Tài liệu Tuyển chọn vi khuẩn bacillus sinh enzyme phytase

i LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng vi sinh vật – Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Minh Trí nên tôi đã hoàn thành tốt cuốn luận văn này. Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Minh Trí người đã quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, cùng các cán bộ nghiên cứu phòng vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ thực phẩm đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Nha Trang,tháng 6-2012 Sinh viên Nguyễn Thị Thư Thảo ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i MỤC LỤC.................................................................................................................. ii DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vii MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. Phytase ..............................................................................................................3 1.1.1. Định nghĩa ..................................................................................................3 1.1.2. Phân loại .....................................................................................................3 1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động .......................3 1.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase ........4 1.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase .........................................................5 1.1.3.1. Nguồn vi sinh vật .................................................................................5 1.1.3.2. Nguồn thực vật.....................................................................................6 1.1.3.3. Nguồn động vật....................................................................................6 1.1.4. Cơ chất đặc hiệu của phyase ......................................................................8 1.1.4.1. Acid phytic và phytat ...........................................................................8 1.1.4.2. Các cơ chất khác ..................................................................................9 1.1.5. Các đặc tính lý hóa của phytase ...............................................................10 1.1.5.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử..........................................................10 1.1.5.2. Nhiệt độ..............................................................................................10 1.1.5.3. pH.......................................................................................................11 1.1.5.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt độ phytase .......................................................................................................11 1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật..........12 1.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase.................................................................13 iii 1.1.7.1. Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm...............13 1.1.7.2. Ứng dụng phytase trong sản xuất thực phẩm.....................................14 1.1.7.3. Ứng dụng phytase trong sản xuât myo-inositol phosphat ..................14 1.1.7.4. Ứng dụng phytase trong sản xuất bột giấy và công nghiệp giấy .......15 1.2. Đại cương về Bacillus sinh enzyme phytase ..................................................15 1.2.1. Vài nét về Bacillus ...................................................................................15 1.2.2. Phân loại phytase của Bacillus .................................................................16 1.2.3. Cơ chất đặc hiệu .......................................................................................17 1.3.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất ở Việt Nam ......................17 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................18 2.1. Đối tượng và vật liệu ......................................................................................18 2.1.1. Đối tượng..................................................................................................18 2.1.2. Vật liệu .....................................................................................................18 2.1.2.1. Hóa chất .............................................................................................18 2.1.2.2. Thuốc nhuộm .....................................................................................18 2.1.2.3. Thiết bị ...............................................................................................18 2.1.3. Môi trường nuôi cấy.................................................................................19 2.1.3.1. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy......................................19 2.1.3.2. Môi trường tăng sinh: môi trường BHB (g/l) ....................................19 2.1.3.3. Môi trường nuôi cấy xác định khả năng sinh phytase .......................19 2.3.3.4. Môi trường để xác định các yếu tố ảnh hưởng (Nhiệt độ, pH, thời gian) .........................................................................................................19 2.1.3.5. Cách chuẩn bị môi trường..................................................................20 2.2. Các phương pháp nghiên cứu .........................................................................20 2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus từ Natto ..............................................20 2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh phytase .........................................20 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ phytase....................................................21 2.2.3.1. Phương pháp định lượng phosphate (phương pháp Fiske và Subbarow) .......................................................................................................21 iv 2.2.3.2. Cách tính hoạt độ enzyme phytase.....................................................24 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase sinh ra.................................................................................................................24 2.2.5. Khảo sát các ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân hytate của enzyme phytase .................................................................................25 2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase.......................25 2.2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase...............................26 2.2.6. Sơ bộ đánh khả năng sinh enzyme phytase của vi khuẩn phân lập được trên bã sắn..................................................................................................27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................28 3.1. Phân lập chủng Bacillus..................................................................................28 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc .........................................................................28 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn ................................................................29 3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phytase của các chủng Bacillus..............31 3.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của Bacillus trên môi trường lỏng.........32 3.5.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng phospho ...........................................33 3.5.2. Khảo sát hoạt độ phytase của chủng Bacillus trên môi trường lỏng........34 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase sinh ra .................................................................................................................35 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân phytate của enzyme phytase ...............................................................................................36 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase .............................36 3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase .....................................37 3.7. Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân của enzyme phytase của vi khuẩn ở trên bã sắn ................................................................................................38 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................40 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại một số phytase ............................................................................5 Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase ......................................................................7 Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sản phẩm cây trồng ...................9 Bảng 2.1: Bảng dung dịch đường chuẩn ...................................................................23 Bảng 2.2: Bảng xác định lượng