Tài liệu Trichoderma Reesei Tìm hiểu gen qui định Enzyme Cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân huy Cellulose

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đồ án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của: Thạc Sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề liên quan và cung cấp một số tài liệu có ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án. Tất cả các thầy cô giáo - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đồ án. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc. Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành! SVTH: Nguyễn Thị Hương i Mục Lục Mục Lục............................................................................................................................. ii Danh Mục Hình.................................................................................................................. v Lời Mở Đầu..................................................................................................................... vii I. Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei.................................................................1 1. Lịch sử phát hiện......................................................................................................1 2. Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei.................................................................2 2.1. Vị trí phân loại...................................................................................................2 2.2. Đặc điểm hình thái............................................................................................3 3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa.......................................................................................5 3.1. Đặc điểm sinh thái................................................................................................5 3.2. Môi trường sống...................................................................................................5 3.3. Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh................................................................6 3.4. Môi trường nhân sinh khối....................................................................................6 4. Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma.......................................................6 5. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma...................................................7 5.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng..........................7 5.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường...........................................................................9 5.3. Trong lĩnh vực khác..............................................................................................9 II. Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei:.................................................11 1. Cellulose:...............................................................................................................11 1.1. Cấu trúc:..........................................................................................................11 1.2. Nguồn gốc:......................................................................................................12 2. Cellulase:...............................................................................................................15 2.1. Cấu trúc:..........................................................................................................15 2.2. Phân loại:.........................................................................................................19 2.3. Cơ chế hoạt động:............................................................................................20 SVTH: Nguyễn Thị Hương ii 2.4. Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei :.......................................................22 Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả năng phân hủy cellulose cao.................29 I. Phương pháp hiện đại:..............................................................................................29 1.1. Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei.........29 1.1.1. Khuếch đại biểu hiện cbh1 bằng cách tăng số bản sao gen cbh1:.................29 1.1.2. Khuếch đại biểu hiện cbh2 bằng cách sử dụng promoter mạnh cbh1:..........31 1.2. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách sử dụng promoter mạnh :..............................................................................................35 1.3. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách nhân bản và biểu hiện gen khác loài :...........................................................................38 1.3.1. Plasmids.......................................................................................................39 1.3.2. Kết quả.........................................................................................................40 II. Phương pháp cổ điển:................................................................................................42 2.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái T.reesei và việc sản xuất enzyme cellulase...........................................................................................................42 2.1.1. Sự phát triển của hệ sợi nấm........................................................................45 2.2. Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất cellulase..........................................................................................................48 2.3. Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase.............................................50 2.4. Ảnh hưởng của sục khí và không sục khí đến khả năng sản xuất cellulase ở T.reesei RUT C30.........................................................................................................51 PHẦN 3: KIẾN NGHỊ.....................................................................................................52 TÀI LIỆU THAM KHẢO:...............................................................................................53 Danh Mục Bảng Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm.....................................................................2 Bảng 1 2: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật.........................................14 Bảng 1 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9]........................................................................19 SVTH: Nguyễn Thị Hương iii Bảng 1 4: Tóm tắt các loại enzymee có mặt trong T.reesei [8, 11]...................................23 Bảng 1 5: Tóm tắt các gen qui định cellulase ở nấm T.reesei...........................................28 Bảng 2 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ALK02221 và bởi chủng đã biến đổi ALK03760, ALK03862, ALK03761..................................................................................31 Bảng 2 2: Sản xuất cellulase bởi chủng ALKO2221 và chủng ALKO3797, ALKO3798, ALKO3873....................................................................................................................... 34 Bảng 2 3: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ VTT-79125 và các chủng đột biến sản xuất lượng lớn EGI..................................................................................................................37 Bảng 2 4: Các primer để khuếch đại gen egl 20-50 kDa và cbh 50kDa của M.albomyces bằng phương pháp PCR...................................................................................................39 Bảng 2 5: Sản xuất cellulase bởi chủng M. albomyces ALKO4237, chủng chủ Trichoderma ALKO3620 (egl2) và chủng T.reesei biến đổi sao chép cel45A, cel7A và cel7B thay thế gen cbh1 hay egl1.....................................................................................41 Bảng 2 6: So sánh sản lượng tế bào thu được trong nuôi cấy liên tục của nấm T.reesei..52 Danh Mục Hình Hình 1 1: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử...........................................5 Hình 1 2: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium.......................................7 Hình 1 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất ở công ty Điền Trang............................................................................................................. 