Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật

  • Số trang: 70 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 95 |
  • Lượt tải: 1
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ LINH TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CHO SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH VẬT. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Linh TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN Azotobacter CHO SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH VẬT. Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lê Nhƣ Kiểu Hà Nội - 2012 2 CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN HCVSV: hữu cơ vi sinh vật AIA: axit indol axetic HCN: axit cyanhidric Cs: cộng sự 3 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn 7 Bảng 1.2: Hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối với lúa ở một số quốc gia 22 châu Á Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Azotobacter mới phân lập 32 Bảng 3.2: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter. 34 Bảng3.3: Khả năng sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter 37 Bảng 3.4: Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh của các chủng Azotobacter 39 Bảng 3.5: Hoạt tính sinh học của chủng Azotobacter lựa chọn 40 Bảng 3.6: Mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn lựa chọn 41 Bảng 3.7: Khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng trong môi trường 42 dịch thể Bảng 3.8: Khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi trong 43 cơ chất vô trùng theo thời gian Bảng 3.9: Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi cấy trong dịch thể và cơ chất 44 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của phân hữu cơ đến cây trồng trong giai đoạn đầu ở 48 nhà lưới Bảng 3.11: Ảnh hưởng của phân hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và phát 51 triển của cây lạc ngoài đồng ruộng 4 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của phân hữu cơ tới năng suất và các yếu tố cấu 52 thành năng suất DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Azotobacter mới phân 32 lập. Hình 3.2: Hình ảnh phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử 33 Nessler Hình 3.3: Hình ảnh phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử 35 Salkowski Hình 3.4: Hình ảnh vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh của các chủng 38 Azotobacter Hình 3.5: Ảnh hưởng của phân bón vi sinh vật đến khả năng sinh trưởng, phát triển và ức chế bệnh héo xanh cây lạc 48 Hình 3.6: Tác động của phân bón vi sinh đến khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lạc 50 Biểu đồ 3. 1: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter. 34 Biểu đồ 3. 2: Khả năng sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter. 37 5 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3 1.1. Vi khuẩn Azotobacter .............................................................................................. 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter. ... 3 1.1.2. Nguồn dinh dƣỡng ......................................................................................... 4 1.1.3. Ảnh hƣởng các nhân tố sinh thái đến sinh trƣởng và phát triển của Azotobacter. ................................................................................................................. 8 1.2. Sự phân bố của Azotobacter trong đất. ............................................................ 10 1.3. Khả năng cố định nitơ của Azotobacter ........................................................... 12 1.3.1. Quá trình cố định nitơ sinh học ................................................................. 12 1.3.2. Vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter ................................................. 13 1.4. Khả năng kích thích sinh trƣởng của Azotobacter. ........................................ 14 1.4.1. Chất kích thích sinh trƣởng ở thực vật. .................................................... 14 1.4.2. Vi khuẩn sinh AIA: Azotobacter ............................................................... 15 1.5. Tính kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum. ............. 16 1.5.1. Vi khuẩn R.solanacearum .......................................................................... 