phosphat trong dịch enzyme ..................................23 Bảng 3.1: Đo đường kính của vòng phân giải của enzyme trong môi trường thạch........32 Bảng 3.2: Tương quan giữa giá trị ∆OD với hàm lượng phospho giá trị ∆OD700 với hàm lượng phospho................................................................................33 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase ........................................3 Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase......................................................................4 Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase......................................................................4 Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic ....................................................................................8 Hình 2.1: Sơ đồ của quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto .........................20 Hình 2.2: Sơ đồ xác định khả năng sinh enzyme phytase.........................................21 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến enzyme phytase..................24 Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase ...................25 Hình 2.5: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase............................26 Hình 3.1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bacillus ...........................................................28 Hình 3.2: Các chủng Bacillus phân lập được............................................................29 Hình 3.3: Hình thái tế bào của chủng Bacillus .........................................................30 Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng Bacillus (có sinh bào tử) ...............................30 Hình 3.5: 3 chủng vi khuẩn không xuất hiện vòng phân giải ...................................31 Hình 3.6: Hoạt tính phân giải enzyme phytase của 3 chủng Bacillus.......................32 Hình 3.7: Đường biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ phospho và giá trị ∆OD700 ............................................................................................................33 Hình 3.8: Hoạt độ chung của phytase của 3 chủng Bacillus nuôi cấy trong môi trường lỏng, cơ chất cảm ứng là sodium phytase......................................................34 Hình 3.9: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo thời gian nuôi cấy ..........35 Hình 3.10: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo nhiệt độ nuôi cấy .........36 Hình 3.11: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo pH nuôi cấy..................37 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT HAPs : Histidin acid phosphat BPP : β-propeller phytase PAP : acid phosphatase Ins : Inositol OD : Độ hấp thụ của dung dịch (giá trị mật độ quang) ODo : Giá trị mật độ quang của ống thử không ODt : Giá trị mật độ quanh của ống thử thật ∆OD : Hiệu số mật độ quang (∆OD = ODt – ODo) đvhđ : Đơn vị hoạt độ TB : Trung bình 1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất là phong phú và đa dạng. Chúng ở khắp mọi nơi xung quanh ta như: trong đất, trong nước, trong không khí thậm chí có cả trong cơ thể của con người. Chúng có thể gây ra cho ta những bất lợi như bệnh lao, bệnh dịch hạch, bệnh tả, đại dịch cúm ở con người và cả gia cầm, … Nhưng vi khuẩn cũng đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết cách sử dụng chúng vào mục đích có lợi sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn. Từ xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như là tạo ra các loại rượu nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, tạo ra các loại thức ăn từ quá trình lên men như đậu tương lên men (natto) của Nhật, tạo ra loại nước giải khát lên men, các chế phẩm enzyme lấy từ vi sinh vật phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi. Ngày nay khi chúng ta đang sống ở thế kỷ XXI, thế kỷ của khoa học và kỹ thuật ngày càng phát triển thì công nghệ vi sinh càng ngày càng chứng tỏ được ưu thế của mình Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và cả đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus … đã và đang được sử dụng trong chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: bia, rượu, y học, công nghiệp dệt, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn của vật nuôi Xuất phát từ thực tiễn đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh enzyme phytase” với các nội dung sau: 1. Tuyển lựa vi khuẩn Bacillus mẫu thực phẩm lên men (Natto) để chọn các chủng Bacillus ở các mẫu khác nhau 2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chon. 2 3. Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme thu được. 4. Sơ bộ đánh giá khả năng thủy phân của enzyme thu nhận được trên bã sắn. Để tài này được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Khoa công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại học Nha Trang. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phytase 1.1.1. Định nghĩa [6][17] Phytase (myo-inositol hexakisphosphat phosphohydrolase) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết monophosphoester của acid phytic hoặc muối phytat, giải phóng orthophosphat và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm phosphat hơn hay các myo-inositol tự do. Phản ứng có thể khái quát như sau: myo-inositol hexakisphosphat +H2O
D-myo-inositol 1,2,4,5,6- pentakisphosphat + phosphat Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase 1.1.2. Phân loại [6][17] 1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology), IUPAC-IUB, JCBN (Joint Commission on Biochemical Nomenclature) đã chia phytase thành 2 loại: EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên hệ thống là myoinositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-Ins1,2,4,5,6-pentakisphosphat và orthophosphat. Đây là dạng thường gặp đối với các phytase có nguồn gốc vi sinh vật. 4 + H(2)O = + phosphat Myo-inositol 1D-myo-inositol1,2,4,5,6- hexakisphosphat pentakisphosphat Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase EC 3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase, tên hệ thống là myoinositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 6 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-Ins1,2,3,4,5-pentakisphosphat và orthophosphat. 6-phytase là dạng thường gặp đối với phytase có nguồn gốc thực vật. + H(2)O = + phosphat Myo-inositol 1D-myo-inositol1,2,3,5,6- hexakisphosphat pentakisphosphat Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase 1.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase Một số tổ chức nghiên cứu và các nhà khoa học khác như Trung tâm thông tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) và các tác giả Mullaney, Ullah, đã phân chia phytase thành 3 nhóm. Nhóm thứ 1 (EC3.1.3.2): Bao gồm các acid phosphatase hoặc histidin acid phosphat (HAPs). Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và quá trình thủy giải phosphomonoester gồm các bước giống nhau. 5 Nhóm thứ 2 (EC3.1.3.8): Là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là các enzyme của Bacillis. Cho đến nay việc phân lập, xác định các gen điều khiển hoạt động của phytase thuộc nhóm này chưa đầy đủ. Các nghiên cứu cho thấy, hiện có 2 loại phytase của Bacillus đã được xác định, đó là phyC do Kerovuo và các cộng sự phát hiện vào năm 1998 và TS-phy do Kim và các cộng sự phát hiện vào năm 1998. Nhóm thứ 3 (EC3.1.3.2): Bao gồm các purple acid phosphatase (PAP). Gmphy được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm enzyme này. Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế xúc tác của Gmphy. Bảng 1.1: Phân loại một số phytase [12] STT Gen Nguồn cung cấp Nhóm phân loại 1 appA Escherichia coli Histidin acid phosphatase 2 MIPP Chuột Histidin acid phosphatase 3 phyA Aspergillus ficuum Histidin acid phosphatase 4 phyB Aspergillus niger Histidin acid phosphatase 5 phyS11 Bắp (zea mays) Histidin acid phosphatase 6 Gmphy Đậu nành (Glycine soja) Purple acid phosphatase 7 KBPAP Đậu trắng (Phaseolus vulgaris) Purple acid phosphatase 8 TRAP Động vật có vú Purple acid phosphatase 9 phyC Bacillus subtilis VTTE-68013 Beta-propeller phytase 10 TS-phy Bacillus amyloliquefaciens Beta-propeller phytase 11 phy-L Bacillus licheniformis Beta-propeller phytase 12 168phyA Bacillus subtilis 168 Beta-propeller phytase 1.