Tổng quan về ứng dụng sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược

  • Số trang: 79 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 31 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN THẢO DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN THẢO DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Phùng Thanh Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa sinh HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và hướng dẫn quý báu của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới: - Ban giám hiệu, các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa học này. - Các thầy, cô trong bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phùng Thanh Hương – người thầy kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình đã luôn bên cạnh động viên và ủng hộ tôi trong suốt khóa học. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Hải Yến MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ….…………………………………………………………………...1 Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo dược……………………………………………………………..…..3 1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược………………………………...……3 1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược……...…….4 1.2.1. Phương pháp hình thái……………………………………………………...4 1.2.2. Phương pháp vi học…………………………………………………...……5 1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học…………………………………………….6 Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược………………………………..………………………………..9 2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……………….….……9 2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)………..………..….10 2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)…..…………………………………...13 2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)……...…14 2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18 2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)……………………..…20 2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)…………………….22 2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)…………..25 2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)…………………………...…27 2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)…………………………....31 2.1.10.Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS) và multiplex-ARMS (MARMS)………………………………………………….33 2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN…………………..38 2.2.1 Vùng phiên mã nội (ITS)………………………………………….………40 2.2.2. Vùng trnH – psbA…………………………………………………………42 2.2.3. Maturase K (matK)…………………………………...……………………43 2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)……….44 2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược…………………45 2.3. Phương pháp ADN microarray…………………………………..………...…..47 2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid………….....…47 2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen……………...……………..…49 Chương 3. Bàn luận…………………………………………………………..……51 3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử…………………………………………………...….51 3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam……………………….56 KẾT LUẬN…………………………………………………………………...……59 ĐỀ XUẤT……………………………………………...…………………………..59 DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Bảng Tên Trang 1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29 2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học 55 phân tử để nhận diện thảo dược Hình 1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch 11 đại ngẫu nhiên – RAPD 2 Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia, 12 S. sophera, S. tora 3 Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP 16 4 Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS 18 5 Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, 19 ITS5 và được cắt bằng enzym giới hạn EaeI 6 Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản 21 SSR 7 Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR 23 8 Dấu vân tay ISSR của R. palmatum, R. officinale và R. 24 