Trích ly enzyme protease từ ruột cá tra

  • Số trang: 52 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 47 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ********* LUẬN VĂN TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ RUỘT CÁ TRA Sinh viên GVHD Nguyễn Vƣơng Tƣờng Vân MSSV: 2111677 Cần Thơ 2014 Huỳnh Thị Phƣơng Loan LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Vƣơng Tƣờng Vân với sự hƣớng dẫn của Ts. Huỳnh Thị Phƣơng Loan. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Trích ly enzyme protease từ ruột cá tra” đã đƣợc hội đồng chấm luận văn thông qua. Cần Thơ, ngày tháng Ngƣời viết GV hƣớng dẫn Huỳnh Thị Phƣơng Loan năm 2013 Nguyễn Vƣơng Tƣờng Vân i LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn này em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ từ rất nhiều phía. Trƣớc hết, em xin cám ơn Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & SHƢD, Trƣờng Đại học Cần Thơ đã tạo môi trƣờng thuận lợi nhất cho em học tập và nghiên cứu trong thời gian thực hiên luận văn này. Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô trong bộ môn, đặc biệt là cô Huỳnh Thị Phƣơng Loan đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn. Bên cạnh đó, cũng xin các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 37 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm. Cuối cùng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô Trƣờng Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại trƣờng. Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công. Em xin chân thành cám ơn! ii TÓM TẮT Nghiên cứu khả năng trích ly enzyme protease từ ruột cá tra nhằm thông qua đó xác định điều kiện tối ưu của quả quá trình trích ly như: tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi, thời gian trích ly, pH, nhiệt độ. Đặc biệt, kết hợp khảo sát tác động của 2 yếu tố pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease, quy hoạch thí nghiệm theo phương pháp giai thừa với 2 yếu tố, 4 mức can thiệp, thực hiện trên 16 mẫu thí nghiệm. Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi để quá trình trích ly tối ưu nhất là tỉ lệ 1/2. Thời gian trích ly tối ưu là 10 phút. Đồng thời, quá trình trích ly cho hoạt tính enzyme đạt cao nhất khi điều chỉnh pH môi trường trích ly là 9 kết hợp với điều kiện nhiệt độ 40°C. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... i LỜI CÁM ƠN .......................................................................................................................... ii TÓM TẮT ............................................................................................................................... iii MỤC LỤC .............................................................................................................................. iv DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................................. vi DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................................ vii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1 1.2 Nội dung nghiên cứu ......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................................. 2 2.1 Cá tra .............................................................................................................................. 2 2.1.1 Đặc điểm sinh học ................................................................................................... 2 2.1.2 Sơ lược hệ tiêu hóa của cá tra ................................................................................. 3 2.1.2.1 Dạ dày – dịch vị – pepsin .................................................................................... 3 2.1.2.2 Ruột – dịch ruột – tripsin và erepsin .................................................................... 3 2.1.2.3 Tụy – dịch tụy........................................................................................................ 4 2.2 Khái quát chung về enzyme protease ............................................................................ 4 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu enzyme ..................................................................................... 4 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme .......................................................... 4 2.2.2.1 Nồng độ enzyme ................................................................................................... 5 2.2.2.2 Nồng độ cơ chất ................................................................................................... 