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase [6][20] 1.1.3.1. Nguồn vi sinh vật Năm 1968, Shieh và Ware đã tiến hành phân lập từ đất hơn 2.000 chủng vi sinh vật có khả năng tạo phytase. Hầu hết các chủng được phân lập cho sản phẩm enzyme nội bào. Chỉ có khoảng 30 chủng đã phân lập cho sản phẩm phytase ngoại 6 bào. Tất cả các phytase ngoại bào đều là sản phẩm của vi nấm, 28 chủng thuộc giống Aspergillus, một thuộc giống Penicillium và một thuộc giống Mucor. Các nghiên cứu khác đã khẳng định A.niger sinh tổng hợp phytase ngoại bào tốt nhất. Các nghiên cứu của Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase và đây là enzyme ngoại bào. Đến năm 1998, Kim và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh Bacillus amyloliquefaciens cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase. Bên cạnh đó, các chủng như Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp, Escherichia coli, Enterobacter sp cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase. Một số nấm men cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase, trong đó, các chủng như Schwanniomyces castellii, Arxula adenivorans, Pichia spartinae và Pichia rhodannesis cho sản phẩm phytase ngoại bào. Ngược lại, Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala sinh tổng hợp enzyme phytase nội bào. 1.1.3.2. Nguồn thực vật Phytase được tìm thấy ở nhiều thực vật. Ví dụ như phytase từ ngũ cốc: lúa mì, bắp vàng, lúa mạch, lúa gạo và từ các loại đậu: đậu xanh, đậu lùn và đậu trắng California loại nhỏ. Hoạt độ phytase cũng đã được xác định ở cải trắng, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, cỏ và phấn hoa Lily. Một số tác giả đã tinh sạch và xác định các đặc tính của phytase chiết tách từ hạt bắp vàng đang nảy mầm. Rễ cây của một số thực vật có chứa phytase, tuy hàm lượng thấp nhưng cũng được nghiên cứu, xác định. 1.1.3.3. Nguồn động vật Phytase được tìm thấy ruột của một số động vật, đặc biệt là các động vật nhai lại. Tuy nhiên, phytase trong ruột không đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa các dẫn xuất phytat trong thức ăn. Năm 1997, Craxton và các cộng sự đã phân lập và cho thấy biểu hiện hoạt động của phytase trên một nhánh gan của chuột. Một enzyme có chức năng giống phytase cũng đã được tìm thấy ở động vật đơn bào Paramecium. 7 Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase [6] Nấm mốc Nấm men Vi khuẩn Thực vật Nguồn Vị trí enzyme Aspergillus niger NRRL 3135 EX A.flavus EX A.oryzae EX A.terrus EX A.carneus EX A.fumigatus EX Mucor sp EX Penicillium spp EX Penicillium caseoicolum EX Rhizopus oligosporus IN và EX Saccharomyces cerevisiae EX Schwanniomyces castelii EX Kluyveromyces fragilis EX Candida tropicalis EX Torulopsis candida EX Debaryomyces castelii EX Bacillus subtilis (Natto) EX Bacillus amyloliquefaciens EX Escherichia coli IN1 Klebsiella aerogenes IN K.terrigena IN K.oxytoca IN Pseudomonas sp EX Enterobacter sp EX Citrobacter freundii IN Bắp vàng (đã nảy mầm) IN Hạt đậu nành IN Hạt cây họ đậu IN 8 Động vật Nguồn Vị trí enzyme Typha latifola ( phấn hóa) IN Dịch nhờn trong ruột loài gặm nhấm IN2 Gan của loài gặm nhấm IN2 Paramecium EX: enzyme ngoại bào IN2 IN: enzyme nội bào 1 2 : trong tế bào chất : trong lưới nội chất 1.1.4. Cơ chất đặc hiệu của phyase 1.1.4.1. Acid phytic và phytat [6][19] Acid phytic (myo-inositol hexakisphosphat) là ester của rượu inositol và acid phosphoric. Công thức tổng quát là C6H18O24P6. Cấu trúc hóa học của acid phytic rất ổn định, hàm lượng phosphat cao, do đó nó có tích điện âm và có khả năng tồn tại trong phổ pH rộng. Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic Acid phytic chiếm từ 1-5% trọng lượng trong ngũ cốc, cây họ đậu, hạt cho dầu và các loại quả hạch. Trong cỏ làm thức ăn cho động vật, 1/3 là các ion phospho (P) có thể tiêu hóa được, trong khi đó 2/3 còn lại là các P vô cơ tồn tại dưới dạng phytin, một dạng hỗn hợp của muối canxi, magie với acid inositol hexaphosphoric được biết đến như là một dạng muối của acid phytic. Ngoài ra, trong tự nhiên, acid phytic tồn tái chủ yếu dưới dạng muối phytat với các ion kim loại như kẽm, sắt (II)… phytat là loại hợp chất phức tạp, khó tan, cơ thể người và 9 động vật không thể phân giải, do đó không thể hấp thụ được phospho và các nguyên tố cần thiết cho cơ thẻ. Trong trường hợp này acid phytic là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng dưỡng, hầu như không có enzyme nào có khả năng phân cắt các liên kết phosphodiester trong phân tử acid phytic, ngoại trừ phytase. Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sản phẩm cây trồng [9] Nguồn Tỷ lệ phospho tổng số (%) Hàm lượng phospho trong muối phytat (g/100g) Tỷ lệ % phospho trong phytat đối với phospho tổng số (%) Đậu Hà Lan 0,48 0,24 50 Đậu nành 0,61-0,65 0,39 60-61 Hạt cải 1,18 0,70 59 Hạt hướng dương 1,16 0,89 77 Bắp vàng (dạng bột) 0,26-0,33 0,24 66-72 Lúa mạch 0,34-0,42 0,27 56-64 Lúa miến 0,36 0,24 66 Gạo 0,36 0,27 77 Lúa mì 0,30-0,35 0,27 67-77 1.1.4.2. Các cơ chất khác Phytase có khá nhiều cơ chất đặc trưng như ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphat, phenyl phosphat, fructose 1, 6-bisphosphat, glucose 6-phosphat, α-,βglycerophosphat và 3-phosphoglycerat. Các chất này không có cấu trúc tương tự acid phytic nhưng tất cả đều được thủy giải bởi phytase. Chỉ có một số ít phytase được nghiên cứu cho thấy có tính đặc hiệu cao với acid phytic, đó là phytase của Bacillus và alkaline phytase được phân lập từ hạt phân hóa Lily. Dựa trên cơ chất đặc trưng, phytase có thể được phân chia thành 2 loại là phytase có lượng cơ chất đặc trưng khá rộng và phytase đặc hiệu cao với acid phytic. Phytase phù hợp với nhiều cơ chất đặc hiệu thì lại có tính đặc hiệu thấp với 10 acid phytic (23 - 43U/mg). Ngược lại, phytase có lượng cơ chất đặc hiệu hẹp thì cho hoạt độ cao hơn, từ 103 - 811U/mg. 1.1.5. Các đặc tính lý hóa của phytase 1.1.5.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử Hầu hết các phytase đã được xác định là enzyme đơn phân tử. Ví dụ như phytase của vi nấm, E.coli, Klebsiella terrigena, Bacillus subtilis. Tuy nhiên, phytase của một số động thực vật được hình thành từ nhiều tiểu đơn vị. Phytase được hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt bắp được xác định là một enzyme gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa. Phytase được tinh sạch từ ruột của chuột, qua kết quả điện di cho thấy có 2 loại protein với kích thước 70 và 90 kDa. Phytase của Klebsiella aerogenes có 2 dạng khác nhau, một là dạng enzyme tự nhiên, có kích thước khá lớn, 700kDa, dạng còn lại cũng có đầy đủ các phần đảm bảo cho hoạt động của enzyme và có trọng lượng phân tử rất thấp, chỉ từ 10-13kDa. Phytase của vi khuẩn hầu hết có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của nấm. Theo tính toán lý thuyết, phytase của nấm có trọng lượng phân tử khoảng 50kDa, kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho kết quả trong khoảng 65-70 kDa, trong đó phần nặng nhất là các gốc glycosy hóa. Trọng lượng và kích thước phân tử tính toán theo lý thuyết của các protein hoàn chỉnh và số lượng các tiểu đơn vị của phytase từ nhiều nguồn khác nhau. 1.1.5.2. Nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu của phytase từ các nguồn khác nhau sẽ khác nhau. Nhiệt độ tối ưu của phytase dao động từ 45oC đến 77oC. Khi nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của Aspergillus fumigates, A.niger (phytase), các nhà khoa học đã xác định phytase của A.niger không có khả năng chịu nhiệt, ngay cả khi có sự biến đổi cấu trúc sau khi biến tính bởi nhiệt. Ở nhiệt độ khoảng 50 - 55oC, nó trải qua quá trình biến đổi hình dáng cấu tạo không thuận nghịch và kết quả là làm giảm 70-80% hoạt độ enzyme. Phytase của A.fumigatus cũng không có khả năng chịu nhiệt, nhưng có một đặc tính đáng chú ý là có khả năng hồi tính, đảm bảo đầy đủ hoạt độ sau khi bị biến tính ở 90oC. 11 Một vài nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để tăng tính ổn định nhiệt của phytase như thay thế prolin và tạo cầu disulfit hay dùng kỹ thuật sinh học phân tử để tạo dòng phytase từ những nấm chịu nhiệt như M.thermophila, T.thermophilus … Ngoài ra, cũng có thể sử dụng một số hóa chất đặc biệt như polyol, dịch trích lúa miến… 1.1.5.3. pH pH tối ưu của phytase từ các nguồn khác nhau sẽ khac nhau. pH tối ưu của phytase dao động trong một biên độ khá lớn, từ 2,2 đến 8,0. Hầu hết phytase của vi sinh vật, đặc biệt là ở các nấm, pH tối ưu trong khoảng 4,5 đến 5,6. Phytase của A.fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng; ít nhất 80% hoạt độ cao nhất được xác định ỏ trị số pH từ 4,0 đến 5,6. Hai phytase thực vật có tính kiềm (hạt đậu và phân hoa Lily) có pH tối ưu là 8,0. Phytase từ động vật đa số hoạt động ở pH kiềm, từ 7,4 đến 8,7. Để tạo phytase có pH phù hợp với hệ thống tiêu hóa của động vật, Tomschy và cộng sự đã tạo đột biến điểm định hướng bằng cách thay thế Gly-277 và tyr-282 của phytase A.fumigatus bằng các gốc tương ứng Lys và His của phytase A.niger. 1.1.5.