vitro giống Trắng viền tím(sau 4 tuần) ............ 114 Bảng 3.57: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp gamma và EMS đến sự phát sinh biến dị và sinh trưởng của các chồi in vitro giống Đỏ (sau 4 tuần)...... 117 Bảng 3.58: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp gamma và EMS đến sự phát sinh biến dị và sinh trưởng của các chồi in vitro giống Trắng viền tím (sau 4 tuần)............................................................................................ 118 Bảng 3.59.Đặc điểm của các dòng cẩm chướng Đỏ sau xử lý tia gamma kết hợp EMS theo dõi trong vườn sản xuất ................................................ 120 Bảng 3.60: Đặc điểm của các dòng cẩm chướng Trắng viền tím sau xử lý tia gamma kết hợp EMS theo dõi trong vườn sản xuất ........................ 120   ix Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   Bảng 3.61: Tỷ lệ biến dị của các dòng cẩm chướng Đỏ sau xử lý tia gamma kết hợp EMS.......................................................................................... 121 Bảng 3.62: Tỷ lệ biến dị của các dòng cẩm chướng Trắng viền tím sau xử lý tia gamma kết hợp EMS............................................................................. 121 Bảng 3.63: Hệ số PIC, số alen và tống số băng DNA trên từng cặp mồi ......... 126 Bảng 3.64: Tỷ lệ khuyết số liệu(M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống cẩm chướng gốc và các dòng đột biến. ................................................. 127 Bảng 3.65. Hệ số tương đồng di truyền của các dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu ............................................................................................. 128 Bảng 3.67: Kết quả khử trùng mẫu đối với giống cúc Vàng Pha lê ................. 131 Bảng 3.68. Kết quả khử trùng mẫu của giống cúc Tím sau 1 tuần nuôi cấy .... 132 Bảng 3.69: Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống cúc vàng Pha lê sau 4 tuần nuôi cấy. .................................................... 133 Bảng 3.70. Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống cúc Tím sau 4 tuần nuôi cấy.................................................................. 133 Bảng 3.71. Kết quả tái sinh chồi của callus cây hoa cúc sau 6 tuần nuôi cấy .. 135 Bảng 3.72. Kết quả nhân nhanh chồi hoa cúc giống Pha lê (sau 4 tuần nuôi cấy).. 137 Bảng 3.73: Kết quả tạo rễ của chồi hoa cúc giống Pha lê (sau 3 tuần)............. 138 Bảng 3.74: Ảnh hưởng của chiếu xạ đến khả năng sống của callus ................. 141 Bảng 3.75: Ảnh hưởng của chiếu xạ đến khả năng tái sinh callus hoa cúc ...... 142 Bảng 3.76: Các kiểu biến dị của hoa cúc sau khi được chiếu xạ tia gamma .... 144 Bảng 3.77. Ảnh hưởng của tia X đến khả năng sống của callus hoa cúc ......... 146 Bảng 3.78. Ảnh hưởng của chiếu xạ tia X đến khả năng tái sinh của callus hoa cúc .................................................................................................. 147 Bảng 3.79. Các kiểu biến dị của hai giống cúc sau khi xử lý chiếu xạ in vitro bằng tia X...................................................................................... 148 Bảng 3.80: Động thái tăng trưởng chiều cao cây của các dòng cúc (cm) ở thế hệ M1V12, vào vụ xuân 2010 tại Tây Tựu, Hà Nội ....................... 151 Bảng 3.81.Thời gian sinh trưởng của các dòng cúc đột biến vào vụ xuân 2010 ...... 152 Bảng 3.82: Mét sè chØ tiªu vÒ chÊt l−îng hoa vụ xuân 2010 (Tây tựu, Hà nội) ........................................................................................................ 153 Bảng 3.83. Mức độ sâu hại của hoa cúc vụ xuân 2010 (Tây tựu, Hà nội)........ 155   x Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   Bảng 3.84. Năng suất và hiệu quả kinh tế của các giống hoa gốc và các dòng hoa đột biến tại Tây Tựu, Từ Liêm, Hà Nội vụ xuân 2010 ......... 