8 Hình 1 4 Tăng cường rễ phát triển trong lĩnh vực trồng ngô và đậu tương của dòng T. harzianum T-22 [G. E. Harman, Cornell University, Geneva]...........................................8 SVTH: Nguyễn Thị Hương iv Hình 1 5: Một số gen biocontrol từ T. harzianum đã được đưa vào cây thuốc lá để kháng nấm Alternaria alternata gây bệnh héo lá và vào cây khoai tây để kháng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh thối rễ [bởi G. E. Harman, Cornell University, Geneva].. .10 Hinh 1 6: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose:Màu nâu-cacbon, màu đỏ-oxy, màu trắng-hydro [ web bách khoa toàn thư ]...................................................................11 Hình 1 7: Cấu trúc của phân tử cellulose.........................................................................12 Hình 1 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật..................13 Hinh 1 9: Cấu trúc không gian 3 chiều của enzyme cellulase (Ngân hàng dữ liệu protein, cấu trúc 1JS4)..................................................................................................................15 Hinh 1 10: Sơ đồ cấu trúc cellulase..................................................................................17 Hinh 1 11: Ứng dụng trung tâm liên kết với cellulose trong sản xuất protein tái tổ hợp [7] ......................................................................................................................................... 18 Hinh 1 12: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase [10]......................................................22 Hình 1 13: vùng xúc tác của các enzyme..........................................................................24 Hình 1 14: Cơ chế enzym thủy phân cellulose . Hai cellobiohydrolases (CBH) tấn công vào vùng cellulose tinh thể ở chuỗi kết thúc và endoglucanases (EG) ở giữa khu của cellulose. Các vòng tròn đầy, ký hiệu là R, đại diện cho vùng kết thúc giảm và các vòng tròn mở, ký hiệu NR, đại diện cho vùng kết thúc không giảm. C là vùng cellulose kết tinh[ Teeri, 1997 ]..................................................................................................................... 26 Hinh 2 1: Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHI [ Kelly và Hynes, 1985 ].......................................................................29 Hình 2 2: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi....................................................30 Hinh 2 3: Plasmid pALK546 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHII .............................................................................................................32 Hình 2 4: Kết quả Southern Blot của các chủng biến đổi.................................................32 Hình 2 5: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi....................................................33 SVTH: Nguyễn Thị Hương v Hình 2 6: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pALK537. egl2 được nối với promoter cbh1. Đoạn NotI 9.2 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi.....................35 Hình 2 7: Giới hạn của plasmid pALK540. Đoạn ClaI-PvuI 11.6 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi...........................................................................................36 Hình 2 8: Southern blotting của chủng ALKO3530 và ALKO3574 .................................37 Hình 2 9: Các plasmid được sử dụng cho biến đổi T.reesei ALK3620 biểu hiện gen cel45A, cel7A, cel7B ở M.albomyces...............................................................................40 Hình 2 10: sự phát triển hình thái của các sợi nấm trên các môi trường : môi trường (A), môi trường B ( B), môi trường C (C), môi trường D (D)..................................................45 Hình 2 11: đặc điểm hình thái của sợi nấm theo thời gian trên các môi trường khác nhau. Môi trường A (), môi trường B (), môi trường C (), môi trường D ()......................47 Hình 2 12: ảnh hưởng của pH đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất alpha cellulose................................................................................48 Hình 2 13: ảnh hưởng của pH khác nhau đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất CTMP..................................................................................49 Hình 2 14: Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase.......................................50 Hình 2 15: Ảnh hưởng của quá trình sục khí () và không sục khí () trong quá trình lên men............................................................................................................................. 51 SVTH: Nguyễn Thị Hương vi Lời Mở Đầu Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Những năm gần đây, nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Dưới áp lực trên, nguồn năng lượng tái tạo đang được các quốc gia quan tâm Việc sử dụng cellulase của Trichoderma reesei để chuyển hóa nguyên liệu giàu cellulose thành ethanol đang được nghiên cứu và áp dụng. Việt Nam có nguồn sinh khối tự nhiên dồi dào. Thêm vào đó, nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp phong phú và đa dạng. Enzym Cellulase là một phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucosid trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu enzym cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật. Trong đó, vi nấm Trichoderma là nguồn thu enzyme cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá cao. Mục đích của đề tài này là tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose. Để từ đó, giải quyết được những vấn đề “nóng” ở Việt Nam và trên thế giới SVTH: Nguyễn Thị Hương vii PHẦN 1: TỔNG QUAN I. Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei 1. Lịch sử phát hiện Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichoderma viride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương trình điều tra của quân đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T. Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma. Việc nuôi cấy dễ dàng và không tốn kém, các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới [Theo Christian P. Kubicek và Gary E. Harman]. 2. Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei 2.1. Vị trí phân loại Ban đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành 4 ngành (Division, Phylum): Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota . Tiến bộ của Sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Nấm được chia thành 10 SVTH: Nguyễn Thị Hương 1 dưới ngành (subphylum) trong đó Ascomycota và Basidiomycota được xếp vào dưới ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một số Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng phân loại . Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS. ( CBS Course of Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma như sau: 2.2. Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Ascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Loài: Trichoderma reesei Đặc điểm hình thái Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 510 µm). SVTH: Nguyễn Thị Hương 2 Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhóm phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử cùa Trichoderma, có màu xanh đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử luôn đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân có nhiều lỗ thủng. Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tế bào phía sau ngọn (1,2 nhân). Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối ít ( 6 ở T.reesei). Tế bào nấm chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân thực (Eukaryote) khác. Ribosome của T.reesei thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit) : bán đơn vị lớn (large subunit ) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein) Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phía đỉnh ngọn sợi nấm. Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis) hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vật khác sinh ra. Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp với thành tế bào tạo nên một màng dày hình thành những bào tử áo (chlamydospore). Loại bào tử này có thể SVTH: Nguyễn Thị Hương 3 giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh (endospore). Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều- mycelia), sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo hệ thống liên thông thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hình 1 1: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử SVTH: Nguyễn Thị Hương 4 ( nguồn bởi G.B.Sharples) 3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 3.1. Đặc điểm sinh thái T.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty. T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C. Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 25 0C-300C, chậm ở 350C-370C. Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường. Trong khi ở 370C, bào tử không xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy. 3.2. Môi trường sống Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm. Hầu hết chúng là vi sinh vật hoại sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. chúng có mặt khắp mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hoặc cận nhiệt đới là khu rừng ôn đới hay rừng phương Bắc. Nhu cầu nhiệt độ tối đa của môi trường sống đặc trưng cho từng loài. Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và Trichoderma sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia. Trichoderma có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dứa (6-pentyl-pynone đã bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của Trichoderma 3.3. Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh : glioviridin, sespuiterpenoids, trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid . Trichoderma có khả năng sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp: anthroquinon , emodin . SVTH: Nguyễn Thị Hương 5 3.4. Môi trường nhân sinh khối Trichoderma phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia… 4. Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma [nguồn TS. Dương Hoa Xô - TT CNSH Tp. Hồ Chí Minh] Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều "hoạt động" khác nhau, chúng có thể sử dụng: Kháng sinh được tạo ra chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng trưởng của tác nhân gây bệnh Cạnh tranh: Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma "xâm chiếm" môi trường trước các vi sinh vật khác. Ký sinh: tức giết chết các loài gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên trong loài nấm gây hại và/hoặc tiết ra những chất (enzymee) để phân hủy chúng. SVTH: Nguyễn Thị Hương 6 Hình 1 2: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium [(Nguồn: DienTrang Biolab)] 5. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 5.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng Bảo vệ thực vật: một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma được quan tâm nhiều nhất là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều loại Trichoderma khác để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác. Kết quả các loại Trichoderma kiểm soát hiệu quả các nấm gây bệnh. Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam. Phân SVTH: Nguyễn Thị Hương 7 hữu cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là lọai phân có tác dụng rất tốt trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmirova gây ra. Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii …. Hình 1 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất ở công ty Điền Trang. Cải thiện năng suất cây trồng : (kích thích sự tăng trưởng của cây trồng) Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) giúp khả năng hút chất ding SVTH: Nguyễn Thị Hương 8 dưỡng .Ngoài ra, những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán. Hình 1 4 Tăng cường rễ phát triển trong lĩnh vực trồng ngô và đậu tương của dòng T. harzianum T-22 [G. E. Harman ﾧ, Cornell University, Geneva]. 5.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường Xử lý các phế phẩm nông nghiệp: Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngòai tác dụng sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, hay sử dụng như một lọai thuốc bảo vệ thực vật thì còn có tác dụng để xử lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất hiệu quả. Chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma ) của Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam … đang được nông dân TP. Hồ Chí Minh và khu vực Đồng bằng Sông Cửu long, Đông nam bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng. Việc sử dụng chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng. Người nông dân lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong phân. Các chế phẩm của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm chứa các vi sinh vật do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp. Những vi sinh vật trên có tác dụng phân huỷ nhanh các hợp SVTH: Nguyễn Thị Hương 9 chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein và cellulose), gây mất mùi hôi. Trước đó, chế phẩm BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt. 5.3. Trong lĩnh vực khác Trichoderma được bổ sung vào thức ăn gia cầm nhằm tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose ở vật nuôi . Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển . Hình 1 5: Một số gen biocontrol từ T. harzianum đã được đưa vào cây thuốc lá để kháng nấm Alternaria alternata gây bệnh héo lá và vào cây khoai tây để kháng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh thối rễ [bởi G. E. Harman ﾧ, Cornell University, Geneva]. Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzymee ngoại bào rất có hiệu quả. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzymee khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự . 6. Khả năng ứng dụng ở Việt Nam SVTH: Nguyễn Thị Hương 10 Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả . II. Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei: 1. Cellulose: 1.1. Cấu trúc: Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-D-Glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật. Hinh 1 6: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose:Màu nâu-cacbon, màu đỏoxy, màu trắng-hydro [ web bách khoa toàn thư ]. SVTH: Nguyễn Thị Hương 11 Các đơn vị lặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó bao gồm hai đơn vị glucose. Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết hydro và lực van der Waals để tạo thành cấu trúc cao phân tử không hòa tan. Hình 1 7: Cấu trúc của phân tử cellulose 1.2. Nguồn gốc: Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Điều không may là cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ. Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật. Cellulose có nhiều trong sợi bông (95%) , sợi lanh (71%), sợi đay ( 71% ). Ngoài ra, cellulose còn có trong gỗ, thưc vật dưới nước (tảo, rong,…),sản phẩm phụ phẩm nông nghiệp ( rơm, rạ, lõi ngô,…). SVTH: Nguyễn Thị Hương 12 Hình 1 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật [bởi Michael W. Davidson ﾧ ] SVTH: Nguyễn Thị Hương 13