16 1.5.2. Tính kháng R.solanacearum của Azotobacter ......................................... 16 1.6. Chế phẩm phân bón chứa Azotobacter và hiệu quả trong trồng trọt trong những nghiên cứu ban đầu. .......................................................................................... 17 1.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật ở trong nƣớc và ngoài nƣớc. ................................................................................................................ 19 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................................... 23 2.1. Vật liệu ................................................................................................................. 23 2.1.1. Mẫu đất và vi sinh vật. ................................................................................ 23 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ ........................................................................................ 23 2.2. Phƣơng pháp ........................................................................................................ 24 2.2.1. Lấy mẫu đất .................................................................................................. 24 2.2.2. Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật ....................................... 24 2.2.3. Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật .......................... 25 6 2.2.4. Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh ................... 26 2.2.5. Xác định tên vi sinh vật .............................................................................. 27 2.2.6. Thí nghiệm ở quy mô nhà lƣới và đồng ruộng diện hẹp với cây lạc. ... 27 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 31 3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter hữu hiệu.................................. 31 3.1.1. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định nitơ .............. 33 3.1.2. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng sinh tổng hợp AIA . 35 3.1.3. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh ............................................................................................................ 38 3.2. Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter để sản xuất chế phẩm .......................... 40 3.3. Xác định tên các chủng lựa chọn ...................................................................... 44 3.4. Đánh giá tác động của chế phẩm Azotobacter đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất của cây lạc .............................................................................. 47 3.4.1. Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc ở điều kiện nhà lƣới............................................................................................................... 47 3.4.2. Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc L14 trên đồng ruộng diện hẹp. .................................................................................... 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................................ 53 7 MỞ ĐẦU Một thực trạng chúng ta đang thấy hiện nay là sự lạm dụng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật đã làm giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hƣởng không tốt đến chất lƣợng nông sản và cũng là nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hóa đất canh tác. Các sản phẩm hóa học này đã để lại những tồn dƣ của chúng và đang đƣợc tích lũy trong hệ sinh thái, trở thành mối hiểm họa nghiêm trọng đe dọa sức khỏe của con ngƣời và môi trƣờng sống. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật (HCVSV) là giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đang hƣớng đến. Đất nƣớc ta có nền kinh tế nông nghiệp là chủ yếu thì việc quan tâm đến năng suất và chất lƣợng nông sản là mục tiêu hàng đầu vì không những giúp nâng cao đời sống của nông dân mà còn thúc đẩy sự phát triển nền kinh tế quốc gia. Phân bón HCVSV (hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm đƣợc sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dƣỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống đƣợc tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định. Phân bón HCVSV góp phần nâng cao năng suất cây trồng và chất