157 Bảng 3.85. Đặc tính nông học chính của dòng cúc VCM-2 ............................. 158 Bảng 3.86: Đặc tính nông học chính của dòng cúc VCM-3 ............................. 159 Bảng 3.87. Diện tích trồng thử nghiệm cúc VCM-2 và VCM-3 tại các địa phương................................................................................................... 161 Bảng 3.88. Kết quả thống kê số băng DNA xuất hiện ở các mồi RAPDs ........ 162 Bảng 3.89. Hệ số tương đồng di truyền giữa 16 mẫu hoa cúc.......................... 164   xi Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá [17]..... 15 Hình 3.1. Chồi in vitro giống Trắng viền tím được nuôi cây trong các môi trường tạo rễ khác nhau.......................................................................... 50 Hình 3.2: Các dạng chồi sau xử lý colchicine in vitro giống Tím viền trắng..... 54 Hình 3.3: Dạng hoa đối chứng và đột biến ......................................................... 59 Hình 3.4: Dạng thân đối chứng và đột biến ........................................................ 59 Hình 3.5: Kích thước lá và hình dạng khí khổng của dạng cây đa bội và đối chứng....................................................................................................... 61 Hình 3.6: Xác định độ bội của giống đối chứng và dạng đột biến bằng máy Flow cytometry ....................................................................................... 62 Hình 3.7: Các dạng chồi biến dị sau xử lý EMS in vitro ở các nồng độ và thời gian khác nhau ................................................................................. 72 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của chồi giống Đỏ xử lý 1h (sau 4 tuần theo dõi) ......................................... 73 Hình 3.8: Các dạng chồi biến dị giống Trắng viền tím sau xử lý EMS in vitro ở các nồng độ và thời gian khác nhau ............................................ 76 Hình 3.10: Một số biến dị về hoa........................................................................ 82 Hình 3.11: Các dạng chồi thu được sau xử lý chiếu xạ in vitro.......................... 99 Hình 3.12: Một số dạng biến dị thân, lá............................................................ 103 Hình 3.13: Một số biến dị về hoa...................................................................... 104 Hình 3.14: Các dạng chồi thu được sau xử lý kết hợp tia gamma và EMS...... 116 Hình3.15: Nồng độ và chất lượng DNA của 16 dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu ............................................................................................. 122 Hình 3.16. Kết quả điện di các cặp mồi nhóm DCB......................................... 123 Hình 3.17. Kết quả điện di nhóm mồi CB và CF.............................................. 124   xii Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   Hình 3.18: Sơ đồ về quan hệ di truyền của một số dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu ............................................................................................. 129 Hình 3.19: Các callus hình thành từ nụ hoa ...................................................... 134 Hình 3.19: Cây hoa cúc tái sinh từ callus.......................................................... 136 Hình 3.20: Kết quả nhân nhanh chồi hoa cúcPha lê ......................................... 138 Hình 3.21: Cây hoa cúc Pha lê trên môi trường tạo rễ...................................... 139 Hình 3.22. Cúc vàng Pha lê và các dạng đột biến sau khi xử lý đột biến tia gamma. .................................................................................................. 145 Hình 3.23. Cúc Tím và các dạng đột biến sau khi xử lý đột biến tia gamma ... 145 Hình 3.24. Các dạng đột biến của giống cúc Vàng Pha lê và cúc Tím sau khi chiếu xạ tia X. ................................................................................. 