6 2.2.2.3 Nhiệt độ ............................................................................................................... 7 2.2.2.4 pH ........................................................................................................................ 7 2.2.2.5 Các chất kìm hãm ................................................................................................ 8 2.2.2.6 Các chất hoạt hóa ................................................................................................ 9 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease ........................................................................... 9 2.2.3.1 Về nguồn gốc thực vật ........................................................................................ 9 2.2.3.2 Về nguồn gốc vi sinh vật .................................................................................... 12 2.2.3.3 Về nguồn gốc động vật ..................................................................................... 13 2.2.4 Ứng dụng của enzyme trong sản xuất ................................................................... 17 2.2.4.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm .............................................................. 17 2.2.4.2 Ứng dụng trong phân tích .................................................................................. 18 2.2.4.3 Ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và nông nghiệp ............................................. 18 2.2.4.4 Ứng dụng trong công nghiệp năng lượng.......................................................... 19 2.3 Các nghiên cứu đã đƣợc thực hiện .............................................................................. 19 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 20 3.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................................. 20 3.2 Vật liệu......................................................................................................................... 20 3.3 Hóa chất ....................................................................................................................... 20 3.4 Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................................... 20 3.5 Phƣơng pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra .......................................................... 21 3.6 Bố trí thí nghiệm .......................................................................................................... 21 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................... 25 4.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme protease ...................... 25 4.3 Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease trích ly ...................... 27 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 29 5.1 Kết luận ........................................................................................................................ 29 iv TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 30 PHỤ LỤC 1: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH PROTESE ............................... ix PHỤ LỤC 2: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ............................................................................... xii Thí nghiệm 1 ...................................................................................................................... xii Thí nghiệm 2 ..................................................................................................................... xiv Thí nghiệm 3 ..................................................................................................................... xvi v DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Con cá tra ................................................................................................ 2 Hình 2.2: Lớp biểu mô dạ dày ................................................................................ 3 Hình 2.3: Nội tạng cá tra ......................................................................................... 4 Hình 2.4: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] ........................................... 6 Hình 2.5: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất ................................. 6 Hình 2.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme ........................................ 7 Hình 2.7: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ enzyme................................................. 