lƣợng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ, đóng góp quan trọng trong việc bảo vệ môi trƣờng và phát triển nền nông, lâm nghiệp bền vững. Vì vậy, nghiên cứu và sử dụng nguồn dinh dƣỡng tạo ra từ các hoạt động sống của vi sinh vật đã và đang đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới quan tâm và phát triển. Bên cạnh các sản phẩm phân HCVSV đơn chủng đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng hiệu quả nhƣ: Nitragin, Rhizoda, Azogin, Rhizolu, Phosphobacterin, Azotobacterin... một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón tổng hợp bao gồm các nhóm cố định nitơ, phân giải photphat, kích thích sinh trƣởng thực vật, đối kháng vi sinh vật gây bệnh (chế phẩm EM, vi sinh vật tổng hợp) có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ. 8 Nhiều kết quả nghiên cứu về phân bón HCVSV đã khẳng định, hiệu quả của phân HCVSV phụ thuộc hoạt tính sinh học, khả năng cạnh tranh với vi sinh vật có sẵn trong đất và khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng đất của các vi sinh vật sử dụng trong phân bón [13], [14], [15]. Phân vi sinh vật đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các vi sinh vật sử dụng có nhiều hoạt tính sinh học. Azotobacter là nhóm có phổ phân bố khá rộng. Các nghiên cứu trƣớc đây đã phát hiện ra nhiều đặc tính quý của Azotobacter nhƣ khả năng cố định nitơ tự do, kích thích sinh trƣởng, đối kháng, sinh polyshacarit v.v. [5], [12]. Để sản xuất phân bón HCVSV tốt, phải có chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, đa hoạt tính, khả năng tồn tại lớn. Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là việc làm không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật [11]. Đây là đề tài nghiên cứu mà chúng tôi đang hƣớng tới. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn các chủng Azotobacter có hoạt tính sinh học cao (cố định nitơ, kích thích sinh trƣởng và đối kháng bệnh héo xanh) để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh cho cây lạc. Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác. - Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón. - Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lƣới và ngoài đồng ruộng diện hẹp). 9 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Azotobacter 1.1.1. Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter. Họ Azotobacteraceae gồm 2 chi Azotobacter (Beijerinck, 1901) và Azomonas (Winogradsky, 1938). Azotobacter đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1901. Đó là loài Azotobacter chroococcum, về sau ngƣời ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi Azotobacter (beijerinskii, vinelandii, agllis). Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất, hiếu khí, không sinh bào tử, Gram âm. Khi còn non tế bào thƣờng có dạng hình que, kích thƣớc khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5 μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiên mao mọc khắp cơ thể (chu mao). Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thƣớc thu nhỏ lại trông giống nhƣ hình cầu. Nguyên sinh chất xuất hiện nhiều hạt lổn nhổn. Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan sát dƣới kính hiển vi ta còn thấy khi già tế bào Azotobacter đƣợc bao bọc bởi một vỏ nhầy khá dày. Vỏ nhầy của vi khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75 % là chất hiđrit của axit uronic và chứa khoảng 0,023 % nitơ. Lƣợng ADN trong tế bào Azotobacter thƣờng thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác (0,70- 0,81%) [4]. Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn cacbon. Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lƣợng bor (B) và molipden (Mo)(Mo cần cho quá trình cố định nitơ). Khi sống trong điều kiện không có nitơ, Azotobacter sẽ dùng nitơ của không khí để biến thành nitơ của cơ thể sống. Khi sống trong môi trƣờng đủ thức ăn nitơ hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất thấp hoặc không có. Azotobacter thích hợp với điều kiện hiếu khí vừa phải và pH trung tính hoặc hơi kiềm. Khi nuôi trong môi trƣờng thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan, lúc đầu không màu, sau biến thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen 10 nhƣng không làm nhuộm màu môi trƣờng. Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng. Vi khuẩn Azotobacter thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, sống theo phƣơng thức dị dƣỡng. Chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, axit hữu cơ, hợp chất thơm … Tuy vậy, nhiều tác giả cho biết có không ít chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactose, manitơl hoặc natribenzoat [12]. Trên các môi trƣờng không chứa nitơ khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo, chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng không có nitơ. Sở dĩ chúng tồn tại đƣợc là vì có khả năng đồng hoá muối amonium, urê. Một số chủng Azotobacter có khả năng sử dụng nitrit, nitrat. Hai loại axit thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dƣỡng của Azotobacter là axit glutamic và axit asparaginic. 1.1.2. Nguồn dinh dƣỡng Vi sinh vật cũng nhƣ các loài động thực vật khác, luôn có nhu cầu sử dụng những chất chúng có thể hấp thụ từ môi trƣờng xung quanh và đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lƣợng. Tuy nhiên không phải mọi thành phần của môi trƣờng nuôi cấy đều đƣợc coi là chất dinh dƣỡng. Một số chất rắn cần thiết cho vi sinh vật nhƣng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện thích hợp về thế oxy hoá - khử, về pH, về áp suất thẩm thấu, về cân bằng ion v.v… Chất dinh dƣỡng phải là những chất có tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Nguồn cacbon Cacbon chiếm tỷ lệ trên 50% vật chất khô của vi sinh vật. Cacbon là yếu tố đặc biệt quan trọng trong cấu trúc tất cả các hợp chất có mặt trong tế bào. Hợp chất cacbon là nguồn năng lƣợng quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật. Trong tự nhiên có hai dạng hợp chất cacbon cơ bản là: Cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ. Các loại vi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn cacbon không giống nhau. Tuỳ 11 theo nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon đƣợc cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3, CaCO3 …) hoặc hữu cơ. Giá trị dinh dƣỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: + Thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn + Đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật Hầu nhƣ không có hợp chất cacbon hữu cơ nào mà không bị nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân huỷ. Về thức ăn cacbon, Azotobacter có khả năng đồng hoá, nhiều loại monosaccarit (glucoza, fructoza, galactoza, manoza arabinoza, xyloza), disaccarit (saccaroza, maltoza, trehaloza, melibioza, lactoza), trisaccarit (raffinoza melizitoza), polysaccarit (tinh bột, dextrin, glycogen, inulin), 2,3 butylenglycol, glyxerin, mannit, sorbit, inozit, các oxi axit (nhƣ axit lactic, axit glycolic, axit saccaric, axit sucxinic, axit malic, axit limonic, axit glycolic, axit galactonic, axit mannonic , axit glyxetinic, axit pyruvic, axit quinic, axit butyric, axit valeric, axit cepronic), các diaxit (axit fumaric, axit maleic, axit malonic, axit oxaloaxetic) các hợp chất thơm (nhƣ axit benzoic, axit salixilic, phenol ...). Khả năng đồng hoá các nguồn thức ăn cacbon nói trên không phải là giống nhau ở tất cả các chủng Azotobacter. Có không ít các chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactoza, mannit hoặc natri benzoat. Khi đồng hóa glucose, Azotobacter thƣờng làm tích luỹ lại trong môi trƣờng axit pyruvic, axit lactic và etanol. Chính vì lí do này cho nên khi phát triển Azotobacter thƣờng làm axit hoá môi trƣờng nuôi cấy. Nguồn nitơ Nguồn dinh dƣỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật. Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhƣng ít thích hợp với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO3- các ion kim loại còn lại: K+, Na+, Mg2+,… làm kiềm hoá môi trƣờng. Để tránh 12 hiện tƣợng này ngƣời ta sử dụng muối NH4NO3 làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH4+ thƣờng bị hấp thụ nhanh rồi mới hấp thụ đến gốc NO3Đa số vi khuẩn không có khả năng đồng hóa N2 trong không khí, tuy nhiên có những vi sinh vật có thể chuyển hoá N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác của hệ thống enzym nitrogenaza, các vi sinh vật này gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Cụ thể có các loại nhƣ: Rhizobium, Azotobacter, Clostridium, v.v… Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong thức ăn hữu cơ. Thức ăn này vừa