Tuyển chọn dòng nấm mốc aspergillus niger sinh tổng hợp protease

  • Số trang: 70 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 22 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG TRẦN THỊ NHƢ HÀ TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC Aspergillus niger SINH TỔNG HỢP PROTEASE Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC Aspergillus niger SINH TỔNG HỢP PROTEASE Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện PGs.Ts. Nguyễn Văn Mƣời Trần Thị Nhƣ Hà MSSV: 2101976 Lớp: CNTP K36 Cần Thơ, 2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hƣớng dẫn của PGs. Ts. Nguyễn Văn Mƣời. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chƣa từng công bố trƣớc đây. Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Ngƣời hƣớng dẫn PGs.Ts. Nguyễn Văn Mƣời Ngƣời viết Trần Thị Nhƣ Hà Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng i Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, mặc dù gặp không ít khó khăn nhƣng đến nay em đã hoàn thành quá trình nghiên cứu và có đƣợc những kết quả nhƣ mong muốn. Những thành quả có đƣợc là nhờ sự giúp đỡ của thầy cô, gia đình, bạn bè. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Nguyễn Văn Mƣời và Cô Trần Thanh Trúc, giảng viên Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Cần Thơ. Những ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhƣng thầy cô vẫn thƣờng xuyên theo dõi, hƣớng dẫn và giúp đỡ em rất tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu, giúp em hoàn thành tốt đề tài luận văn. Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô Trƣờng Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ thực phẩm đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức hữu ích và những kinh nghiệm thực tế trong suốt thời gian em học tập, rèn luyện tại trƣờng. Con kính xin gửi lời biết ơn chân thành đến cha mẹ, ngƣời đã sinh ra và nuôi dạy con. Và là ngƣời luôn mong những gì tốt đẹp nhất đến với con. Sau cùng, em xin chân thành cảm ơn các anh chị Cao học Công nghệ thực phẩm khóa 18, khóa 19, các anh chị Cao học Công nghệ Sinh học khóa 19 và các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cuối lời, xin kính chúc quý thầy cô, anh chị và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống! Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực hiện Trần Thị Nhƣ Hà Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Đề tài được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn dòng Aspergillus niger đặc hiệu thông qua phương pháp xác định đường kính vòng phân giải casein trên môi trường thạch, sử dụng 29 dòng Aspergillus niger đã được phân lập từ vỏ các loại quả citrus (cam, chanh, bưởi), táo và sung và xác định tính chất, trữ mẫu tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Việc tuyển chọn các dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease được thực hiện bằng cách đo đường kính vòng phân giải casein trên môi trường agarose – casein với các thành phần glycerol 0,5%, yeast extract 0,3%, NaCl 0,5% , agar 2% và casein 1%(w/v) ở pH 5. Kết quả cho thấy tất cả 29 dòng đều có khả năng sinh tổng hợp protease với đường kính phân giải casein khác nhau. Dựa trên kích thước vòng phân giảicasein của 29 dòng nấm mốc đã tuyển chọn được 4 dòng có vòng phân giải casein trên môi trường thạch lớn và ổn định, ký hiệu N1, R1, R4, Sa2 có nguồn gốc từ chanh núm, bưởi Năm roi và cam sành. Sự kết hợp của 2 dòng R4 và Sa2 với tỷ lệ 1:3 cho kết quả sinh tổng hợp protease tốt nhất và hoạt tính protease sau 2 ngày lên men lỏng trong môi trường Czapeck Dox có bổ sung 1% casein làm cơ chất là 0,126±0,016 U/mL. Từ khóa: Aspergillus niger, đường kính vòng phân giải, hoạt tính, protease, tuyển chọn. Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC  LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ ii TÓM TẮT ............................................................................................................................ iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................ vi DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................................... vii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................ viii Chƣơng 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................1 1.1 TỔNG QUAN .............................................................................................................1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .......................................................................................2 Chƣơng 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................................3 2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE .................................................................................3 2.1.1 Lƣợc sử về protease ......................................................................................... 3 2.1.2 Protease ............................................................................................................ 