tanguticum sử dụng mồi UBC-811 9 Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 26 10 Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu 27 từ marker RAPD) 11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax 28 notoginseng 12 Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP 32 13 Sơ đồ vùng ITS và vị trí các mồi được sử dụng 34 14 Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel 35 của năm loài thuộc chi Citrus 15 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự 36 gen matK giữa năm loài thuộc chi Panax 16 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự 37 gen 18S rADN giữa năm loài thuộc chi Panax 17 Đơn vị lặp lại 18S – 26S của ADN ribosom 41 18 Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là 48 oligonucleotid hoặc gen để nhận diện thảo dược DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt A Adenine ADN 2’- deoxyribonucleic acid AFLP Amplified fragment Axít 2’- deoxyribonucleic length polyphorphism AP-PCR ARMS AS-PCR ATP-P33 Arbitrarily primed- Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại Polymerase Kĩ thuật PCR với mồi tùy chain reaction chọn Amplification refractory mutation Kĩ thuật khuếch đại hệ thống system đột biến bền vững Allele specific - Polymerase chain Kĩ thuật khuếch đại đặc trưng reaction cho allel Adenosine triphosphate phosphorus 33 BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò C Cytosine CAPS Cleaved amplified polymorphism Kĩ thuật sự đa hình các trình sequence tự khuếch đại được phân cắt CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DAF DNA amplification fingerprinting Kĩ thuật vân tay khuếch đại ADN DALP Direct amplification polymorphisms of length Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp DAMD Directed amplification of minisatellite - region DNA G Guanine IR Infrared ISSR Inter-simple Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh Vùng hồng ngoại sequence repeat Kĩ thuật sự đa hình trình tự polymorphism giữa các vùng lặp ITS Internal trancribed spacer Vùng phiên mã nội MARMS Multiplex amplification refractory mutation system matK Maturase K PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi rADN DNA ribosome ADN ribosom RAPD Random amplified polymorphic DNA Kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên rbcL Ribulose-bisphosphat carboxylase RFLP Restriction RP-PCR SCAR fragment length Kĩ thuật sự đa hình chiều dài polymorphism các đoạn giới hạn Random primed - Polymerase chain Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu reaction nhiên Sequence characterized amplified Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc regions trưng SNP Single-nucleotide polymorphism Sự đa hình đơn nucleotid SSCP Single Sự đa hình hình dạng sợi đơn strand conformation polymorphism SSR Simple sequence repeats Các trình tự lặp đơn giản T Thymine UV Ultraviolet Vùng tử ngoại WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng thảo dược để chữa bệnh. Trong vài thập kỉ gần đây, mặc dù thuốc có nguồn gốc hóa dược được ưa chuộng do có nhiều ưu điểm, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược vẫn có những đóng góp quan trọng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược để chăm sóc sức khỏe, đặc biệt là ở các nước đang phát triển [44]. Xu hướng sử dụng các thuốc này hiện nay ngày càng phát triển. Thị phần thảo dược của toàn thế giới đạt khoảng 60 tỉ đôla mỗi năm và con số này không ngừng tăng lên với tỉ lệ tăng 6,4% / năm [53]. Tuy nhiên, bên cạnh sự tăng lên về nhu cầu sử dụng thảo dược, một vấn đề nghiêm trọng xuất hiện trên thị trường dược phẩm là sự nhầm lẫn, giả mạo các vị thuốc một cách vô tình hoặc do cố ý. Việc sử dụng các thảo dược giả mạo có thể dẫn đến làm mất tác dụng điều trị và gây những hậu quả không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là tử vong. Do đó, việc nhận diện chính xác cây thuốc, vị thuốc là một bước quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Các thảo dược giả mạo có thể là các loài họ hàng gần của cây thuốc hoặc các loài từ các họ khác. Do đó, việc nhận diện thảo dược liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo. Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhận diện thảo dược. Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái tuy đơn giản nhưng lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và không thể nhận diện được thảo dược ở dạng đã sơ chế. Phương pháp vi học có thể khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái nhưng việc nhận diện lại không thể thực hiện được khi thảo dược ở dạng dịch chiết và khi phải tiến hành với số lượng lớn các mẫu. Các phương pháp dựa vào thành phần hóa học là một công cụ mạnh trong nhận diện thảo dược và hoàn toàn có thể thực hiện khi thảo dược ở dạng dịch chiết. Tuy nhiên, nhược điểm chung của các phương pháp hóa học là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây mà thành phần này lại thay đổi rất nhiều tùy theo môi trường, điều kiện thu hái 2 và bảo quản. Phương pháp nhận diện thảo dược nhờ sử dụng công cụ sinh học phân tử ra đời đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học. Phân tử ADN tương đối bền vững và ít bị ảnh hưởng bởi môi trường do đó phương pháp này đem lại một công cụ tiên tiến, chính xác và hiệu quả trong nhận diện thảo dược. Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước. Do đó, đề tài này được thực hiện với mục đích: - Tìm hiểu nguyên tắc của các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận diện thảo dược. - Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược. 3 Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo dược 1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo. Việc nhận diện thảo dược là một yêu cầu cấp thiết khi mà tình trạng giả mạo vẫn đang là một vấn đề nghiêm trọng tồn tại trên thị trường dược phẩm thế giới. Sự giả mạo có thể là do vô tình khi dùng nhầm lẫn các các thảo dược có tên hoặc kiểu hình tương tự nhau hoặc do người kinh doanh cố tình giả mạo nhằm thu được lợi nhuận cao hơn. Tuy nhiên, dù là nguyên nhân nào thì đều có thể dẫn đến hậu quả làm mất tác dụng điều trị và gây những tác dụng không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là dẫn đến tử vong. Tại Mỹ, Trung tâm chăm sóc sức khỏe California đã báo cáo về một trường hợp bị nhiễm độc do dùng Clematis chinensis bị lẫn với Podophyllum emodi. Trong Podiphyllum emodi có chứa podophyllotoxin là một hoạt chất có độc tính. Hậu quả trên bệnh nhân này là bệnh lý trên thần kinh ngoại biên theo bệnh nhân đến suốt đời [41]. Ở Bỉ, trong suốt giai đoạn 1990 - 1992, sự nhầm lẫn giữa một thảo dược có độc tính là Aristolochia fangchi dùng thay thế cho Stephania tetrandra đã làm cho hơn 100 phụ nữ bị suy thận [13]. Năm 2004, ở Hồng Kông có một báo cáo về độc tính do dùng thảo dược mà nguyên nhân là do sự nhầm lẫn một thảo dược được kê trong đơn. Bệnh nhân đã được kê Aristolochia mollissima thay vì Solanum lytatum. Trên thực tế, hai loại thuốc này có nguồn gốc và tác dụng dược lý khác nhau, điểm chung duy nhất là cùng có tên thông dụng là “Baimaoteng”. Sự nhầm lẫn này đã dẫn đến hậu quả làm suy giảm chức năng thận và ung thư đường tiết niệu trên bệnh nhân [81]. Bên cạnh đó, năm 2004, ở Mỹ và các nước châu Âu như Hà Lan, Pháp, Tây Ban Nha, các báo cáo về tình trạng ngộ độc ở trẻ em sau khi dùng một loại trà có nguồn gốc từ Illicium verum không ngừng được tăng lên. Những trẻ bị ngộ độc thấy xuất hiện tình trạng co giật, buồn nôn, bồn chồn, nhãn cầu chuyển động nhanh. Nguyên 4 nhân được xác định là do Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium verum khi sản xuất loại trà này [63]. Do những tác dụng không mong muốn nêu trên nên việc nhận diện chính xác thảo dược đã và đang là một yêu cầu cấp thiết. Có nhiều phương pháp đã được sử dụng trong nhận diện thảo dược từ đơn giản đến phức tạp, từ các phương pháp truyền thống đến các phương pháp hiện đại. Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng, tiếp đó là phương pháp vi học, phương pháp phân tích hóa học và phương pháp dựa vào công cụ sinh học phân tử. 1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược 1.2.1. Phương pháp hình thái Phương pháp hình thái là phương pháp dựa vào các đặc điểm hình thái tổng quát để nhận diện cây thuốc và các bộ phận của nó. Phương pháp truyền thống yêu cầu sử dụng hầu hết các giác quan (quan sát, sờ nắn, nếm, ngửi) để nhận biết một dược liệu [81]. Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng trong nhận diện thảo dược và cho đến nay vẫn đang được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Đối với một cây thuốc, các đặc điểm dùng để định danh bao gồm các đặc điểm như: cây gỗ hay cây thảo, kích thước, hình dạng lá (ví dụ như mép lá có răng cưa hay gợn sóng, lá chia thùy hay không chia thùy), đặc điểm cụm hoa (như dạng chùm, bông, tán), đặc điểm hình thái học thực vật (như dạng bầu trên, bầu dưới hay bầu giữa, hình dạng và số lượng nhị, số lượng lá noãn trong mỗi bầu và số lượng hạt trong mỗi lá noãn) và đặc điểm của rễ bao gồm cấu trúc rễ và dạng rễ (như rễ chùm, thân rễ hay thân hành) [63]. Đối với một dược liệu từ thực vật, những căn cứ quan trọng để nhận diện là dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc và đặc điểm về mùi vị [81]. Ví dụ như để nhận diện được rễ của loài Ligusticum chuanxiong, Dược điển Trung Quốc 10 đã sử dụng các đặc điểm hình thái, màu sắc, mùi vị để mô tả như sau: rễ có các mấu không đều, đường kính 2 – 7 cm, bên ngoài có màu vàng nâu, thô ráp và khô lại, với 5 nhiều vòng giống nhau và lớn dần, có các vết lõm, mùi thơm, vị đắng, cay, để lại cảm giác tê nóng sau đó thì hơi ngọt [69]. Bên cạnh cách thức mô tả như trong Dược điển, còn có nhiều cách mô tả trong đời thường như thân rễ Polygonati như đầu gà trống, rễ Codonopsis pilosulae như đầu sư tử, thân rễ Coptidis như cựa gà… Đây là những cách mô tả rất sinh động giúp dễ dàng nhận diện được vị dược liệu quan tâm [81]. Phương pháp nhận diện thảo dược dựa vào hình thái là phương pháp đơn giản nhất, nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, nó phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và khó phân biệt các cây thuốc có quan hệ họ hàng gần như các cây cùng một chi hay họ có hình thái bên ngoài tương tự nhau [81]. Bên cạnh đó, việc nhận biết thảo dược ở dạng bột bằng phương pháp hình thái là không thể thực hiện được. Phương pháp vi học ra đời có thể giúp khắc phục được nhược điểm này. 1.2.2. Phương pháp vi học Phương pháp vi học liên quan đến việc sử dụng kính hiển vi để nghiên cứu cấu trúc đặc điểm bên trong cây thuốc và đặc điểm tế bào. Khi thảo dược ở dạng chế biến hoặc dạng khô, đặc điểm hình thái bị thay đổi. Phương pháp vi học thích hợp cho việc nhận diện thảo dược trong quá trình chế biến như dạng nguyên liệu đã bị cắt chẻ hoặc ở dạng bột. Nó cũng rất có ích trong việc nhận diện các loài có kiểu hình tương tự nhau [81]. Một ví dụ sử dụng phương pháp vi học để nhận diện thảo dược là trường hợp ở loài Illicium verum. Quả của Illicium verum có tác dụng trừ hàn, kích thích tiêu hóa, giảm khó tiêu. Ở Mỹ và các nước phương Tây, loại thuốc này được sử dụng dành cho trẻ em ở dạng trà gói để chữa đau bụng. Tuy nhiên, một số lượng lớn trẻ sơ sinh sau khi sử dụng loại trà này xuất hiện triệu chứng thần kinh kích thích do Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium verum. Illicium anisatum chứa các sesquiterpenes có độc tính như anisatin, neoanisatin, và 2-oxyneoanisatin sẽ gây 6 ngộ độc cho người sử dụng. Hai loài này có thể phân biệt với nhau qua hình dạng, màu sắc, vị, mùi, số lượng nang. Tuy nhiên, rất khó để phân biệt chúng khi ở dạng bột. Phương pháp vi học đã được sử dụng để phân biệt hai loài này. Dưới ánh sáng huỳnh quang, hai loài bộc lộ sự khác nhau về đặc điểm tế bào ở vỏ quả ngoài nang. Nang của Illicium verum có các tế bào hình đa giác với lớp màng