149 Hình 3.25. Giống cúc VCM-2 và VCM-3 ngoài đồng ruộng ........................... 158 Hình 3.26. Giống cúc Vàng Pha lê gốc và dòng cúc VCM-2.......................... 159 Hình 3.27. Giống cúc Tím gốc và dòng cúc VCM-3........................................ 160 Hình 3.28. Kết quả điện di PCR-RAPD mồi OPA18 và mồi OPC10 .............. 163 Hình 3.29. Kết quả điện di PCR-RAPD mồi BIO12 và mồi OPM................... 163 Hình 3.30. Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các giống cúc ............................ 165   xiii Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống càng phát triển nhu cầu về hoa ngày càng tăng nên ngành sản xuất và kinh doanh hoa ngày càng được coi trọng. Theo báo cáo năm 2005 của FAO, giá trị sản lượng hoa cây cảnh của toàn thế giới năm 1995 đạt 35 tỷ USD, đến năm 2004 tăng lên 56 tỷ USD (tốc độ tăng bình quân năm là 20%); trong đó giá trị xuất khẩu đạt từ 8,5-10 tỷ USD/năm. Việt Nam là một nước nông nghiệp có nghề trồng hoa lâu đời, nhưng nó chỉ được coi là một ngành kinh tế và có giá trị hàng hoá từ những năm 1980. Theo số liệu thống kê đến nay, diện tích trồng hoa và cây cảnh ở nước ta đạt 13.400 ha, trong đó có khoảng hơn 4000 ha cây hoa. Tuy nhiên, các giống hoa, cây cảnh trồng tại Việt Nam, chủ yếu là được nhập về từ nước ngoài bằng nhiều con đường khác nhau. Điều này sẽ có ảnh hưởng lớn khi chúng ta không chỉ sản xuất nội tiêu mà còn xuất khẩu sang nhiều nước khác và đặc biệt là khi nước ta đã là thành viên của Tổ chức Quốc tế về bảo vệ các giống cây trồng mới (UPOV). Do vậy việc tạo ra những giống hoa, cây cảnh có bản quyền Việt nam là yêu cầu của thực tiễn sản xuất. Trong chọn tạo giống cây trồng việc gây đột biến thực nghiệm để đa dạng hoá nền di truyền của các vật liệu khởi đầu đã được coi là một trong những kỹ thuật có tính ứng dụng cao. Hơn nữa, cùng với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, công nghệ xử lý đột biến in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu trong tạo giống cây trồng bởi nó cho phép rút ngắn thời gian và giảm bớt chi phí trong chọn tạo giống cây trồng mới. Công nghệ xử lý đột biến in vitro đặc biệt hiệu quả trong tạo các giống hoa mới. Cho đến nay đã có 187 giống hoa cúc, 34 giống hoa thược dược, 27 giống hoa hồng, 8 giống hoa phượng tiên, 25 giống hoa thu hải đường, 18 giống hoa cẩm chướng được tạo bằng con đường đột biến, chủ yếu xử lý in vitro chồi mầm, callus, hạt phấn, bao phấn, phôi soma…(B.S Ahloowalia, M. Maluszynski, 2001). Trong khi đó, ở nước ta việc xử lý đột biến in vitro để tạo giống cây trồng hầu như chưa được quan tâm đúng mức. Trên đối tương cây hoa cũng mới chỉ có một vài công bố về xử lý đột biến in vitro nhưng chưa đi đến kết quả cuối cùng là tạo ra giống hoa mới [6], [9], [13].   1 Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   Trong các loại hoa được sản xuất hàng hoá, hoa cẩm chướng (Dianthus spp) và hoa cúc (Chrysanthem ssp) là các loài hoa đẹp, đa dạng về mầu sắc, bền, thuận lợi cho bảo quản và vận chuyển đi tiêu thụ. Đây là những loại hoa cắt có giá trị nhất trên thị trường hoa tươi thế giới và Việt nam. Hoa cẩm chướng, hoa cúc và hoa hồng chiếm tới 50% thị phần của thị trường hoa cắt. Ở nước ta dù diện tích trồng hoa và kim ngạch xuất khẩu hoa chưa lớn, nhưng hoa cúc và cẩm chướng luôn đứng đầu danh mục các loại hoa xuất khẩu của Việt nam (http//:www.rauhoaqua.vn). Vì vậy, việc chọn tạo giống mới của hoa cẩm chướng và hoa cúc luôn được đặc biệt quan tâm nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường và mang lại lợi nhuận cao cho người sản xuất. Trong bối cảnh nêu trên, được sự đồng ý của chương trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc” . Mục tiêu của đề tài: Mục tiêu chung: - Nghiên cứu chọn tạo giống hoa cẩm chướng và hoa cúc bằng công nghệ tế bào thực vật Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng thành công ít nhất 1 quy trình công nghệ tạo giống mới hoa cẩm chướng và 1 quy trình tạo giống mới hoa cúc bằng kỹ thuật đột biến in vitro. - Tạo được 4 giống hoa mới có giá trị cao được sản xuất chấp nhận (giống được đưa vào sản xuất thử nghiệm).   