Tài liệu Uận văn kỹ sư bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon) bằng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******* PHẠM MINH NHỰT BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***** BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM MINH NHỰT ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***** STANDARD CHALLENGE TEST MODEL AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY PRIMARILY INVESTIGATING PATHOGENESIS OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. NGUYEN VAN HAO PHAM MINH NHUT MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: BGH Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM và các thầy cô ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TS. Nguyễn Văn Hảo, ThS. Ngô Xuân Tuyến, CN. Đoàn Văn Cƣờng đã tận tình chỉ bảo, giải đáp các vƣớng mắc, các khó khăn mà tôi gặp phải trong suốt quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. KS. Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. TS. Lý Thị Thanh Loan đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập tại Viện. Các anh chị ở phòng Mô học tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở phòng Sinh Học Thực Nghiệm và Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình bố trí thí nghiệm. Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt và các bạn thân yêu ở lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã cùng tôi chia sẻ những cảm xúc vui buồn trong thời gian học tập và giúp đỡ, động viên tôi để tôi hoàn thành khóa luận này. Và con vô cùng biết ơn cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ con để con có thể hoàn thành khóa luận này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Phạm Minh Nhựt iv TÓM TẮT PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN Bệnh đốm trắng do virus đốm trắng (WSSV) gây ra là nguyên nhân gây chết hàng loạt đối với tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên tại Việt Nam và trên thế giới. Các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm hiện nay rất ít. Do đó việc hiểu rõ hơn về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng sẽ giúp cho việc tạo ra những phƣơng thức kiểm soát bệnh. Kết hợp mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phƣơng pháp hóa mô miễn dịch trên tôm sú không mang các virus thông thƣờng nhằm xác định vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng, phân tích sự xâm nhiễm và tìm ra nguyên nhân gây chết trên tôm. Tiến trình thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau: tôm không mang các virus thông thƣờng đƣợc gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ với liều thấp (10 1,5 SID50/ml) và liều cao (104,0 SID50/ml). Ở mỗi liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo từng thời điểm sau khi gây nhiễm. Sử dụng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch để khảo sát các mẫu theo từng thời điểm nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú. Các kết quả thu đƣợc: Các biểu hiện lâm sàng của tôm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết, đƣợc phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao. Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú ở liều thấp xảy ra vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 33,3 % và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của chúng là các tế bào của tim với cƣờng độ nhiễm là (+) v Ở liều cao, các cơ quan phát hiện dƣơng tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm sau khi nhuộm bằng hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 50 %. Và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng ở liều cao là các tế bào của tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten và các tế bào của màng bao bên ngoài gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+). Ở thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và ở cả 2 liều gây nhiễm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm virus đốm trắng. Cƣờng độ nhiễm virus đốm trắng trên các cơ quan khi gây nhiễm với liều cao và liều thấp có sự khác biệt trên các cơ quan lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày, biểu mô dƣới vỏ và mô liên kết của màng bao gan tụy. vi MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... ..... iv TÓM TẮT................................................................................................................. ...... v MỤC LỤC ................................................................................................................ ....vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... ...... x DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. xi DANH SÁCH CÁC BẢNG ..........................................................................................xii PHẦN I: GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3 2.1. Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú ................................................... 3 2.1.1. Miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác ............................................................... 3 2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác ............................ 3 2.1.3. Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase ................................................................... 3 2.1.4. Hệ thống đông máu .............................................................................................. 6 2.1.5. Các chất ức chế proteinase ................................................................................... 7 2.1.6. Hệ thống nhận diện không chuyên biệt ................................................................ 7 2.1.7. Các peptide kháng khuẩn ..................................................................................... 8 2.1.8. Peroxynectin ......................................................................................................... 9 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng ................................................ 9 2.2.1. Bệnh đốm trắng .................................................................................................... 9 2.2.1.1. Lịch sử và phân bố ........................................................................................ 10 2.2.1.2. Triệu chứng, bệnh tích .................................................................................. 11 2.2.2. Virus đốm trắng .................................................................................................. 11 2.2.2.1. Phân loại và tên gọi ....................................................................................... 11 2.2.2.2. Hình thái........................................................................................................ 12 2.2.2.3. Cấu trúc ......................................................................................................... 13 2.3. Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng ............................................. 15 vii 2.3.1. Vật liệu gây bệnh ................................................................................................ 15 2.3.2. Cơ chế gây bệnh ................................................................................................. 16 2.3.3. Cơ chế lây lan ..................................................................................................... 17 2.4. Mô hình cảm nhiễm chuẩn virus trên tôm ..................................................... 18 2.5. Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch ..................................................................... 19 2.5.1. Nguyên lý .......................................................................................................... 19 2.5.2. Kháng nguyên ..................................................................................................... 20 2.5.3. Kháng thể............................................................................................................ 20 2.5.4. Phƣơng pháp nhuộm ........................................................................................... 21 2.5.4.1. Phƣơng pháp trực tiếp ................................................................................... 21 2.5.4.2. Phƣơng pháp gián tiếp .................................................................................. 22 2.5.4.3. Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) .......................... 23 2.5.4.4. Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) ................................. 23 2.5.4.5. Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) .................................... 24 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 25 3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 25 3.1.1. Thời gian .............................................................................................................. 25 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................................. 25 3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 25 3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm ................ 25 3.2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................. 25 3.2.1.2. Dụng cụ............................................................................................................. 25 3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC ....................................................... 26 3.2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................ 