ngoài có vằn, kích thước thay đổi chiều dài từ 250 – 300 µm và chiều rộng 100 µm, có màu nâu xanh dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước sóng 330 – 380 µm. Trái lại, nang của Illicium anisatum có thành mỏng hơn. Tế bào lớp ngoài của nang có chiều dài từ 15 – 20 µm, có hình trứng hoặc hình thuôn và khác nhau đáng kể về kích thước, chúng có màu xanh vàng nhẹ dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước sóng 330 – 380 µm. Sự khác nhau này là đặc điểm rất quan trọng để nhận biết được hai loài Illicium verum và Illicium anisatum [63]. Phương pháp vi học là phương pháp rất thông dụng để nhận diện thảo dược. Nó có mặt trong Dược điển của nhiều nước như Dược điển Anh, Dược điển thảo dược Mỹ, Dược điển Nhật Bản, Dược điển thảo dược Hàn Quốc… Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái là có thể xác định thảo dược đã được chế biến hoặc ở dạng bột. Tuy nhiên, nó cũng có nhược điểm là không thể xác định chính xác các loài của một hỗn hợp có quá nhiều thành phần, đồng thời nó không thể giúp phân biệt loài khi ở dạng dịch chiết [81]. Phương pháp phân tích hóa học có thể giúp giải quyết được các khó khăn này. 1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học Phương pháp phân tích hóa học là phương pháp căn cứ vào đặc điểm về thành phần hóa học của một dược liệu để xác định dược liệu đó. Các phương pháp phân tích hóa học thường được sử dụng là phương pháp sắc ký, phương pháp điện di và phương pháp quang phổ [81]. Phương pháp sắc ký được sử dụng để thu được dấu vân tay sắc ký của một thảo dược. Dấu vân tay sắc ký là sắc ký đồ của các hoạt chất và các thành phần hóa 7 học đặc trưng có trong dịch chiết của cây đó. Dựa vào dữ liệu của dấu vân tay sắc ký thu được có thể xác định được cây thuốc ngay cả khi lượng mẫu là khác nhau hoặc có thể xác định sự tương đồng hoặc khác biệt giữa các mẫu khác nhau. Tuy nhiên, dịch chiết của một cây thuốc chứa hàng trăm hoạt chất khác nhau. Một số hoạt chất lại tồn tại với tỉ lệ khác nhau trong các mẫu của cùng một loại thảo dược. Do vậy, điều quan trọng là cần phải chọn phương pháp sắc ký tin cậy để thể hiện thành phần hoạt chất và các thành phần hóa học đặc trưng trong cây thuốc [52]. Phương pháp điện di mao quản cũng được sử dụng trong nghiên cứu thảo dược do có khả năng tách tốt [31]. Dấu vân tay đặc trưng của Flos carthami [16] và Gingo biloba [71] đã được xây dựng để nhận diện hai loài này ở dạng thảo dược thô đồng thời giúp phân biệt với loài giả mạo, thay thế. Ngoài ra phương pháp sắc ký và điện di, phương pháp quang phổ cũng được sử dụng trong nhận diện thảo dược. Nguyên tắc chung của các kĩ thuật là sử dụng phương pháp thăm dò nghiên cứu quang phổ điển hình của toàn bộ các chất hóa học được chiết xuất từ mẫu quan tâm. Các phương pháp thường dùng là phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và phổ hồng ngoại (IR) [63]. Các kĩ thuật dựa trên phân tích thành phần hóa học của cây là những công cụ rất hữu ích trong nhận diện thực vật. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của các kĩ thuật này là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây, nhưng thành phần hóa học của cây chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi môi trường sống, vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Đồng thời, nó còn phụ thuộc vào quá trình thu hái và điều kiện bảo quản mẫu. Trong điều kiện bảo quản không tốt, mẫu có thể bị phân hủy làm biến đổi các thành phần hóa học trong đó, dẫn đến việc nhận diện là không thể [26]. Với sự phát triển của sinh học phân tử và di truyền học thực vật trong những năm gần đây, công cụ di truyền được xem như là một phương pháp đáng tin cậy trong nhận diện nguyên liệu có nguồn gốc thực vật ở cấp độ ADN. Phương pháp này tỏ ra chính xác, thuận tiện, đặc hiệu và ổn định. Hơn nữa, một lượng nhỏ mẫu là 8 đủ cho nghiên cứu ADN. Trái ngược với các dấu vân tay hóa học chịu ảnh hưởng nhiều bởi giai đoạn sinh