2 Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng 1.1. Nguồn gốc, phân loại Cẩm chướng hay còn gọi là hoa Phăng có tên tiếng Anh: Carnation, tên khoa học: Dianthus caryophyllus. L, thuộc chi: Dianthus, họ: Caryophyllaceae, bộ: Sentrospenmea [8]. Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI. Lần đầu tiên vào năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm. Năm 1846, họ đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoa quanh năm. Ở Việt Nam hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng từ đầu thế kỷ XIX, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, SaPa. Những năm gần đây, cẩm chướng đã được trồng ở nhiều vùng trong cả nước [5]. 1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng - Rễ: Cẩm chướng có bộ rễ chùm, có rất nhiều nhánh phát triển mạnh để hút nước, dinh dưỡng. Chiều dài của rễ 15 - 20 cm, phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm. Ở trạng thái bình thường rễ và tán cây theo tỷ lệ tương đương. Nếu đất quá nhiều phân, nhiều nước rễ sẽ sinh trưởng không tốt. Nhiệt độ đất cao cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của rễ. - Thân: Thân thảo, thân thẳng đứng, phân nhánh nhiều, chiều cao cây khoảng 30 - 100 cm (tùy theo giống) và nửa hóa gỗ. Thân rất dễ gẫy ở đốt. Các đốt cẩm chướng thường gẫy khúc. Thân thường có mầu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh. Phấn có tác dụng chống thoát hơi nước và bảo vệ cây khỏi sâu bệnh.   3 Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   - Lá: Lá kép mọc từ các đốt thân, lá mọc đối. Phiến lá dày hình lưỡi mác, mép lá trơn. Mặt lá nhẵn không có độ bóng. Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn có tác dụng làm giảm sự thoát hơi nước. Tốc độ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hè thường 4 - 5 ngày, mùa thu, mùa đông từ 7 - 10 ngày ra một đôi lá. - Hoa: Có hai dạng hoa chính: hoa chùm và hoa đơn. Về cánh hoa có thể xếp làm hai loại: hoa đơn hoa kép. Hoa đơn mọc từng chiếc một, hoa chùm có nhiều hoa trên một cành. Hoa nằm trên đầu cành và có nhiều mầu sắc khác nhau. Ngay cả trên một hoa cũng có thể có 2 - 3 mầu khác nhau. Hoa đẹp, có mùi thơm thoang thoảng. Nụ hoa có đường kính 2 - 2,5 cm. Khi hoa nở hoàn toàn có đường kính 6 – 7 cm. Chiều cao bông hoa (tính từ đốt trên cùng của cành) khoảng 4 - 7,5 cm. - Hạt: Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm trong quả. Mỗi quả thường có từ 300 600 hạt. 1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng - Ánh sáng: Cẩm chướng là cây ưa sáng và thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài. Thời gian chiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hóa hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt. Lượng chất khô và tốc độ sinh trưởng của cây tương quan thuận với cường độ ánh sáng. Cường độ ánh sáng thích hợp là 1500 – 3000 lux, tối thích: 2000 – 2500 lux. Trong quá trình phát triển, nếu cường độ ánh sáng cao (> 3000 lux) cây sẽ ra hoa sớm, nếu cường độ ánh sáng thấp (< 1000 lux) quá trình ra hoa sẽ muộn. Ở thời kỳ ra hoa rộ vào mùa nóng, lúc giữa trưa, cường độ ánh sáng mạnh, cần che bớt ánh sáng cho cây vì ánh sáng quá mạnh sẽ làm cho cánh hoa dễ bị nhạt mầu và cháy, ảnh hưởng đến chất lượng hoa. - Nhiệt độ: Cẩm chướng là cây ôn đới nên thích hợp với khí hậu mát mẻ. Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15 - 200C, nhiệt độ tối ưu là 19 - 210C. Trong khoảng nhiệt độ từ 10 - 150C cây vẫn sinh trưởng bình thường và cho chất lượng   4 Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   hoa tương đối tốt. Nếu nhiệt độ vượt quá 300C hoặc dưới 100C thì cây sinh trưởng kém, thân lá, hoa nhỏ, sản lượng và chất lượng hoa giảm, tuổi thọ ngắn. Chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hoa. Nhìn chung chênh lệch nhiệt nhiệt độ ngày đêm khoảng 100C là tốt nhất, mức chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm quá cao hoặc quá thấp sẽ làm chất lượng hoa kém, số hoa mù cao. - Nước: Hàm lượng nước trong lá cẩm chướng chiếm khoảng 70 - 80%, trong cành 68 - 70%, trong rễ 80%. Nước có vai trò vô cùng quan trọng đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng. Ẩm độ thích hợp 60 70%, ẩm độ tối thích 70%. Nếu độ ẩm ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút chất dinh dưỡng và muôi khoáng một cách thuận lợi, cây sinh trưởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao [13]. - Không khí: Cẩm chướng ưa khí hậu mát mẻ và thông thoáng. Trồng ở nơi có độ ẩm cao, kém gió sẽ bị bệnh nhiều. - Đất đai: Khoảng 70% số rễ của cẩm chướng tập trung ở tầng đất mặt (0 – 20 cm), yêu cầu đất có kết cấu tơi xốp. Độ pH thích hợp với cây cẩm chướng là từ 6,0 - 6,5. Đối với đất liên tục trồng cẩm chướng thì phải khử trùng, tiêu độc hoặc luân canh vì đất có nhiều vi sinh vật gây bệnh [5]. 1.4. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 1.4.1. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới Trên thế giới, cẩm chướng là hoa cắt cành được trồng phổ biến tại châu Âu, châu Á, châu Mỹ. Cẩm chướng cũng là loại hoa phát triển mạnh ở Kenya. Diện tích trồng hoa cẩm chướng của Kenya chủ yếu tập trung ở Ritf Valley. Cây cẩm chướng cảnh được trồng ngoài đồng không bảo vệ ở độ cao khoảng 1800 m và cẩm chướng thường được trồng trong nhà plastic ở độ cao 2700 m so với mực nước biển [23]. Ở châu Á, hoa cẩm chướng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Malaysia, Srilanka,… Ở Trung Quốc, hoa cẩm chướng cùng hoa hồng là hai loại hoa phổ   5 Báo cáo tổng kết đề tài ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc   biến nhất. Cẩm chướng chiếm khoảng 25% tổng lượng hoa trên thị trường tại Bắc Kinh và Côn Minh. Trung tâm sản xuất hoa cẩm chướng tập trung ở Côn Minh và Thượng Hải. Hầu hết các giống của Trung Quốc được nhập từ Israel, Hà Lan và Đức [49]. Tỉnh Vân Nam của Trung Quốc có kim ngạch xuất khẩu hoa cắt cành ngày càng cao, theo thống kê tháng 11 năm 2006 đạt 10,4 triệu USD với sản lượng 4,3 nghìn tấn, trong đó cẩm chướng là một trong 3 loại hoa xuất khẩu chủ lực [67]. Tại Malaysia, sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ ba sau cây hoa hồng và hoa cúc, chiếm 9,02% tổng sản lượng hoa. Ở đây, hoa cẩm chướng được trồng bao gồm cả loại hoa chùm và hoa đơn [11]. Ở Philippin, cây cẩm chướng trồng được rất ít và phải nhập khẩu từ các nước khác. Tỷ lệ nhập khẩu hoa cẩm chướng đứng thứ hai trong tổng giá trị nhập khẩu hoa với 22,05% chỉ đứng sau hoa cúc (36,98%). Năm 1996, lượng hoa cẩm chướng nhập khẩu của Philippin từ Hà Lan là 7691 kg (khoảng 620000 cành), từ Malaysia 5097 kg (khoảng 260000 cành), từ Australia 638kg (khoảng 32000 cành) và New Zealand 80 kg (khoảng 4000 cành) [46]. Tại Srilanka, hoa cẩm chướng là cây hoa ôn đới quan trọng nhất. Hoa cẩm chướng được trồng chủ yếu để xuất khẩu, còn các loại hoa khác chỉ tiêu thụ được ở nội địa. Hai giống cẩm chướng châu Mỹ và cẩm chướng Địa Trung Hải của Srilanka rất nổi tiếng trên thị trường thế giới. Một phần diện tích cẩm chướng khá lớn được trồng trong môi trường bảo vệ hoàn toàn [25]. Ixraen có 150 ha hoa cẩm chướng chiếm 7,5% tổng diện tích trồng hoa, mỗi năm nước này xuất khẩu đạt 119 triệu USD [5]. 1.4.2. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh. Các vùng chuyên hoa như An Hải (Hải Phòng), Tây Tựu - Từ Liêm, Phú Thượng - Tây Hồ (Hà Nội) trồng nhiều hoa cẩm chướng. Trước đây, vào mùa hè, hoa cẩm chướng trên thị trường nước ta chủ yếu phải nhập từ Côn Minh (Trung Quốc) và Hà Lan, vài năm gần đây, để đáp   6