26 3.2.2.2. Vật tƣ ................................................................................................................ 26 3.2.2.3. Thiết bị .............................................................................................................. 26 3.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 27 3.3.1. Tôm và điều kiện thí nghiệm .............................................................................. 27 3.3.2. Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) ................................................... 27 3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú .............................................................. 27 3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ................. 28 viii 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28 3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus ...................................................................... 28 3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tôm................................................................................... 29 3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC .................................................................................... 30 3.4.4. Xử lý thống kê ..................................................................................................... 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 35 4.1. Độc lực của virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) ........................................... 35 4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ gây chết .............................................................. 35 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm theo từng thời điểm ......................................... 36 4.2. Khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dòng Việt Nam trên tôm sú ............................................................................................................ 37 4.2.1. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) ................................................................ 38 4.2.2. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều cao (104,0 SID50/ml) .................................................................................. 42 4.2.3. So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh ............................. 46 4.3. Thảo luận .............................................................................................................. 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 50 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 50 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 52 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 57 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSSV White Spot Syndrome Virus WSSV-VN White Spot Syndrome Virus – Việt Nam WSSV-TL White Spot Syndrome Virus – Thailand WSD White Spot Disease MBV Monodon Baculovirus YHV Yellow Head Virus proPO Prophenoloxidase PO Phenoloxidase AMPs Antimicrobial Peptides LPS Lipopolysaccharide PG Peptidoglycan PPAE Prophenoloxidase Activating Enzyme CP Clotting Protein TGase Transglutaminase PAMPS Pathogen-associated Molecular Patterns PRR (PRP) Pattern Recognition Receptor (protein) GBP Beta Glucan Binding Protein LPBP Lipopolysaccharide binding protein ICTV International Committee on Taxonomy for Virus SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SID Shrimp Infectious Dose LD Lethal Dose IHC Immunohistochemistry ctv cộng tác viên x DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng ............................... 4 Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ............ 27 Bảng 4.1: Tỷ lệ phần trăm (%) tôm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng ở các thời điểm sau khi gây nhiễm ................................................................................. 34 Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm ........................................................................................................ 35 Bảng 4.3: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều thấp (%) ................................................................................. 37 Bảng 4.4: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều cao (%) .................................................................................. 41 Bảng 4.5: Tỷ lệ (%) các cơ quan bị nhiễm WSSV-VN theo từng thời điểm khảo sát ... 46 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Tôm bị bệnh đốm trắng .................................................................................. 11 Hình 2.2: Hình thái của virus đốm trắng quan sát dƣới kính hiển vi điện tử ................. 12 Hình 2.3: Thành phần các protein của virus đốm trắng ................................................. 