là nguồn thức ăn cacbon vừa là nguồn thức ăn nitơ cho chúng. Nguồn nitơ hữu cơ thƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton – loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đó. Nguồn khoáng Ngoài các chất hữu cơ, vô cơ, nƣớc v.v… trong tế bào vi sinh vật còn chứa nhiều chất khoáng. Lƣợng chất khoáng trong tế bào thƣờng thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn và điều kiện sinh trƣởng, phát triển của vi sinh vật. Mỗi nguyên tố đều có tác dụng nhất định đối với sinh trƣởng, phát triển của tế bào mà các nguyên tố khác không thể thay thế đƣợc. Nguyên tố khoáng đƣợc chia làm 2 loại chính: - Các nguyên tố đa lƣợng gồm có: P, K, Ca, S, Mg, Fe, Na, Cl … - Các nguyên tố vi lƣợng gồm có: Mn, Cu, Co, B … Nhu cầu của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển. Theo nghiên cứu ngƣời ta nhận thấy nồng độ cần thiết về các muối khoáng đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn thƣờng thay đổi trong các phạm vi sau: 13 Bảng 1.1: Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn Nồng độ cần thiết (g/l) Muối khoáng Đối với vi khuẩn Đối với nấm và xạ khuẩn K2HPO4 0.2 - 0.5 1–2 KH2PO4 0.2 - 0.5 1–2 MgSO4.7H2O 0.1 - 0.2 0.2 - 0.5 MnSO4.4H2O 0.005 - 0.01 0.02 - 0.1 FeSO4.7H2O 0.005 - 0.01 0.02 - 0.05 Na2MoO4 0.001 - 0.005 0.01 - 0.02 _ 0.02 - 0.1 CoCl2 Tới 0.03 Tới 0.06 CaCl2 0.01 - 0.03 0.02 - 0.1 0.001 - 0.005 0.01 - 0.05 ZnSO4.7H2O CaSO4.5H2O Khi sử dụng các môi trƣờng thiên nhiên để nuôi cấy vi sinh vật ngƣời ta thƣờng không cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng, cụ thể nhƣ các loại môi trƣờng: nƣớc chiết đậu, nƣớc thịt, sữa, huyết thanh, pepton, giá đậu…vì các môi trƣờng này thƣờng chứa đủ các nguyên tố khoáng cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Ngƣợc lại, khi làm các môi trƣờng tổng hợp (dùng nguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đầy đủ các nguyên tố khoáng cần thiết. Nồng độ cần thiết của từng nguyên tố vi lƣợng trong môi trƣờng chỉ vào khoảng 10-6 - 10-8M. Hàm lƣợng 14 các chất khoáng chứa trong nguyên sinh chất thƣờng thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn phát triển và điều kiện nuôi cấy. Bình thƣờng khi nuôi cấy vi sinh vật, ngƣời ta không cần bổ sung các nguyên tố vi lƣợng. Những nguyên tố này có sẵn trong nƣớc máy, trong các hoá chất dùng làm môi trƣờng hoặc có lẫn trong thuỷ tinh của các dụng cụ nuôi cấy. Tuy nhiên cũng có một số trƣờng hợp cụ thể phải bổ sung các nguyên tố vi lƣợng vào môi trƣờng nuôi cấy. Ví dụ: Bổ sung Zn vào các môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Bo và Mo vào môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật cố định đạm . Chất sinh trưởng Muốn phát triển bình thƣờng vi sinh vật không những đòi hỏi phải đƣợc cung cấp đầy đủ protein, lipit, gluxit, muối khoáng… mà còn cần tới các chất sinh trƣởng. Tuỳ thuộc vào khả năng sinh tổng hợp của từng loại vi sinh vật mà cùng một chất có thể hoàn toàn không cần thiết với vi sinh vật này nhƣng có thể là có tác dụng kích thích sinh trƣởng, phát triển của vi sinh vật khác. Hầu nhƣ không có chất nào là chất sinh trƣởng chung đối với tất cả các loài vi sinh vật. Tuỳ theo từng loại vi sinh vật mà chúng ta bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy những chất sinh trƣởng khác nhau. 1.1.3. Ảnh hƣởng các nhân tố sinh thái đến sinh trƣởng và phát triển của Azotobacter. Vi khuẩn Azotobacter hiếu khí, sự phát triển và khả năng cố định nitơ của chúng trong đất chịu ảnh hƣởng của các điều kiện sau: Độ ẩm của đất Azotobacter đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất. Nhu cầu về độ ẩm của chúng cao hơn so với các vi khuẩn khác, tƣơng đƣơng với nhu cầu của cây trồng. Vì vậy ít gặp chúng ở vùng khô hạn, sự khô hạn của đất chỉ có bào xác của chúng mới chịu đựng đƣợc. Ẩm độ thích hợp: 75- 80 %. 