7 Hình 2.8: Cơ chế hoạt động của enzyme ................................................................ 8 Hình 2.9: Trái dứa ................................................................................................... 9 Hình 2.10: Cấu trúc glycan của enzyme bromelin ............................................... 10 Hình 2.11: Quả đu đủ xanh .................................................................................... 11 Hình 2.12: Cấu trúc bậc 2 của papain .................................................................... 11 Hình 2.13: cây sung ngọt (Ficus carica) ................................................................ 12 Hình 2.14: Cấu trúc của pepsin và pepsinogen ...................................................... 13 Hình 2.15: phân tử rennin ...................................................................................... 15 Hình 2.16: Sự hoạt hóa tripsinogen thành tripsin .................................................. 16 Hình 2.17: Sự hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotrypsin ........................... 17 Hình 2.18: Enzyme chymotripsin B ...................................................................... 18 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme protease từ ruột cá Tra ....................... 21 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ....................................................................... 22 Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ....................................................................... 23 Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ....................................................................... 24 Hình 4.1: Ảnh hƣởng của tỷ lệ ruột/ dung môi đến hoạt tính protease trích ly ..... 25 Hình 4.2: Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến hoạt tính protease ....................... 26 Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng tác của nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme protease ..................................................................................................... 27 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên ............................. 2 Bảng 2.2: Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển enzyme ..... 4 Bảng 2.3: Một số tính chất của protease (P) tổng hợp protease ............................ 10 Bảng 2.4: Tỷ lệ sử dụng của một số enzyme trên thế giới..................................... 17 Bảng 2.5: Thị trƣờng enzyme trong công nghệ thực phẩm ................................... 18 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của các nhân tố đến phƣơng trình hồi quy ......................... 28 vii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ở đồng bằng sông Cửu Long, chế biến thủy sản là một trong những nghành đặc biệt phát triển nhờ vào đặc điểm khí hậu và nguồn nƣớc thích hợp cho việc nuôi trồng nhiều loại thủy sản. Cá tra, cá basa là loại cá dễ nuôi, đƣợc nuôi nhiều trong bè ven sông hay trong ao, đây là loài cá có giá trị kinh tế cao và đƣợc xuất khẩu đi nhiều nƣớc trên thế giới. Các dạng sản phẩm chính của cá tra, cá basa nhƣ cá fillet, cá tra, basa xiên que, chả cá, cá cắt khúc, cá nguyên con… Hiện nay, các nhà máy thủy sản sản xuất khoảng 4000 tấn nguyên liệu/ ngày, tạo ra hơn 2000 tấn phế phẩm trong đó gồm nội tạng, mỡ cá, xƣơng cá, máu cá,… đây là nguồn nguyên liệu lý tƣởng cho việc sản xuất các sản phẩm phụ nhƣng vẫn chƣa đƣợc tận dụng một cách triệt để, việc thải một lƣợng lớn phế phẩm này ra môi trƣờng đã gây ra những vấn đề ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trƣờng sống của con ngƣời và các loài sinh vật. Vì vậy, nhiều công trình nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm mục đích giải quyết những vấn đề nan giải về môi trƣờng và làm tăng giá trị cho con cá tra, cá tra thông qua việc tận dụng tối đa các bộ phận của con cá. Mỡ cá tra, cá basa đƣợc tận dụng để sản xuất ra dầu bio-diesel, máu cá có hàm lƣợng protein khoảng 15% trong đó chủ yếu là albumin, globulin và fibrinogen thì đƣợc sử dụng để sản xuất bột máu bổ sung vào nguồn thức ăn cho động vật. Xƣơng cá cũng có thể xay thành bột để làm tức ăn gia súc, làm phân bón, xƣơng cá cũng có thành phần collagen nên có thể dung để nấu keo… Nội tạng cá (chiếm tỉ lệ khoảng 12,04% khối lƣợng phế phẩm) có chứa nhiều loại enzyme, đặc biệt là nguồn enzyme protease dồi dào nhƣng vẫn chƣa đƣợc sử dụng một cách hợp lí nên gây lãng phí lớn. Từ những vấn đề trên, đề tài trích ly enzyme protease từ nội tạng cá tra đƣợc thực hiện nhằm trích ly enzyme từ nội tạng cá để