trưởng, phát triển, điều kiện môi trường, điều kiện thu hái, làm khô và bảo quản, ADN là một đại phân tử tương đối bền vững, ít chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài, có thể thu được từ mẫu tươi, mẫu đã làm khô, thậm chí là cả ở mẫu đã qua chế biến. Bên cạnh đó, các ADN không đặc trưng cho mô nên có thể thăm dò ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào của cây [26]. Do đó, công cụ sinh học phân tử rất hữu ích và thích hợp cho nhận diện thảo dược. 9 Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược Trong sinh học phân tử, việc nhận diện thảo dược được thực hiện dựa vào các marker di truyền (hay các marker ADN). Marker ADN có thể được hiểu là đoạn ADN đặc trưng thể hiện sự khác biệt ở cấp độ bộ gen. Các marker này có thể thu được nhờ sử dụng các phương pháp như phương pháp PCR, phương pháp giải trình tự ADN và phương pháp ADN microarray [78]. 2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR) là một kĩ thuật cơ bản của sinh học phân tử. Đây là một phản ứng khuếch đại ADN ở bên ngoài cơ thể sống. Trước đây, để giải quyết những trở ngại về số lượng vật chất di truyền cần có, các kĩ thuật tạo dòng in vitro thường được sử dụng để tạo số lượng lớn vật chất di truyền. Tuy nhiên, kĩ thuật này đòi hỏi thao tác rất phức tạp và tốn rất nhiều thời gian. Kĩ thuật PCR ra đời đã khắc phục những khuyết điểm của phương pháp hiện có. Áp dụng kĩ thuật PCR cho phép làm tăng nhanh lượng vật chất di truyền trong thời gian ngắn [2]. Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một phản ứng chuỗi, trong đó một phân tử ADN được sử dụng để từ đó tạo ra hai bản sao, sau đó là bốn, tám…Sự nhân đôi liên tục được thực hiện nhờ enzym ADN polymerase [33]. Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch mới [2]. Trên cơ sở kĩ thuật PCR, bằng việc sử dụng các mồi khác nhau sẽ thu được các marker ADN khác nhau. Các mồi sử dụng có thể là mồi ngẫu nhiên, không yêu cầu thông tin trước về bộ gen hoặc các mồi đặc hiệu khuếch đại một vùng nhất định trên bộ gen mà thông tin về bộ gen cần được biết trước [26]. Sau bước khuếch đại 10 nhờ PCR sử dụng các mồi đặc trưng cho từng kĩ thuật, các sản phẩm thu được sẽ được điện di trên gel để thu được sản phẩm khuếch đại và đánh giá kích thước [78]. 2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR) Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Random-primed PCR – RP-PCR) là kĩ thuật mà trong đó phản ứng khuếch đại được xảy ra trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi thấp, sử dụng một hoặc hai mồi ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng PCR để tạo ra các đoạn ADN đặc trưng. Các mồi này sẽ gắn vào các vị trí ngẫu nhiên trên ADN khuôn để khuếch đại. Sự đa hình được đánh giá bằng sự có mặt hoặc không có mặt của một băng điện di nhất định [78]. Trong kĩ thuật RP-PCR bao gồm: kĩ thuật PCR với mồi tùy chọn (Arbitrarily primed-PCR – AP-PCR), kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA – RAPD) và kĩ thuật vân tay khuếch đại ADN (DNA amplification fingerprinting – DAF). Với các kĩ thuật khác nhau thì mồi được sử dụng có chiều dài khác nhau. Kĩ thuật DAF có tính nghiêm ngặt thấp nhất do sử dụng mồi có chiều dài 5 – 8 nucleotid, tiếp đó là RAPD sử dụng mồi có chiều dài 10 nucleotid, AP-PCR sử dụng mồi có chiều dài khoảng 20 nucleotid [78]. Kĩ thuật DAF do sử dụng các mồi ngắn nên mô hình các băng thu được là rất phức tạp [57]. Khi chiều dài của mồi tăng lên, số lượng vị trí gắn trên bộ gen mục tiêu giảm đi do giảm cơ hội tìm thấy các vị trí mục tiêu tương đồng hoặc gần tương đồng trên bộ gen [29]. Trong ba kĩ thuật trên, kĩ thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi nhất do sự sẵn có của mồi RAPD trên thị trường [55]. Mồi RAPD có chiều dài 10 nucleotid thường chứa hàm lượng GC từ 50% đến 80% vì trong quá trình lai ADN, nếu hàm lượng GC nhỏ hơn 50 % thì sẽ không chịu được nhiệt độ của quá trình tổng hợp chuỗi [19].
- Xem thêm -