15 Độ thoáng khí Độ thoáng khí của đất có liên quan đến quá trình cố định nitơ của Azotobacter. Tuy vậy vi khuẩn Azotobacter thuộc loại hiếu khí nhƣng có thể phát triển đƣợc trong điều kiện vi hiếu khí. Quá trình cố định nitơ của Azotobacter bị giảm khi thế ôxi hoá khử của môi trƣờng cao quá (+) 200 mv hoặc thấp quá (–) 200 mv. Nhƣ vậy, không khí quá mạnh cũng ức chế quá trình cố định nitơ phân tử, khi nồng độ ôxi trong không khí là 4 % quá trình cố định nitơ vƣợt quá ba lần so với khi ôxi là 10- 20 %. Nhiệt độ Mỗi loại vi sinh vật thích ứng ở nhiệt độ thích hợp để sinh trƣởng và tạo sản phẩm. Tuỳ theo quan hệ với các vùng nhiệt khác nhau, có thể phân chia vi sinh vật thành các nhóm cơ bản sau: nhóm ƣa lạnh, nhóm ƣa ấm và nhóm ƣa nhiệt. Vì vậy, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Nhiệt độ ảnh hƣởng đến Azotobacter không giống nhau ở các vùng địa lí khác 0 nhau. Ở vùng nhiệt đới Azotobacter có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ 35oC -40 C. Ở 0 0 7 C Azotobacter có hoạt động cố định nitơ thấp hơn 5 lần so với ở 45 C. Tế bào 0 0 dinh dƣỡng của Azotobacter không sống đƣợc khi xử lí 50 C trong 30 phút, ở 80 C sẽ chết rất nhanh. Nhiệt độ thích hợp đối với sự phát triển của Azotobacter vào 0 khoảng 20-30 C. pH của đất pH có ý nghĩa quyết định đối với sinh trƣởng của nhiều loài vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có những ảnh hƣởng mạnh mẽ. Các loại vi sinh vật khác nhau có khả năng thích nghi với các điều kiện pH khác nhau. pH của đất ảnh hƣởng không giống nhau đến sự phát triển và khả năng cố định N của Azotobacter. Azotobacter thích hợp nhất với pH = 7,2- 8,2, song có thể phát 16 triển đƣợc ở pH = 4,5- 9,0. Các loài Azotobacter khác nhau mẫn cảm khác nhau đối với pH của môi trƣờng. Chẳng hạn: pH thấp nhất của môi trƣờng đối với Azotobacter chroococcum và A. beijerinck khoảng 5,5; đối với A. macrocytones là khoảng 4,6. Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6, vì vậy ít gặp chúng ở đất chua. Cũng có thể phân lập đƣợc một số chủng từ đất chua nhƣng các chủng này thƣờng đã mất khả năng cố định nitơ. Các nhân tố sinh học Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh hƣởng mật thiết của khu hệ các sinh vật đất. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hƣởng tốt còn có nhiều nhóm có khả năng ức chế sự phát triển của Azotobacter. Ngoài ra các yếu tố khác nhƣ phân đạm, phân lân, phân kali cũng có ảnh hƣởng không nhỏ tới sự sống và quá trình cố định nitơ của Azotobacter. 1.2. Sự phân bố của Azotobacter trong đất. Đất là môi trƣờng thuận lợi cho sinh trƣởng và phát triển của các loài vi sinh vật. Trong thành phần sinh vật đất, vi sinh vật chiếm tới 90%. Trong thành phần cacbon hữu cơ của đất, vi sinh vật chiếm khoảng 2%. Số lƣợng vi sinh vật trong mỗi gam đất có tới hàng triệu, hàng tỉ và tới vài chục tỉ tế bào. Vi khuẩn là nhóm chiếm số lƣợng lớn nhất trong đất (106 – 1010 tế bào/gam đất) nhƣng vì kích thƣớc nhỏ (khoảng 1µm) nên chúng chỉ chiếm không quá 20% trọng lƣợng của vi sinh vật trong đất [23], [29]. Ở chiều sâu đất 10 – 20cm so với bề mặt Azotobacter và các vi sinh vật khác thấy có số lƣợng nhiều hơn các tầng đất khác. Ở tầng đất này độ ẩm thích hợp, các chất dinh dƣỡng tích lũy nhiều, không bị tác dụng của ánh sáng mặt trời nên hệ vi sinh vật phát triển nhanh, các quá trình chuyển hóa quan trọng trong đất chủ yếu xảy ra trong tầng đất này [10]. 17 Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh nhất so với vùng không có rễ, vì rễ cây cung cấp một lƣợng lớn chất hữu cơ khi chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thƣờng xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dƣỡng cho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ độ ẩm. Tất cả những yếu tố đó làm cho số lƣợng vi sinh vật, trong đó có cả Azotobacter phát triển ở vùng rễ mạnh hơn vùng ngoài rễ. Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống thƣờng tiết qua bộ rễ những chất khác nhau. Bộ rễ chết đi cũng có thành phần các chất khác nhau. Thành phần và số lƣợng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lƣợng vi sinh vật sống trong vùng rễ đó. Ví dụ: vùng rễ cây họ đậu thƣờng phân bố nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh (Rhizobium), còn vùng rễ lúa là nơi cƣ trú của các nhóm cố định nitơ tự do (Azotobacter) hoặc nội sinh ... [10]. Kết quả nghiên cứu sự phân bố của Azotobacter trong vùng rễ và ngoài vùng rễ từ cánh đồng lúa mì ở Bangladesh, cho thấy rõ hơn sự có mặt của Azotobacter ngoài vùng rễ đạt 5.2 x 104 – 7.2 x 104 CFU/g và trong vùng rễ đạt 17.2 x 104 – 25.5 x 104 CFU/g [28]. Azotobacter phát triển mạnh trong điều kiện đất thoáng khí, độ ẩm của đất cao. Tuy nhiên, yếu tố có tính quyết định đến sự có mặt của Azotobacter trong đất lại là sự phản ứng của đất. Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng Azotobacter chỉ thích ứng với đất ít chua hoặc trung tính [9], [18]. Các điều tra ở đất Việt Nam cho biết, khi pH đất thấp hơn 5,5 sự phát triển của Azotobacter bị hạn chế một cách rõ rệt. Trong khi đó ở các đất có pH trung tính Azotobacter luôn có từ hàng nghìn đến hàng vạn tế bào trong mỗi gam chất khô [4]. Nhƣ vây, trên đất phù sa sông Hồng và sông Cửu Long luôn có mặt Azotobacter. Tuy nhiên, cùng là đất phù sa nhƣng hoạt động của Azotobacter lại không giống nhau. Đất phù sa sông Hồng thƣờng có số lƣợng Azotobacter cao hơn đất phù sa sông Cửu Long do ƣu điểm nổi bật của đất phù sa sông Hồng có pH trung tính [2]. 18 1.3. Khả năng cố định nitơ của Azotobacter 1.3.1. Quá trình cố định nitơ sinh học Nitơ là nguyên tố trơ khó liên kết hóa học với các nguyên tố khác, nếu không có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác, nó không ngừng bị chuyển hóa trong một chu trình khép kín do các tác động sinh học hay hóa học khác nhau. Dƣới tác động của các hoạt động hóa học hoặc sinh học, nitơ phân tử đƣợc chuyển hóa thành đạm vô cơ, sau chuyển hóa thành đạm thực vật hoặc động vật thông qua quá trình đồng hóa. Một phần đạm thực vật dƣới dạng tàn dƣ thực vật và một phần khác đƣợc con ngƣời, động vật thải ra dƣới dạng phân bón đƣợc trả lại cho đất. Đạm trong đất, một phần đƣợc cây trồng sử dụng, số còn lại bị mất do rửa trôi hoặc bay hơi do hoạt động của các vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm. Quá trình đất mất đạm chịu ảnh hƣởng rất lớn bởi các chế độ canh tác [15]. Nitơ đồng thời cũng là yếu tố dinh dƣỡng vô cùng quan trọng không chỉ với các sinh vật bậc cao mà cả với các sinh vật nhỏ mắt thƣờng không nhìn thấy đƣợc. Trong tự nhiên, nitơ phân tử tồn tại dƣới dạng khí chiếm tới 78,16% thể tích không khí, song lại không sử dụng đƣợc làm nguồn dinh dƣỡng cho sinh vật. Để cây trồng có thể sử dụng nguồn tài nguyên này làm chất dinh dƣỡng, nitơ không khí phải đƣợc chuyển hóa thông qua quá trình cố định nitơ (cố định đạm), trong đó nitơ phân tử đƣợc chuyển hóa thành amôn. Quá trình cố định nitơ có thể xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học, trong đó ngƣời ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm sinh học vì hiệu quả và tính an toàn của nó đối với môi trƣờng [15]. Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử là một bí ẩn đầy hấp dẫn của tự nhiên. Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành NH3có xúc tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP N2 + AH2 + ATP nitrogenaza NH3 + A + ADP +P 19 Năm 1992 các nhà khoa học đã hoàn thiện đƣợc cơ chế của quátrình cố định nitơ phân tử nhƣ sau [4] N=N NH = NH N2 + 8H+ + 8e- + 16 Mg.ATP + 16º H2N-NH2 nitrogenaza NH3 2NH3 + H2 +16 Mg.ADP + 16P 1.3.2. Vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter Vi khuẩn cố định nitơ tốt nhất và đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là Azotobacter. Azotobacter không có khả năng đồng hóa chất mùn, chúng chỉ có khả năng phát triển mạnh trong đất có chứa nhiều chất hữu cơ dễ đồng hóa. Azotobacter đồng hóa rất tốt các sản phẩm phân giải của cellulose. Phần lớn các chủng Azotobacter phân lập đƣợc từ thiên nhiên có khả năng cố định đƣợc trên 10 mg N2 khi tiêu thụ hết 1g các hợp chất cacbon. Một số chủng Azotobacter trong những điều kiện thích hợp có khả năng đồng hoá đƣợc đến 300 mg N2/g hợp chất cacbon [4]. Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh hƣởng mật thiết của khu hệ các vi sinh vật đất. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hƣởng tốt đối với sự phát triển của Azotobacter (tổng hợp các chất hoạt động sinh học, phân giải các thức ăn hữu cơ bền vững) còn có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của Azotobacter (cạnh tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh v.v...) [4]. Đã có nhiều công trình nghiễn cứu đề cập đến mối quan hệ giữa Azotobacter và cây trồng. Azotobacter thƣờng xuyên có mặt trong vùng rễ cây trồng với số lƣợng cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ. Số lƣợng của chúng còn biến đổi phụ thuộc vào từng loài cây, từng giai đoạn phát triển của cây và nhiều yếu tố sinh thái địa lý khác. Azotobacter không phát triển trên bề mặt rễ mà phát triển trong đất xung quang rễ [4]. 20
- Xem thêm -