13 Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng.......................................................................... 14 Hình 2.5: Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng .................................................... 20 Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC ........................................................................ 21 Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm .................................................................................. 26 Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tôm thí nghiệm............................................................ 27 Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tôm ......................................................... 28 Hình 3.4: Các giai đoạn thực hiện IHC .......................................................................... 29 Hình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu ................................................................................. 30 Hình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC ................................................................................. 31 Hình 4.1: Tôm bị nhiễm virus đốm trắng ....................................................................... 35 Hình 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm................................................................................................. 36 Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN .................... 37 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều thấp. ...................................................................................................... 38 Hình 4.5: Các tế bào của các cơ quan bị nhiễm WSSV ở tôm thí nghiệm liều thấp ...... 40 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều cao ........................................................................................................ 42 Hình 4.7: Các cơ quan bị nhiễm WSSV ở liều cao sau khi nhuộm IHC ........................ 43 Hình 4.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ nhiễm trên các cơ quan khảo sát ở liều cao và liều thấp ..................................................................................................... 45 xii 1 PHẦN I: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh đốm trắng (White Spot Disease) do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây ra trên tôm sú nuôi. Đây là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho nhóm tôm he, bệnh có sức tàn phá rất lớn, làm tôm chết trong thời gian rất ngắn, gây chết 100 % trong khoảng thời gian từ 3 – 7 ngày (Leong, 2005) và có khả năng lây lan rất nhanh. Chính virus này đã làm suy giảm sản lƣợng tôm hằng năm trên thế giới, gây thiệt đáng kể đến nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh đốm trắng và WSSV ở nhiều khía cạnh khác nhau nhƣ hình thái, cấu trúc, di truyền, các yếu tố nguy cơ xảy ra dịch bệnh, phát triển thuốc, vaccine… Trong khi đó các công trình nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của WSSV lại rất hạn chế. Kết quả của nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ tế bào, phân tử giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế tƣơng tác quan trọng của các giai đoạn virus tiếp cận, xâm nhập, nhân bản, hình thành hạt virus bên trong và phát tán ra ngoài tế bào vật chủ. Từ những kết quả quan trọng này giúp cho chúng ta tìm ra đƣợc các thời điểm hay giai đoạn mấu chốt của quá trình nơi mà chúng ta có thể phát triển các giải pháp can thiệp, ngăn chặn khác nhau (thuốc, vaccine, các yếu tố lý hoá...). Đây cũng là hƣớng tiếp cận mới cho WSSV do trƣờng đại học Ghent-Bỉ đề xuất, trong đó sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và các kỹ thuật nhuộm miễn dịch đặc hiệu sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 của WSSV để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ cơ quan, mô, tế bào và phân tử. Với phƣơng pháp này, cho phép chúng ta biết đƣợc về quá trình xâm nhiễm của WSSV theo thời gian, tiến trình, mức độ xâm nhiễm của virus ở các cơ quan đích khác nhau. Việc nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú là rất cần thiết, nó làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu và các thí nghiệm đánh giá độ mẫn cảm của các dòng tôm đối với virus, hay tác dụng của các thuốc, chế phẩm, vaccine trên hệ miễn dịch của tôm đối với việc đề kháng lại virus, đồng thời nhằm phát triển các chiến lƣợc kiểm soát WSSV và sự bùng nổ bệnh đốm 2 trắng ở các mức độ khác nhau trên tôm sú (ở mức độ cá thể, quần thể, ao nuôi, khu nuôi, khu vực nuôi, vùng nuôi và quốc gia). Từ cơ sở quan trọng đó, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và sự chấp thuận của Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II, tôi đã thực hiện đề tài “Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry)” 1.2. Mục đích Thực hiện gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tôm sú sử dụng liều virus SID50/ml đã đƣợc chuẩn độ xác định nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch. 1.3. - Nội dung Gây nhiễm thực nghiệm chuẩn với liều virus SID50/ml thấp và cao trên tôm sú 45 ngày tuổi, theo dõi tôm và thu mẫu theo thời gian sau cảm nhiễm. - Sử dụng IHC để khảo sát quá trình xâm nhiễm của WSSV ở các cơ quan đích khác nhau theo từng thời điểm trên cơ thể tôm. 