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt độ phytase Các ion kim loại được xem là các tác nhân ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ phytase. Tuy nhiên, rất khó để xác định rõ ảnh hưởng của các kim loại khác nhau vì sự liên kết trực tiếp với enzyme hoặc các ion kim loại ở dạng hợp chất hòa tan với acid phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt động của cơ chất. Phytase của Enterobacter sp.4 bi ức chế bởi các ion Zn2+, Ba2+,Cu2+ và Al2+. Theo nghiên cứu của Wyss và các động sự (1999), ion Cu2+ được xác định có khả năng làm giảm hoạt độ của enzyme phytase có nguồn gốc từ E.nidulans và A.terrus. Phytase của A.fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim loại thông thường. Hoạt đô phytase của A.fumigatus bị giảm 50% dưới tác dụng của EDTA, ngược lại, EDTA không phải là yếu tố chính tác động lên hoạt độ phytase có nguồn gốc từ nấm như E.nidulans, A.niger, A.terrus. Những chất hóa học khác có khả năng kìm hãm hoạt độ phytase là flor, molypdat, vanadat … 12 Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ phytase phải được xem xét trên từng loại đối tượng cụ thể. Đối với phytase này, ion kim loại có thể là tác nhân làm giảm hoạt độ nhưng đối với phytase khác, đó lại là yếu tố làm gia tăng hoạt độ của enzyme. Ion Ca2+ đóng một vai trò quan trọng đối với hoạt độ của phytase. Khi thêm tác nhân Ca vào phytase của Bacillus, phytase có nguồn gốc phấn hoa Typha latifolia và phytase của một số loại thực vật khác cũng có khả năng làm tăng hoạt độ của enzyme, ví dụ như ion Zn2+, ở nồng độ 20-80µM, có thể làm tăng 40% hoạt độ phytase ở chuột; ion Fe2+ cũng có tác dụng làm tăng hoạt độ phytase. 1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật Phytase là sản phẩm thứ cấp được vi sinh vật tổng hợp trong quá trình sinh trưởng. Ở một số vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn Bacillus) phytase được tiết vào môi trường nuôi cấy, ở nhiều vi sinh vật khác, phytase chỉ được tích trữ trong thực tế bào chúng. Phytase thực chất là protein nên cơ chế tổng hợp của phytase tương tự như những protein khác. Operon điều hòa phytase là operon cảm ứng. Gen mã hóa cho enzyme phytase gọi là gen appA. Hoạt động của appA tùy thuộc vào nhân tố sigma σs – mã hóa bởi gen rpoS. Khi môi trường thiếu phospho và có nhiều phytat, rpoS được kích thích hoạt động mạnh, theo sau đó là sự tổng hợp trong phase ổn định, sau giai đoạn tăng trưởng lũy thừa. Ngoài phytat là cơ chất cảm ứng cho sinh tổng hợp phytase, các yếu tố dinh dưỡng khác như nguồn carbon, nitơ, khoáng cũng ảnh hưởng đến mức độ sinh tổng hợp phytase. Vi khuẩn Raoultella terrigena tổng hợp nhiều phytase khi môi trường thiếu nguồn carbon. Trong khi đó nồng độ giới hạn của carbon, nitơ không ảnh hưởng đến sự tổng hợp phytase của E.coli. Sự tổng hợp phytase vô cơ ảnh hưởng đến sự tổng hợp phytase của đa số nấm mốc, nấm men, vi khuẩn trừ Raoultella terrigena và các vi khuẩn trong dạ dày cỏ của động vật nhai lại. 13 1.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase [6][20] 1.1.7.1. Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm Động vật nhai lại tiêu hóa phytat thông qua hoạt động của các phytase được tạo thành bởi các vi sinh vật trong dạ cỏ. Vi khuẩn và nấm sinh trưởng kị khí trong ruột tham gia vào quá trình phân giải cơ bản thực vật trong dạ cỏ. Các ion phospho được thủy giải từ phytat bởi phytase được sử dụng bởi cả hệ vi khuẩn trong dạ dày và cơ thể chủ là động vật nhai lại. Tình trạng này khác hẳn so với các động vật khác như heo, gia cầm và cá đều không có khả năng hấp thụ acid phytic, bởi chúng không có enzyme phytase trong dạ dày và ruột. Vì thế, ion phospho được thêm vào thức ăn của chúng để bổ sung nhu cầu phosphat. Theo nghiên cứu của S.E.Scheldeler, khi bổ sung vào khẩu phần ăn của gà Broiler mái sẽ nâng cao tăng trọng trong khoảng 7 tuần tuổi, cải thiện năng suất xương chân, không gây thiệt hại năng suất thịt; đối với gà trống giúp tăng trọng nhanh, nâng cao khả năng chuyển hóa thức ăn và sức sống. Việc bổ sung vào thức ăn của động vật một hàm lượng phytase thích hợp sẽ tạo khả năng đồng hóa phosphat trong quá trình tiêu hóa thức ăn và làm giảm bớt hàm lượng phospho trong phân và điều đó có lợi cho môi trường. Tác động của thức ăn có phytase đối với động vật trong vấn đề ô nhiễm môi trường đã được xác định. Nếu sử dụng phytase trong thức ăn gia súc cho tất cả các động vật ở USD, tương ứng với 8,23 x 104 tấn phosphat thải ra môi trường mỗi năm. Việc sử dụng phytase như là một chất bổ sung vào thức ăn gia súc đã được áp dụng ở 22 nước. Tổ chức FDA (The Food and Drug Administration) đã chấp thuận phytase đạt tiêu chuẩn là chất không gây độc hại. Bã sắn là phụ phẩm của quá trình tinh chế tinh bột sắn từ củ sắn tươi. Bã sắn có độ ẩm trên 80% nên khi phơi dễ bị nhiễm khuẩn, sinh mùi khó chịu và ảnh hưởng đến môi trường xung quang đặc biệt là nơi có dân cư sinh sống. Vậy nên vấn đề ô nhiễm tại các nhà máy tinh bột sắn hiện nay là một trong những vấn đề cần được giải quyết. Trong chăn nuôi thì bã sắn có chứa rất nhiều phytate chưa được