4 2.1.3 Nguồn thu nhận protease ................................................................................. 8 2.1.4 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật .............................................. 10 2.1.5 Tầm quan trọng của protease trong thực tiễn................................................. 11 2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER .........................................14 2.2.1 Giới thiệu chung ............................................................................................ 14 2.2.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger .................................................. 15 2.2.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản ............................................................................... 15 2.2.4 Phƣơng pháp tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp protease ........................................................................................................ 16 2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ............................................................17 Chƣơng 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................19 3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ...............................................................................19 3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm ...................................................................... 19 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm........................................................................................ 19 3.1.3 Hóa chất sử dụng ........................................................................................... 19 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................20 3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ............................................................................ 20 3.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc kết quả ..................................................... 20 3.2.3 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ......................................................... 22 3.2.4 Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả ......................................................... 22 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .....................................................................................22 3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .................................................................. 22 3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ bộ dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu cho quá trình sinh tổng hợp protease................................................................................................. 22 Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kết hợp của các dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu có khả năng sinh tồng hợp protease cao. ...................................................... 23 3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng nấm mốc đặc hiệu đến khả năng sinh tổng hợp protease ............................................................ 25 3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát sơ bộ hoạt tính protease của các tỷ lệ kết hợp tối ƣu………..................................................................................................................... 25 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................................26 4.1 Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease hoạt tính cao .......26 4.2 Khả năng kết hợp dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận protease ............29 4.3 Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng Sa2 và R4 đặc hiệu theo tỷ lệ khác nhau đến hiệu quả sinh tổng hợp protease .......................................................................................32 4.4 Hoạt tính protease ở các tỷ lệ kết hợp Sa2 và R4 tốt nhất ..........................................34 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................35 5.1 KẾT LUẬN...............................................................................................................35 5.2 ĐỀ NGHỊ ..................................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................36 PHỤ LỤC 1 HÓA CHẤT, DUNG DỊCH ĐỆM SỬ DỤNG ........................................... ix PHỤ LỤC 2 CÁC DÕNG NẤM MỐC SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH TUYỂN CHỌN…………… .................................................................................................................x PHỤ LỤC 3 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN TYROSINE THEO PHƢƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN (1938) ................................................................................................... xi PHỤ LỤC 4 KẾT QUẢ THỐNG KÊ ............................................................................ xii PHỤ LỤC 5 MỘT SỐ HÌNH ẢNH ............................................................................ xxvi Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng v Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc của aspergillopepsin II ............................................................................ 4 Hình 2.2. Cơ chế xúc tác của enzyme .................................................................................... 8 Hình 2.3. Hình thái Aspergillus sp. ...................................................................................... 15 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ........................................................................ 22 Hình 3.2. Sơ đồ thí nghiệm kết hợp của các dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu có khả năng sinh tồng hợp protease cao ................................................................................................... 24 Hình 4.1: Vòng phân giải protease trên môi trƣờng casein - agarose sau 24 giờ ủ ở 30°C và nhận diện với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue R-250 1%............................................. 29 Hình 4.2: Vòng phân giải casein của 2 dòng A. niger R1+R4 và R1, R4 riêng lẻ. ................ 31 Hình 4.3: Vòng phân giải casein ứng với các tỷ lệ khác nhau của hai dòng Sa2 và R4 ....... 33 Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Phân loại enzyme protease ..................................................................................... 5 Bảng 2.2 Đặc tính chung của bốn loại protease ..................................................................... 6 Bảng 2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease ......................................................................... 9 Bảng 2.4 Một số tính chất của protease vi sinh vật ........................................................... 11 Bảng 4.1: Các dòng Aspergillus niger có hiệu quả thủy phân casein trung bình và thấp ... 27 Bảng 4.2: So sánh hiệu quả thủy phân casein của các dòng A. niger mạnh ........................ 28 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của dòng nấm mốc Aspergillus niger kết hợp đến hiệu quả thủy phân casein ........................................................................................................................... 30 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng Sa2 và R4 đến hiệu quả sinh tổng hợp protease hoạt tính cao .......................................................................................................... 32 Bảng 4.5: Hoạt tính protease sinh ra từ sự kết hợp Sa2 và R4 .............................................. 34 Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT A. Aspergillus Asp Aspartic aa acid amin cfu colony forming unit (mật số bào tử hình thành) PDA Potato Dextrose Agar U/g Units per weight (gram) of substrate U/mL Units per volume (mL) of substrate v/v volume/volume (tỷ lệ thể tích/thể tích) v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lƣợng) w/w weight/weight (tỷ lệ khối lƣợng/khối lƣợng) Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng viii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 CHƢƠNG 1 1.1 Trường Đại học Cần Thơ ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN Enzyme là chất xúc tác sinh học đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Do đó, nhu cầu về enzyme ngày càng tăng do hiệu quả của chúng đem lại. Năm 1995, ƣớc tính ngành công nghiệp enzyme thế giới thu đƣợc 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7÷2 tỷ USD. Châu Âu sản xuất 60% tổng số enzyme trên thế giới, số còn lại do Mỹ và Nhật Bản sản xuất. Trong các loại enzyme công nghiệp thì hydrolase chiếm lƣợng lớn nhất (75%), tiếp đến là carbohydrolase (Gerritse et al., 2007). Enzyme vi sinh vật có nhiều ƣu điểm hơn enzyme động vật và thực vật do chúng có hoạt tính thủy phân cao hơn và sản lƣợng lớn hơn. Bên cạnh đó, nguồn cung cấp enzyme này ổn định, không phụ thuộc theo mùa và vi sinh vật sinh trƣởng nhanh trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền (Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004). Khoảng 2% vi sinh vật trên thế giới đã đƣợc thử nghiệm là có enzyme (Padmavathi, 2013). Protease (còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide. Quá trình này cần thiết cho sự tổng hợp, kiểm soát kích thƣớc, thành phần, hình dạng của các phân tử protein và cuối cùng là phân hủy chúng. Protease chiếm khoảng 60% thị trƣờng enzyme công nghiệp (Rao et al., 1998), trong đó, protease từ vi sinh vật chiếm khoảng 40% tổng số enzyme đƣợc bán trên toàn thế giới (Godfrey và West, 1996). Protease đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật (gan, dạ dày…), thực vật (đu đủ, khóm…) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm…). Trong đó, enzyme vi sinh vật có vai trò to lớn trong các ngành sản xuất công nghiệp. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lƣợng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang đƣợc tiến hành hơn thập niên qua, tuy nhiên những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực này vẫn chƣa đáp ứng đƣợc việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này trong đời sống. Việc tuyển chọn và cải thiện hoạt tính protease của dòng vi sinh vật bản địa, thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho quá trình tổng hợp enzyme này là vấn đề cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Aspergillus niger (A. niger) là dòng nấm sợi phân bố rất rộng rãi trên nhiều loại cơ chất tự nhiên và trong các sản phẩm nông công nghiệp (Pansear et al., 2010), đƣợc biết đến với khả năng sinh tổng hợp protease (Paranthaman et al., 2009) và Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 1 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ đƣợc biết đến là nguồn cung cấp nhiều enzyme, trong đó có protease. Tuy nhiên, tùy thuộc vào nguồn phân lập, đặc tính của từng dòng nấm mốc mà hiệu quả sinh các enzyme khác nhau. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tuyển chọn dòng Aspergillus niger phù hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme mong muốn – trƣờng hợp khảo sát là protease chính là điều đầu tiên cần đƣợc thực hiện nhằm gia tăng hiệu quả tổng hợp enzyme đặc hiệu. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu khảo sát chính của đề tài là tuyển chọn dòng A. niger đặc hiệu cho quá trình sinh tổng hợp đạt hiệu quả. Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành nghiên cứu 3 nội dung chính : (1) Tuyển chọn dòng Aspergillus niger đơn lẻ có khả năng sinh protease dựa trên đƣờng kính vòng phân giải casein. (2) Nghiên cứu khả năng kết hợp của các dòng Aspergillus niger giúp tăng khả năng sinh tổng hợp protease. (3) Khảo sát tỷ lệ kết hợp của hai dòng nấm mốc Aspergillus niger đã tuyển chọn giúp hiệu quả thu nhận protease đạt cao nhất. Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 CHƢƠNG 2 2.1 Trường Đại học Cần Thơ LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 2.1.1 Lƣợc sử về protease Protease đƣợc nghiên cứu đầu tiên là các enzyme tiêu hóa ở động vật. Từ đầu thế kỷ 18, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp Reomur phát hiện dạ dày chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836, Swann quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch vị. Nhƣng mãi đến hơn 20 năm sau 1857, Corvisart mới tách đƣợc trypsin từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên đƣợc thu nhận dạng chế phẩm tuy còn lẫn nhiều enzyme và protein khác. Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng pháp hâp phụ trên colodion đã tách đƣợc trypsin và amylase của tụy tạng. Năm 1861, Brucke đã tách đƣợc pepsin dạng tƣơng đối tinh khiết từ dịch dạ dày chó. Năm 1872, Hommarsten đã tách đƣợc chế phẩm chymosin (rennet). Cùng thời gian, Schmidt (1869-1872) nêu lên giả thiết trong máu có fibrin (còn gọi là trombin) tham gia quá trình đông máu. Ông đã tiến hành tạc và tủa bằng cồn. Năm 1874, Group-Besanenzyme công bố thu nhận đƣợc protease từ hạt loại đậu. Tác giả cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt tính phân giải protein. Đến năm 1879, Wurtz cho biết từ mọi bộ phận trên cây đu đủ (Carica papaya) đều chứa protease và khi tủa bằng cồn thu nhận dạng chế phẩm không tinh khiết gọi là papain (Lê Ngọc Tú et al., 2002). Đến nửa đầu thế kỷ 20, ngƣời ta mới phát hiện thêm nhiều loại protease khác nhƣ bromelin-p có trong các bộ phận ở dứa (Willstatter et al., 1926); catepsinprotease của mô cơ động vật (Willstatter and Bamann, 1929); calicare-peptidylprotease của tuyến tụy và nƣớc bọt (Kraut et al., 1933); ficin-protease có trong cây thuộc giống ficus (Walti, 1938). Năm 1950 trở về sau, nhờ sử dụng đƣợc một số phƣơng pháp mới tinh chế protease, ngƣời ta thu nhận đƣợc những chế phẩm protease tinh khiết hơn và cũng từ đấy các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu protease từ vi sinh vật, mặc dù từ 1918-1919, Waksman đã phát hiện đƣợc khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể có trong thế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy (protease ngoại bào). Các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn, đƣợc ứng dụng để sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau (Lê Ngọc Tú et al., 2002). Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.2 Protease 2.1.2.1 Giới thiệu chung Protease là enzyme phân giải protein, nằm trong lớp của các enzyme thủy phân hydrolase. Các enzyme này gây cắt protein thành các peptide nhỏ hơn và các acid amin thông qua phá vỡ các liên kết peptide. Protease là hỗn hợp của các enzyme nhƣ proteinase, peptidase và amidase. Các proteinase thủy phân các phân tử protein nguyên vẹn để tạo thành proteose, peptone và một số acid amin. Peptidase thủy phân peptone thành các acid amin và amidase thủy phân acid amin để tạo thành amoniac (Mukhtar và Ikram, 2009). Hình 2.1. Cấu trúc của aspergillopepsin II Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=36589 Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý nhƣ: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormone và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng... (Lƣơng Đức Phẩm, 2004). Ngoài ra, các protease có thể hoạt động nhƣ các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thƣờng đó là tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN... (Nguyễn Trọng Cẩn et al., 1998). 2.1.2.2 Phân loại protease Thông thƣờng protease đƣợc chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase (Rao et al., 1998). + Exopeptidase tách liên kết peptide ở gần cuối của chuỗi polypeptide. Dựa theo vị trí hoạt động của các enzyme này là ở các gốc C hoặc N, exopeptidase đƣợc phân loại tƣơng ứng thành aminpeptidase và carboxypeptidase. + Endopeptidase cắt các liên kết peptide ở vùng bên trong của chuỗi polypeptide. Tùy theo động học cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành 4 nhóm: serine protease, protease aspartic, protease cystein, metalloprotease. Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 2.1 Phân loại enzyme protease Protease EC No Exopeptidase Aminopeptidase 3.4.11 Dipeptidyl peptidase 3.4.14 Tripeptidyl peptidase 3.4.14 Carboxypeptidase 3.4.16-3.4.18 - Serin type protease 3.4.16 - Metalloprotease 3.4.17 - Cysteine type protease 3.4.18 - Peptidyl dipeptidase 3.4.15 - Dipeptidases 3.4.13 - Omega peptidases 3.4.19 Endopeptidase Serin protease 3.4.21 Cysteine protease 3.4.22 Aspartic protease 3.4.23 Metalloprotease 3.4.24 (Rao et al., 1998) Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 2.2 Đặc tính chung của bốn loại protease Loại protease Khối lƣợng phân tử(kDa) pH tối ƣu Aspartic 30-45 Cysteine or thiol Nhiệt độ tối Trung tâm hoạt động Nguồn thu nhận chính Nguồn tham khảo 3 – 5 40 – 55 Aspartic acid Aspergillus, Mucor, Endothia, Rhizopus, Penicillium, Neurospora, Mô động vật (nội tạng) North, 1982; Rao et al., 1998; Kovaleva et al., 1972 34-35 2-3 40-45 Aspartate hoặc cysteine Aspergillus, thân, cuống dứa, nhựa cây Figureure, đu đủ, Streptococcus, Clostridium Keay and Wildi, 1970; Keya et al., 1972; Gripon et al., 1980 Metallo 19-37 5-7 65-85 Phenylalanine hoặc leucine Bacillus, Aspergillus, Penicillium, Pseudomonas, Streptococcus Aunstrup, 1980 Serine 18-35 6-11 50-70 Serine, histidine và aspartate Bacillus, Aspergillus, mô động vật, Tritirachium album Boyer, 1970; Nakagawa, 1970 ƣu (C) Ngoài ra, protease còn đƣợc phân loại theo khoảng pH hoạt động, và đƣợc chia thành: protease ƣa acid: pH 2 – 4 ; protease trung tính: pH 7 – 8 ; Protease kiềm: pH 9 – 11 (Ahmed et al., 2011). - Protease acid : Protease ƣa acid còn đƣợc gọi là aspartic acid protease. Đây là một endopeptidase. Enzyme này có khả năng hòa tan trong nƣớc và hoạt động tối ƣu ở độ pH thấp (Vishwanatha et al., 2009). Protease ƣa acid thƣờng đƣợc tiết ra bởi nấm (Tremacoldi et al., 2004). Một số Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ protease ƣa acid tiết ra từ các dòng Aspergillus gọi aspergillopepsin và có hoạt động tối đa ở pH 3 – 4 (Rao et al., 1998) - Protease trung tính : Đây là loại protease có khoảng pH hoạt động hẹp 78, không bền ở nhiệt độ cao và mất hoạt tính khi có sự hiện diện của protease kiềm. Đƣợc thu nhận từ những loài nấm mốc khác nhau, nhƣng chủ yếu là các loài nấm mốc vàng nhƣ Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus tericola (Nguyễn Hữu Chấn, 1996 ; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). - Protease kiềm : Hoạt động trong khoảng pH 9 – 11, đƣợc thu nhận từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Bacillus subtilis. Những protease kiềm là nhóm đƣợc quan tâm khá nhiều gần đây vì có thể sử dụng chúng nhƣ những chất phụ gia trong quá trình thuộc da, trong chất giặt rửa, xử lý chất thải môi trƣờng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Trong ba loại protease : acid, trung tính và kiềm, protease trung tính là enzyme có trung tâm hoạt động là kim lọai chứa kẽm, kém bền nhiệt nhất trong ba loại. Trái lại, protease acid từ nấm mốc có khả năng chịu nhiệt tốt nhất và chịu đƣợc pH thấp (Keay, 1971). 2.1.2.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease Trong TTHĐ của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trƣng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung nhƣ sau: TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trong một số trƣờng hợp còn có cả cofactor kim loại. + Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dƣới TTHĐ (subsite), mỗi phần dƣới TTHĐ tƣơng ứng với mỗi gốc acid amin trong phân tử cơ chất. + Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể protease acid của Rhizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không đƣợc giữ vững bởi các cầu disulfide. Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Mặc dù TTHĐ của các protease vi sinh vật có khác nhau nhƣng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung nhƣ sau: E+S  [E – S]  E – S + P1  E + P2 Hình 2.2. Cơ chế xúc tác của enzyme Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, E- S: Phức chất enzyme- cơ chất, P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.1.3 Nguồn thu nhận protease Protease còn tham gia vào nhiều quá trình sinh lý phức tạp của tế bào, mô, cơ quan đến cơ thể. Chúng đƣợc phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng từ động vật (Sielecki et al., 1991; Mohanty et al., 1999), thực vật (Schechler và Berger, 1967; Lê Đức Ngọc et al., 1996; Kaul et al., 2002) cho tới vi sinh vật (Rao et al., 1998). Trong đó, protease từ vi sinh vật đƣợc nghiên cứu nhiều nhất để sản xuất ở quy mô thƣơng mại. So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trƣớc hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lƣợng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dƣới dạng tinh thể đồng nhất. Phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thƣờng có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng (Lƣơng Đức Phẩm, 2004). - Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn protease đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ các chủng: Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, A. fumigatus, A. niger, Penicillium chysogenum… các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3. Một số nấm mốc khác nhƣ: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat (Nguyễn Trọng Cẩn et al., 1998). Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. - Enzyme protease từ nguồn động vật và thực vật đƣợc loài ngƣời khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Hiện nay lƣợng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật đƣợc thay thế dần bằng enzyme Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ vi sinh vật. Enzyme thu nhận từ các nguồn này thƣờng rất khó và hiệu quả kinh tế không cao (Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004). Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ƣu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất đƣợc liệt kê nhƣ sau: + Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lƣợng cơ chất lớn hơn khối lƣợng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu đƣợc lƣợng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu đƣợc một lƣợng enzyme nhiều hoặc lƣợng các sản phẩm trao đổi chất cao (Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004). + Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều. Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp. Trong sản xuất, quá trình sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đƣa vào quy mô công nghiệp đƣợc (Lƣơng Đức Phẩm, 2004). + Nguồn cơ chất dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm nhƣ các phế liệu, phế phẩm. Điều này không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trƣờng sống (Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004). Vi sinh vật không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố dinh dƣỡng của môi trƣờng, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì thế enzyme đƣợc sản xuất từ vi sinh vật thƣờng rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác (Lƣơng Đức Phẩm, 2004). Ngoài ra, quá trình tách chiết, chế biến các enzyme từ vi sinh vật khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi và lợi nhuận cao (Quyền Đình Thi và Trần Thị Quỳnh Anh, 2007). Bảng 2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease Nguồn thu nhận Một số enzyme Thực vật Papain, Bromelain Keratinase Ficin Động vật Trypsin Chymotrypsin Pepsin, Rennin Vi sinh vật Acid proteases Rennets (Nguồn: Vishwanatha, 2009) Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.4 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn nhóm protease serine; protease thiol; protease kim loại; protease acid. Trong bốn protease kể trên, các protease serine và protease thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin. Ngƣợc lại, các protease kim loại, protease acid thƣờng không có hoạt tính esterase của các dẫn xuất của acid amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lƣợng phân tử của các enzyme này tƣơng đối bé, nhất là các protease serine. Các protease serine có khối lƣợng phân tử thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 Dalton. Tuy nhiên, cũng có một số protease serine có trọng lƣợng phân tử lớn hơn nhƣ các enzyme của Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Aspergillus oryzae OUT 5038 (52.000). Khối lƣợng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-serine (vào khoảng 33.800 - 48.400). Protease thiol và nhiều protease acid cũng có trọng lƣợng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 Dalton. Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm proteinase này ở bảng 2.4. Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10
- Xem thêm -