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú 2.1.1. Cơ chế phòng vệ chung của giáp xác Hệ thống phòng vệ ở động vật đƣợc chia thành 2 nhóm chính là miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động. Ở giáp xác không có hệ thống miễn dịch chủ động, do đó cơ chế phòng vệ của giáp xác chủ yếu dựa vào đáp ứng miễn dịch thụ động (Jiravanichpaisal, 2005). Hệ thống phòng vệ thụ động đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại của giáp xác. Lớp vỏ bên ngoài là một rào cản vật lý hữu hiệu chống lại sự gắn kết và xâm nhập của các tác nhân gây bệnh. Hệ thống phòng vệ của lớp cutin này rất hiệu quả, chống lại các tác nhân gây bệnh và các tác nhân gây bệnh chỉ tạo nên bệnh tích khi lớp vỏ bọc này bị tổn thƣơng. Đƣờng tiêu hóa, là con đƣờng chính của sự xâm nhập, đƣợc bảo vệ bằng màng chitin. Trong ruột có môi trƣờng acid và chứa nhiều enzyme làm bất hoạt và tiêu diệt nhiều loại virus và vi khuẩn. Khi các tác nhân gây bệnh vƣợt qua đƣợc các rào cản trên xâm nhập khoang máu của cơ thể vật chủ, chúng vấp phải một cơ chế phòng vệ phức tạp liên quan đến đáp ứng miễn dịch thể dịch và tế bào. Đầu tiên, hệ thống prophenoloxidase (proPO) đƣợc hoạt hóa tạo nên quá trình melanin hóa và tạo ra các nhân tố liên quan đến phản ứng miễn dịch nhƣ peroxinectin. Kế tiếp, đáp ứng miễn dịch tế bào ở nhiều loại tế bào máu khác nhau sẽ tham gia vào quá trình tiêu diệt các mầm bệnh bằng cách thực bào các vi sinh vật hay bẫy chúng trong tế bào máu bằng cách đông máu hay tạo khối u hoặc đóng gói các vi sinh vật lớn hơn và các phản ứng độc tế bào. Cuối cùng, trong quá trình xâm nhập của vật lạ, một tỷ lệ lớn các phân tử tác động cảm ứng nhƣ các peptide kháng khuẩn (AMPs), các nhân tố cần cho quá trình opsonin hóa cũng đƣợc tạo ra (Jiravanichpaisal, 2005). 2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác Ở động vật có vú, các loại tế bào máu khác nhau đảm nhiệm các chức năng chuyên biệt khác nhau chủ yếu liên quan đến sự sống của cá thể nhƣ sự vận chuyển oxy và sự phòng vệ chống lại sự xâm nhập của vật thể lạ. Ở động vật không xƣơng sống, vai trò quan trọng nhất của các tế bào máu là bảo vệ chúng chống lại sự xâm nhập của vật thể lạ (Jiravanichpaisal, 2005). Ở giáp xác, các dạng tế bào máu có thể 4 đƣợc phân biệt dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu của chúng. Tuy nhiên, các tế bào máu của giáp xác chƣa đạt đến độ biệt hóa rõ rệt và chƣa thể xếp thành các nhóm tế bào máu nhƣ ở cá và động vật có xƣơng sống (Đỗ Thị Hòa, 2004). Ở giáp xác thƣờng chứa ba nhóm tế bào máu: hyaline (bạch cầu không hạt), semigranular (bạch cầu bán hạt) và granular (bạch cầu có hạt) (Jiravanichpaisal, 2005; Đỗ Thị Hòa, 2004) với chức năng đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1 Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng Chức năng Nhóm bạch cầu Thực bào Đóng gói Độc tế bào Hoạt hóa proPO Không hạt Có Không Chƣa biết Không Bán hạt Hạn chế Có Có Có Có hạt Không Rất hạn chế Có Có Bạch cầu không hạt có khả năng thực bào, phát hiện đƣợc trong máu các loài giáp xác bộ mƣời chân, nhƣng số lƣợng tƣơng đối của các tế bào này thay đổi tùy theo từng loài (Đỗ Thị Hòa, 2004). Bạch cầu bán hạt đƣợc đặc trƣng bởi sự tồn tại của một số hạt nhỏ trong tế bào chất tƣơng tự nhƣ bạch cầu có hạt ở động vật có xƣơng sống. Các tế bào này phản ứng với các polysaccharide có trong thành phần của vách tế bào vi sinh vật nhƣ LPS ở vi khuẩn, -1,3-glucan của nấm. Các tế bào này cũng có khả năng đóng gói các hạt ngoại lai (Đỗ Thị Hòa, 2004). Bạch cầu có hạt đặc trƣng bởi các túi hoặc hạt lớn trong tế bào chất. Đặc điểm này có lẽ đóng vai trò trong việc sản sinh, dự trữ và tiết ra các hợp chất kháng khuẩn. Các bạch cầu có hạt của giáp xác không có khả năng thực bào và khả năng đóng gói các hạt ngoại lai rất hạn chế. Vai trò chính yếu của chúng là dự trữ proPO – hợp chất đóng vai trò chính yếu trong đáp ứng bảo vệ của cơ thể giáp xác. Khi tiếp xúc với 1,3-glucan, LPS và PG, bạch cầu có hạt tiết và hoạt hóa proPO thành PO – có tác dụng xúc tác phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol thành quinone và sản phẩm cuối cùng là melanin. Quinone và các sản phẩm trung gian của quá trình này là những chất độc đối với vi sinh vật do hoạt tính cao của chúng (Đỗ Thị Hòa, 2004). 