tạo nên chế phẩm enzyme protease 1.2 Nội dung nghiên cứu - Xác định ảnh hƣởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme protease từ nội tạng cá - Tối ƣu điều kiện trích ly enzyme protease với hoạt tính enzyme cao nhất 1 CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Cá tra 2.1.1 Đặc điểm sinh học Cá tra có tên khoa học là Pangasius hypophthalmus là loài cá thƣờng đƣợc nuôi nhiều trong ao, bè ở các tỉnh Tây Nam Bộ. Về hình thái sinh lý, cá tra là loại cá da trơn, thân dài, lƣng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng và có hai râu dài, sống chủ yếu ở nƣớc ngọt và chịu đƣợc nƣớc lợ nhẹ (độ muối dƣới 10 phần nghìn), chịu đựng đƣợc nƣớc phèn pH >4.(M.D. Menon and Cheko,1995). Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể sống đƣợc ở những ao hồ chật hẹp và chịu đƣợc mật độ nuôi cao. Khi thiếu oxy thì cá có thể hớp không khí trên mặt nƣớc, oxy sẽ đƣợc đi vào máu qua niêm mạc ruột và khí thừa sẽ theo hậu môn ra ngoài. Cơ quan tiêu hóa của cá tra gồm miệng, răng hàm, gai mang, dạ dày to hình chữ U, túi mật lớn, ruột. Thức ăn của cá tra thƣờng là những động vật nhỏ, thực vật, giáp xác,… Bảng 2.1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên Loại thức ăn Tỷ lệ (%) Nhuyễn thể 35.4 Cá nhỏ 31.8 Côn trùng 18.2 Thực vật dƣơng đẳng 10.7 Thực vật đa bào 1.6 Giáp xác 2.3 Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá tra từ 3 – 4 năm, cá bố mẹ đẻ trứng ở vùng thƣợng lƣu, cá bột sau khi nở sẽ theo dòng nƣớc về hạ lƣu. Hình 2.1: Con cá tra (Nguồn: http://www.maivietbio.com.vn/upload/Image/ca%20tra.jpg) Trong một con cá tra có tỷ lệ các phần nhƣ sau: thịt cá chiếm 45 – 48%, đầu xƣơng chiếm tỷ lệ 33 – 36%, da và vây chiếm tỷ lệ 6 – 8%, nội tạng chiếm tỷ lệ 11 – 13%. 2 2.1.2 Sơ lược hệ tiêu hóa của cá tra Để duy trì sự sống của cơ thể thì hệ tiêu hóa là rất quan trọng. Thức ăn là nguồn nguyên liệu cần thiết để cơ thể tồn tại và phát triển , các chất dinh dƣỡng từ thức ăn đƣợc hấp thụ thông qua hệ tiêu hóa. Do cá sống trong môi trƣờng nƣớc nên tác dụng làm ƣớt thức ăn của nƣớc bọt là không thiết yếu do vậy khoang miệng của cá nói chung không có tuyến tiêu hóa, miệng cá có vai trò chủ yếu là bắt giữ mồi. Thức ăn đƣợc tiêu hóa chủ yếu là nhờ tác dụng của dịch tiêu hóa do các tuyến tiết ra, đƣợc chứa trong ống tiêu hóa. 2.1.2.1 Dạ dày – dịch vị – pepsin Trong dạ dày có các tuyến tiết ra dịch vị có tác dụng tiêu hóa đối với protein. Độ pH trong dạ dày của cá rất thấp. Vd: pH ở dạ dày cá hồi là 3.1 trong khi pH ở ruột non là 6.4. Trong dịch vị có enzyme pepsin, hoạt tính tối ƣu trong điều kiện pH 1.7 – 3.0 và nhiệt độ là 30 – 50oC. Ngoài ra, HCl cũng đƣợc tiết ra, có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa thức ăn và chuyển hóa của pepsinogen. Hình 2.2: Lớp biểu mô dạ dày (Nguồn:http://websrv1.ctu.edu.vn/coursewares/khoahoc/sinhhocdc_a2/phan2/ch7) Tác dụng của HCl: - Chuyển hóa pepsinogen thành pepsin hoạt động - Làm nở các mô liên kết của thức ăn, làm tan các chất keo - Thủy phân đƣờng đôi nhƣ saccarose… - Diệt khuẩn: có tác dụng diệt khuẩn đối với một số vi sinh vật nhƣ E.coli, tụ cầu… - Đóng mở môn vị Tác dụng của pepsin: - Phân giải protein không triệt để thành các chuỗi popypeptide mạch ngắn 2.1.2.2 Ruột – dịch ruột – tripsin và erepsin Dịch ruột đƣợc tiết ra do các tuyến ruột non, là một chất không màu, có tính chất kiềm. Tripsin ở đoạn ruột trƣớc nhiều hơn ở đoạn ruột sau, erepsin do tuyến ruột ở niêm mạc ruột tiết ra và tồn tại trong dịch ruột. Hai nhóm enzyme chính có trong ruột là: 3 - - Nhóm enzyme tiêu hóa protein gồm aminopeptidase và dipeptidase gọi chung là erepsin, chỉ có thể phân giải protein có phân tử lƣợng nhỏ nhƣ peptone và proteoza thành amino acid. Enzyme enterakinase có tác dụng hoạt hóa tripsinogen thành tripsin. Tripsin là enzyme hoạt động trong môi trƣờng kiềm tính, có tác dụng thủy phân không triệt để protein thành các phân tử peptide mạch ngắn (Nguyễn Đức Lƣợng,2004) Hình 2.3: Nội tạng cá tra (Nguồn: http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1230) 2.1.2.3 Tụy – dịch tụy Dịch tụy do tụy tạng tiết ra, độ pH = 8. Trong dịch tụy có nhiều enzyme tiêu hóa - Trypsinogen và chymotripsinogen, peptidase. Tripsinogen khi gặp enterokinase của ruột sẽ đƣợc hoạt hóa thành tripsin. Chymotripsinogen khi gặp tripsin sẽ đƣợc hoạt hóa thành chymotripsin. - Lipase của tụy là một enzyme tiêu hóa mạnh, thủy phân lipid thành glycerin và acid béo 2.2 Khái quát chung về enzyme protease 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu enzyme Bảng 2.2: Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển enzyme Năm Nghiên cứu, phát triển 1833 Payen và Persoz tách đƣợc diatase từ malt 1874 Hansen tách đƣợc rennet từ bao tử cừu 1876 Kiihne đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme 1897 Anh em Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa glucose thành cồn và CO2 1900 Rohm sử dụng protease trong công nghệ thuộc da 4 1913 Rohm sử dụng enzyme làm chất tẩy rửa 1917 Boidin và Effront nghiên cứu α-amylase của B.subtilis và đƣợc ứng dụng trong nghành dệt 1920 – 1928 1926 Will Slitter tinh sạch đƣợc enzyme Samner kết tinh đƣợc urease và Northrop kết tinh đƣợc protease Fleming phát hiện ra penicilline 1928 1969 1972 1973 1984 1984 đến nay Tanabe co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid. Sử dụng glucose isomerase trong sản xuất dung dịch đƣờng giàu fructose Boyer et al đƣa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích cực đến công nghệ enzyme Tanabe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào. Winter và Ferch đƣa ra công nghệ sản xuất protein Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry – lamide và một loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme. Phát hiện ra hàng trăm loại enzyme khác nhau, đã đƣa vào sản xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống. 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, các ion kim loại…Dƣới đây sẽ xét đến các yếu tố thƣờng gặp và có tác động nhiều nhất đến vận tốc phản ứng của enzyme. 2.2.2.1 Nồng độ enzyme Tốc độ phản ứng thƣờng biến đổi theo nồng độ cơ chất [S] và nồng độ enzyme [E]. Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng dần. Khi nồng độ cơ chất lớn, tốc độ phản ứng ít phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hƣớng phụ thuộc vào nồng độ enzyme. Trong điều kiện thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [S]. Phƣơng trình vận tốc phản ứng V = K[E] có dạng y=ax. Khi đó, vận tốc phản ứng sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ enzyme (Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải,2005). 5 Hình 2.4: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] (Nguồn: https://voer.edu.vn/m/dong-hoc-enzyme/0a676f67) 2.2.2.2 Nồng độ cơ chất Phƣơng trình Michaelis – Menten cho ta thấy rõ mối quan hệ của nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng. Km đƣợc gọi là hằng số Michaelis – Menten đặc trƣng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn (Nguyễn Công Hà, Lê Nguyễn Đoan Duy,2011). Vmax Tốc độ V= Vmax 2 Vmax + S Km + S Km Nồng độ cơ chất Hình 2.5: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất (Nguồn: https://voer.edu.vn/c/khai-niem-chung-ve-trao-doi-chat-o-vi-sinh-vat/) Phƣơng trình động học Michaelis – Menten cho thấy sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme vào nồng độ cơ chất (hình 2.5), phƣơng trình này liên kết tốc độ phản ứng (V), nồng độ cơ chất (S) với tốc độ cực đại (Vmax) và hằng số Michaelis (Km). Với: Km là hằng số Michaelis đặc trƣng cho ái lực của enzyme với cơ chất và V max là tốc độ tạo thành sản phẩm khi enzyme đƣợc bão hòa cơ chất và hoạt động nhanh tối đa. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng tăng, khi [S] tăng đến một giá trị nào đó thì vận tốc đạt cực đại và sẽ không tiếp tục tăng nếu [S] vẫn tăng. Điều này cho thấy khi nồng độ cơ chất tăng đến một giới hạn nào đó thì cơ chất sẽ ức chế hoạt động của enzyme làm ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng. 6 2.2.2.3 Nhiệt độ Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trƣờng, hiện tƣợng này tuân theo quy luật Vant - Hoff. Khi tăng nhiệt độ lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần (Nguyễn Minh Thủy,2005). Hình 2.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme (Nguồn: https://sites.google.com/site/hoangnhi2/) Phản ứng do enzyme xúc tác cũng chịu ảnh hƣởng của định luật này nhƣng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein.Khi ta tăng nhiệt độ lên quá cao thì enzyme sẽ bị biến tính, phần lớn enzyme có nhiệt độ tối thích trong khoảng 30 – 50oC. Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm (hình 2.6). Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc vào nguồn cung cấp enzyme, cũng có enzyme có nhiệt độ tối thích cao trong khoảng nhiệt độ từ 60 – 70oC. 2.2.2.4 pH Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm hoạt động, là nơi liên kết với cơ chất của phân tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Mỗi enzyme có một pH tối thích khác nhau, phần lớn enzyme có pH tối ƣu trong khoảng 4 – 6. Ảnh hƣởng của pH lên vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có dạng nhƣ hình 2.7 Vận tốc phản ứng pH Hình 2.7: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ enzyme (Nguồn: https://voer.edu.vn/m/dong-hoc-enzyme/0a676f67) Ảnh hƣởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau:  Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp 7  Ở hai sƣờn của pH tối thích có thể xảy ra sự phân ly nhóm prosthetic hay coenzyme.  Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly cơ chất.  Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và thay đổi hoạt tính cực đại. 2.2.2.5 Các chất kìm hãm Hoạt độ enzyme có thể bị thay đổi dƣới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau. Các chất làm giảm hoạt độ enzyme nhƣng không bị chuyển hóa bởi enzyme đƣợc gọi là các chất kiềm hãm hoặc các chất ức chế. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein. Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme. Nhiều chất khác không làm biến tính enzyme nhƣng vẫn kìm hãm hoạt động của enzyme theo một cơ chế khác. Các chất này có thể kìm hãm hoạt động của enzyme theo hƣớng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch (Lê Ngọc Tú,2004). Nếu là kìm hãm thuận nghịch thì phản ứng kết hợp giữa enzyme và chất kìm hãm nhanh chóng đạt đến cân bằng. Trong trƣờng hợp kìm hãm không thuận nghịch, k-1 (hình 2.8b) rất bé có thể xem nhƣ bằng không, I kết hợp với E bằng liên kết đồng hóa trị hoặc liên kết rất chặt khó có thể tách khỏi E, sự phân ly của phức EI là rất chậm. K1 K-1 Hình 2.8: Cơ chế hoạt động của enzyme a: Mô hình trung tâm hoạt động của Fisher, b: Mô hình của Koshland (Nguồn: https://voer.edu.vn/m/cau-truc-phan-tu-enzyme/c2b85cd6) 8 2.2.2.6 Các chất hoạt hóa Là chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông thƣờng là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ nhƣ các vitamin tan trong nƣớc làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydro hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc là những chất có khả năng phục hồi những nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme (Lê Ngọc Tú,2004). Tính chất hoạt hóa của các cation kim loại:  Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho một kiểu phản ứng nhất định.  Cation kim loại có tính đặc hiệu tƣơng đối hay tuyệt đối.  Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion.  Phụ thuộc nồng độ cation kim loại .  Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích. 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease Trong ngành công nghiệp thực phẩm thƣờng sử dụng rất nhiều protease để hỗ trợ quá trình sản xuất nhằm tăng khả năng sản xuất sản phẩm và hạ giá thành sản phẩm. Enzyme protease có thể đƣợc thu nhận chủ yếu từ 3 nguồn là thực vật, động vật và vi sinh vật. 2.2.3.1 Về nguồn gốc thực vật Bromelin từ cây dứa: Dứa có tên khoa học là Ananas comusus, thuộc họ Bromeliaceae. Cây dứa là loại cây đƣợc sử dụng hầu hết các bộ phận nhƣ phần thân và lá thì đƣợc sử dụng làm giấy hoặc làm phân bón. Quả dứa đƣợc sử dụng làm thực phẩm và có thể sử dụng các phế phẩm để trích ly enzyme bromelin. Hình 2.9: Trái dứa (Nguồn: http://www.thaphimex.com/vi/tin-tuc-va-su-kien/tin-rau-hoa-qua/) Trong quả dứa chín, cacbohydrate chiếm 10 – 18% (trong đó có 60 -67% saccharose, glucose và fructose chiếm 30 – 40%), protein 2 – 3%, acid hữu cơ 0,1 – 1.6%...Bromelin là tên gọi của nhóm enzyme thực vật có chứa sulfhydryl, có khả năng phân giải protein. Năm 1957, tiến sĩ Ralph Heinicke nhận thấy trong thân dứa có một lƣợng lớn bromelin và bắt đầu đƣợc chiết tách nó để đƣa vào sản xuất. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa thì bromelin có pH tối ƣu khác nhau và có cấu tạo khác nhau. 9 Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, pH tối ƣu nằm trong khoảng 6 – 8, có trọng lƣợng phân tử khoảng 33000 Da. Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin kể từ ba tháng trƣớc khi chín, trong đó hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trƣớc khi chín. Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảm xuống. Thông thƣờng, ngƣời ta có thể thu đƣợc trung bình 3.6 kg bromelin từ 378 lít dịch quả dứa. Hình 2.10: Cấu trúc phần glycan của enzyme bromelin (nguồn: http://www2.hcmuaf.edu.vn/data/mnam/image/) Bromelin là một protease có bản chất là một sợi glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrat carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide. Bromelin quả có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 283 – 161 amino acid. Bromelin thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầu carbohydrate là glycine, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanine. Bromelin là một protease mà trung tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối – S – S – , phân tử có dạng hình cầu. Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase. Trong một thử nghiệm hoạt tính phân giải của bromelin, ngƣời ta ghi nhân đƣợc hoạt tính phân giải casein của bromelin phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của quả dứa (chin, xanh) nhƣ: bromelin thân của quả vừa chín tới là 7.4 UI/ mg, của bromelin quả xanh là 4.0 UI/ mg và của bromelin quả chín là 3 UI/ mg. Papain thu nhận từ đu đủ xanh: Papain thƣờng đƣợc lấy từ nhựa của quả còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lƣợng từ 0,3 – 1 kg. Nhựa đu đủ phải chứa trong bình thủy tinh sậm màu, tránh tiếp xúc với không khí để đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa. 10 Hình 2.11: Quả đu đủ xanh (Nguồn: http://khoahocthoidai.vn/news.aspx?id=12Z80Z1432) Nhựa là hỗn hợp các enzyme protease: papain, chymopapain A (gốc acid amin cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc acid amin cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease. Trong đó, hàm lƣợng papain chiếm trên 95% tổng hàm lƣợng protease có trong nhựa đu đủ. Papain là một endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S. Theo nghiên cứu của Smith (1960) và Hill (1965), papain là một chuỗi polypeptide có 185 amino acid, có trọng lƣợng phân tử khoảng 20900 Dalton. Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain đƣợc cấu tạo bởi 212 amino acid không có methionine. Phân tử lƣợng 23350 Da, phân tử papain là một chuỗi polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo ra 3 cầu liên kết disulfur. Hình 2.12: Cấu trúc bậc 2 của papain (Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Enzym) Trung tâm hoạt động của papain gồm có nhóm – SH của cysteine và nitrogen bậc 3 của histidine, nhóm imidazole của histidine cũng liên kết với Asp bởi liên kết hidro. Papain thủy phân protein thành các polypeptide và acid amin. Papain có thể thủy phân hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline, với các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do. Hoạt tính của enzyme papain đƣợc tăng cƣờng khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại nhƣ EDTA. Papain bị kìm hãm bởi các chất oxy hóa nhƣ: oxi, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobenzoate, cystine và các hoạt chất disulfur khác. 11 Ficin từ nhựa của cây thuộc họ sung, vả: Ficin là một protease đƣợc tìm thấy trong nhựa của cây sung, vả, thuộc họ Moraceae. Ngày xƣa, con ngƣời đã biết sử dụng nhựa của các cây họ sung để làm đông sữa trong sản xuất phô mai. Năm 1930, Robbins nhận thấy trong nhựa của các cây họ sung có một loại enzyme có thể tiêu diệt đƣợc giun tròn Ascaris, ông đặt tên cho nó là ficin. Trong đó, sung ngọt là loại cây có nhiều nhựa trắng đục, có sản lƣợng cao và đƣợc trồng phổ biến ở Hoa Kỳ, Tây Ban Nha, Ai Cập…. Nhựa đƣợc thu vào buổi sáng thì enzyme ficin có hoạt tính cao nhất, sấy khô để dùng trong công nghiệp thực phẩm. Hình 2.13: Cây sung ngọt (Ficus carica) (Nguồn: www.compagniadelgiardinaggi) Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulhydryl (SH). Trình tự các amino acid trong trung tâm phản ứng của ficin. – Pro – Leu – Arg – Gln – Gly – Glu – Cys – Gly – Ser – Cys – Tryp – Trọng lƣợng phân từ: 23000 – 27000 Da Nhiệt độ hoạt động: 30 – 80oC, nhiệt độ tối ƣu là 50 – 65oC Điểm đẳng điện: 9 – 10 pH hoạt động của ficin rộng: 4 – 9.5 Ficin có thể thủy phân liên kết của các protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả Ascaris sống. ficin cũng có thể thủy phân các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo. 2.2.3.2 Về nguồn gốc vi sinh vật Enzyme là một loại protein có tác dụng xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào, cơ thể. Ngày nay, vi sinh vật là đối tƣợng đƣợc sử dụng trong sản xuất enzyme ngày nay. Giống vi sinh vật trong sản xuất enzyme quyết định đến: - Khả năng sinh tổng hợp enzyme - Hoạt tính enzyme - Ảnh hƣởng đến năng suất tổng hợp enzyme Nhiều VSV có khả năng tổng hợp protease. Dựa vào cơ chất, pH hoạt động có thể chia protease thành 4 loại: protease acid, protease kim loại, protease thiol, protease xerin. Một số tác giả căn cứ vào pH hoạt động lại chia protease thành 3 loại là: protease trung tính, protease acid, protease kiềm. Các protease thiol, protease xerin có khả năng phân giải liên kết ester và liên kết amide của amino acid, ngƣợc lại các protease acid, protease kim loại thƣờng không có hoạt tính esterase. 12
- Xem thêm -