2.1.3. Hệ thống prophenoloxidase (proPO) 5 Động vật không xƣơng sống không có kháng thể, do đó phải dựa vào hệ thống nhận diện không đặc hiệu nhƣng chúng vẫn phải nhận biết vật thể lạ và đáp ứng lại nó để bƣớc đầu chống lại và tiêu hủy chúng. Quá trình nhận biết các vật thể lạ đƣợc thực hiện nhờ hệ thống proPO (Sritunyalucksana, 2001). Hệ thống proPO chứa nhiều loại protein liên quan đến sự phòng vệ miễn dịch ở động vật không xƣơng sống. Đó là sự tổng hợp melanin, sự gắn kết tế bào, sự đóng gói và sự thực bào. Hệ thống proPO là một hệ thống miễn dịch nhận diện không đặc hiệu cực kỳ hiệu quả và đƣợc hoạt hóa bằng sự nhận biết các LPS hoặc PG có ở vi khuẩn và -1,3-glucan có ở nấm. Hệ thống chứa một tập hợp proteinase gồm có các protein nhận biết (PRPs), nhiều loại proteinase, các nguồn tạo enzyme và proPO (Lee, 2001). Dạng hoạt động của proPO, phenoloxidase (PO) nằm trong bạch cầu có hạt (Flegel, 1998), còn đƣợc xem nhƣ là tyrosinase, có khả năng thực hiện hai phản ứng: sự khử monophenol thành o – diphenol (hoạt tính monophenoloxidase) và sự oxy hóa của o – diphenol thành o – quinone (hoạt tính diphenoloxidase). Sự tạo ra o – quinone của PO là bƣớc đầu tiên của chuỗi phản ứng sinh hóa tổng hợp melanin (Lee, 2001). Mặc dù melanin đƣợc xem là có hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp, nhƣng sự tạo ra các sản phẩm trong quá trình oxy hóa nhƣ các anion superoxide, các gốc hydroxyl trong quá trình tạo quinoid cũng có một vai trò kháng khuẩn quan trọng. Thêm vào đó, các phản ứng sinh học nhƣ sự thực bào, đóng gói và tạo khối u cũng đƣợc hoạt hóa.(Flegel, 1998). Hệ thống proPO đƣợc hoạt hóa bằng các thành phần thành tế bào vi khuẩn nhƣ LPS, -1,3-glucan hay PG, từ đó kích thích sự hoạt hóa của các proteinase trong hệ thống proPO (Lee, 2001). Sau đó dƣới điều kiện sinh lý, các protein chuyên biệt của hệ thống proPO cần sự phân cắt của các proteinase này để tạo ra trạng thái hoạt động; hệ thống proPO từ trạng thái bất hoạt với trọng lƣợng phân tử là 76 kDa đƣợc chuyển đổi thành dạng hoạt động có trọng lƣợng phân tử là 62 kDa bằng enzyme hoạt hóa prophenoloxidase (PPAE) (Sritunyalucksana, 2001). Bên cạnh đó, quá trình hoạt hóa hệ thống proPO cần có sự hiện diện của ion Ca2+. Nếu thiếu Ca2+ thì quá trình hoạt hóa không xảy ra ngay cả khi có các yếu tố kích thích (Flegel, 1998). Tóm lại, sự hoạt hóa proPO ở giáp xác liên quan đến hai bƣớc: Bƣớc thứ nhất là quá trình mất hạt xảy ra khi tế bào máu bị kích thích bởi các thành phần của vi khuẩn 6 nhƣ LPS, -glucan hoặc PG và tạo ra dạng bất hoạt của cả proPO lẫn PPAE. Bƣớc thứ hai đòi hỏi sự tham gia của Ca2+ để chuyển đổi PPAE bất hoạt thành proteinase hoạt động để phục vụ cho quá trình biến đổi proPO thành PO hoạt động (Flegel, 1998). 2.1.4. Hệ thống đông máu Một hệ thống khác cũng đƣợc hoạt hóa bởi các sản phẩm của vi sinh vật là hệ thống đông máu. Đây là một đáp ứng phòng vệ quan trọng ở giáp xác bởi vì nó ngăn chặn sự mất máu khi bị tổn thƣơng ở bộ xƣơng ngoài lẫn sự xâm nhập của vi sinh vật khắp cơ thể. Protein huyết tƣơng cấu thành những khối máu đƣợc gọi là các protein đông máu (CP) (Flegel, 1998). CP đƣợc tinh sạch từ nhiều loài giáp xác khác nhau gồm tôm hùm Panulirus interruptus, crayfish P. leniusculus, và tôm thẻ chân trắng P. vannamei. Trong tất cả các trƣờng hợp, CP đƣợc xác định là một glycoprotein với trọng lƣợng phân tử 420 kDa với 2 tiểu đơn vị tƣơng tự nhau đƣợc nối với nhau bằng liên kết disulfide. Thêm vào đó, thành phần cấu tạo của CP ở tôm thẻ chân trắng thì cũng tƣơng tự nhƣ crayfish, tôm hùm và cua, mặc dù những loài này có những loại tế bào đông máu khác nhau (Flegel, 1998). Yếu tố đóng vai trò quan trọng của quá trình đông máu là transglutaminase (TGase) tế bào đƣợc tạo ra bởi tế bào máu (có lẽ là tế bào không hạt) dƣới sự kích thích của các tác nhân ngoại bào. Kết quả phản ứng phân giải của TGase là tạo thành những liên kết chéo -( -glutamyl)-lysine nội phân tử giữa mặt bên của gốc glutamine trên một chuỗi polypeptide với mặt bên của gốc lysine trên một chuỗi polypeptide khác (Vargas-Albores và ctv, 1998; Flegel, 1998) Mặc dù có sự khác nhau trong cấu trúc nhƣng hệ thống đông máu của động vật có xƣơng sống và động vật không có xƣơng sống có cơ chế tƣơng tự nhau mặc dù cách thức thực hiện khác nhau. Trong cả hai trƣờng hợp, khối đông đƣợc hình thành bởi sự hoạt động của TGase kết hợp với Ca2+ trên các tế bào huyết tƣơng gây đông, fibrinogen hoặc protein gây đông. Tuy nhiên ở động vật có xƣơng sống, đòi hỏi quá trình phân cắt protein trƣớc đó (fibrinogen thành fibrin) để tạo nên cơ chất cho TGase trong huyết tƣơng. Trái lại, TGase ở tôm đƣợc giữ trong các tế bào máu (giống nhƣ các loài động vật không xƣơng sống khác) và hoạt động ngay lập tức khi đƣợc giải phóng. Xem nhƣ quá trình phân cắt protein trƣớc đó không cần thiết, chỉ cần sự kích 7 thích của bạch cầu không hạt cùng với sự xuất hiện của LPS vi khuẩn là đủ để kích thích sự giải phóng TGase và dẫn đến quá trình đông máu tiếp theo (Vargas-Albores và ctv, 1998; Flegel, 1998). 2.1.5. Các chất ức chế proteinase Các nhóm proteinase, nhƣ nhóm gây đông máu và hệ thống proPO cần thiết cho quá trình điều hòa để ngăn ngừa sự hoạt hóa quá mức của các nhóm enzyme nội sinh và gây hại tế bào vật chủ. Hoạt động của các chất ức chế proteinase đƣợc tìm thấy ở nhiều loài động vật không có xƣơng sống, đóng vai trò quan trọng trong quá trình kiểm soát và điều hòa hoạt động của hệ thống đông máu và hệ thống proPO. Các nhóm chất ức chế đƣợc tìm ra nhƣ Kasal, Kunitz, serpin, -macroglobulin và chất ức chế metalloproteinase (Jiravanichpaisal, 2005) Trong số các chất ức chế proteinase ức chế hoạt động của hệ thống proPO thì có nhiều chất ức chế proteinase ngăn chặn sự hoạt hóa quá mức của PPAE và một chất ức chế phenoloxidase trực tiếp ức chế hoạt tính của phenoloxidase. Chất ức chế PPAE hiệu quả nhất ở crayfish là pacifastin, một protein heterodimer 155 kDa với một cấu trúc duy nhất. Nó chứa một chuỗi nhẹ với 9 đơn vị ức chế proteinase và một chuỗi nặng chứa 3 thùy transferrin. Phân tử này đƣợc gắn bằng các liên kết giữa các peptide và hình thành nên một chất ức chế proteinase mới đƣợc gọi là các chất ức chế serine proteinase giống pacifastin, hiện diện và ức chế hệ thống proPO ở nhiều loài giáp xác (Jiravanichpaisal, 2005). 2.1.6. Hệ thống nhận diện không chuyên biệt Hệ thống miễn dịch thụ động ở động vật không xƣơng sống đƣợc hoạt hóa bởi các tác nhân gây bệnh và nó là trung gian cho phản ứng giữa các phân tử nhận diện và tác nhân gây bệnh. Những phân tử nhận diện các vật thể lạ đƣợc Janeway gọi là các protein nhận diện kháng nguyên (PRP) (Lee, 2001). Các PRP này nằm trên bề mặt của tế bào hoặc ẩn trong hemolymph, để sẵn sàng nhận diện sự xâm nhập của vi sinh vật lạ (Jiravanichpaisal, 2005). Một số protein nhận diện đã đƣợc tìm thấy ở động vật không xƣơng sống. Đó là: Lectin/ agglutinin là những glycoprotein không có hoạt tính phân giải nhƣng có khả năng gắn kết với các carbohydrate chuyên biệt và có mặt ở hầu hết các sinh vật sống. Chúng có thể gắn kết tế bào và tạo ra phản ứng ngƣng kết. Tƣơng tác giữa lectin 8 và carbohydrate có liên quan đến nhiều hoạt động sinh học khác nhau ví dụ nhƣ là sự vận chuyển carbohydrate của mô và tế bào, các glycoprotein, sự gắn kết tế bào, sự opsonin hóa và sự hình thành các khối u. Đặc biệt, các lectin type C, các lectin có hoạt tính phụ thuộc vào Ca có liên quan đến sự nhận biết miễn dịch ở động vật không xƣơng sống (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001) GBP và LPBP có trình tự tƣơng tự nhƣ glucanase ở vi khuẩn nhƣng chúng không biểu hiện bất kỳ hoạt tính nào của glucanase và thay vào đó là làm tăng sự hoạt hóa hệ thống proPO. Các GBP ở crayfish nằm trong huyết tƣơng và tƣơng tác với 1,3- glucan để gia tăng sự hoạt hóa của hệ thống proPO và cũng hoạt động nhƣ một opsonin để tăng khả năng thực bào (Jiravanichpaisal, 2005). Protein giống masquerade (mas-like protein) là một protein nhận diện kháng nguyên trong tế bào máu vì nó có khả năng gắn với LPS, -1,3-glucan, vi khuẩn gram (-) và nấm men. Các mas-like protein cũng có hoạt tính opsonin và gắn kết tế bào. Do đó, các mas-like protein là một protein đa chức năng. Trình tự aminoacid của nó tƣơng đồng với serine proteinase ngoại trừ sự thay thế bộ ba xúc tác  không có hoạt tính phân giải (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005) Hemolin thuộc liên họ immunoglobulin chứa những vùng giống Ig có thể gắn với phần lipid A của LPS và vi khuẩn gram (-) (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005). Vai trò của hemolin trong động vật không xƣơng sống vẫn chƣa đƣợc xác định rõ ràng, tuy nhiên có những báo cáo cho rằng hemolin có khả năng nhận biết không chuyên biệt và tạo ra đáp ứng miễn dịch và cũng có vai trò trong sự hình thành thần kinh (Lee, 2001) 2.1.7. Các peptide kháng khuẩn Các peptide/polypeptide chống lại vi sinh vật (AMPs) do gene mã hóa có vai trò rất lớn trong giới sinh vật sống từ vi sinh vật đến thực vật và động vật. Một phần quan trọng của hệ miễn dịch tự nhiên là tạo ra những chất chống lại vi sinh vật mà chủ yếu là các peptide. Bình thƣờng, AMPs chứa ít hơn 150 – 200 amino acid và đƣợc tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau. Dựa vào sự phân bố trên mô của chúng, có thể chắc chắn rằng AMPs có khả năng bảo vệ vật chủ chống lại các mầm bệnh (Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001).