Tài liệu Tổng quan về enzyme ngoại bào bacillus subtilis

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm LỜI MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ Babylon, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động xấu tới môi trường. II. Lý do chọn đề tài Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi khuẩn Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng rộng rãi ở qui mô công nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả năng sinh tổng hợp các enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại bào của những vi sinh vật khác. Ở nước ta, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngoại bào từ Bacillus subtilis đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu, các nhà máy - 1 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm sản xuất ở qui mô công nghiệp và đóng góp một phần lợi ích vào nền kinh tế quốc dân. III. Mục đích của đề tài Để tìm hiểu về một số vấn đề như:  Tổng quan về enzyme ngoại bào của vi sinh vật.  Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis.  Các điều kiện hoạt động của enzyme ngoại bào và quá trình sinh tổng hợp các enzyme này ở vi sinh vật.  Qui trình tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis.  Khả năng ứng dụng chúng vào đời sống cũng như sản xuất ở qui mô công nghiệp. Đó là những cơ sở và tính cấp thiết mà tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis”. IV. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn Bacillus subtilis. Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan về enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis. V. Phương pháp nghiên cứu Đọc tài liệu tham khảo các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về vi khuẩn Bacillus subtilis. Tổng hợp, phân tích các công trình nghiên cứu, các tài liệu khoa học về vi khuẩn Bacillus subtilis và một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn này nhằm giải quyết các mục đích đề ra. Đua ra kết luận và kiến nghị sau quá trình thực hiện đề tài. - 2 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT 1.1. Khái niệm enzyme ngoại bào 1.1.1. Định nghĩa Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các quá trình dị hóa ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Vì thực tế bên ngoài môi trường xung quanh, các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển qua màng tế bào nên cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng dị hóa các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có phân tử lượng thấp hơn có thể đi qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật. 1.1.2. Phân loại Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ:  Nhóm 1: Oxydroreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử.  Nhóm 2: Transpherase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.  Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia). - 3 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm  Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi.  Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.  Nhóm 6: Lygase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác. Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase. Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O Ví dụ: Tinh bột + H2O α-amylase R1OH + R2H Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và pectinase… 1.1.3. Đặc điểm - tính chất Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa:  Về bản chất enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một protein, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do phân tử lượng lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào .  Vì có bản chất là protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau: Kiềm Protein -COO- + H+ Protein -COOH Acid Acid Protein -NH+ + H+ Protein -NH2 Kiềm - 4 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm  Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác. Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrate. Lượng nước hydrate hóa khá lớn và có vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh hóa.  Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110oC như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefciens và Bacillus lichenniformis có thể chịu được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1…  Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme. Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+.  Là những enzyme chuyên biệt hóa cao có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu với cơ chất.  Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo qui luật cảm ứng cơ chất. Quá trình này xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn sử dụng được những chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành cơ chất có kích thước nhỏ hơn để có thể xâm nhập vào trong tế bào thông qua thành và màng tế bào. Như vậy, khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng - 5 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi là cơ chất cảm ứng.  Là những enzyme cảm ứng với cơ chất nên quá trình tổng hợp enzyme rất phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ. Cơ chất cảm ứng thường được coi là yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme. Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu cơ chất gây ra. Như vậy, muốn điều khiển và kiểm soát quá trình này cần phải chú ý hai điểm:  Thứ nhất, muốn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cảm ứng nào đó thì phải cho cơ chất mà enzyme đó có thể phân hủy vào môi trường, ví dụ: sinh tổng hợp amylase thì bổ sung vào môi trường tinh bột; protease thì bổ sung protein; pectinase thì bổ sung pectin và cellulase thì bổ sung cellulose…  Thứ hai, tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều lượng nhất định nào đó. Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm. Do đó, không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng cao.  Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau.  Enzyme có thể thực hiện một số phản ứng, các phản ứng này xảy ra ở ngoài tế bào. - 6 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm  Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn. Ví dụ: Trong quá trình thủy phân sucrose thành fructose và glucose  Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam.  Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Sucrose  Acid Fructose + Glucose Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Sucrose Saccharase Fructose + Glucose  Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một số phản ứng sinh hóa.  Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng.  Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme.  Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc độ của phản ứng.  Có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, trên môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ - 7 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất. 1.2. Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp. 1.2.1. Enzyme amylase Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho phản ứng phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: Phương trình phản ứng: R.R.’ + H – OH Amylase OH – RH + R’OH Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân). Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase (αdextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase hay γamylase). Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. - 8 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm 1.2.1.1. Đặc tính và cơ chế xúc tác của enzyme α-amylase (1,4-α-glucan glucanhydrolase) α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), acid glutamic (Glu) và acid aspartic (Asp). Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: α-amylase có ít methionine (Met) và có khoảng 7 - 10 gốc cysteine (Cys). Trọng lượng phân tử của α-amylase từ các nguồn khác nhau không giống nhau. Trọng lượng phân tử của α-amylase có nguồn gốc từ thực vật khoảng 45.000 - 60.000 Da, trong khi α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn 24.000 100.000 Da, từ nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knir, 1956; Fisher và Stein, 1960). α-amylase có chứa các nhóm -COOH và NH3 trong trung tâm hoạt động. α-amylase kết tủa trong dung dịch (NH4)2SO4 25 - 30%, α-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và tan trong ethanol loãng nhưng kết tủa ở ethanol 60%. Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH khoảng 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951). Giá trị pH tối ưu của α-amylase phụ thuộc vào nguồn enzyme, thường là ở vùng acid yếu, giữa 4,8 và 6,9. Tuy nhiên cũng có ngoại lệ, chẳng hạn như αamylase từ Bacillus acidocadarius có pH tối ưu là 3,5 còn của enzyme từ Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60 -70oC, nhưng cũng có thể tới 80 - 90oC đối với một số loại vi khuẩn chịu nhiệt. α-amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Trong mỗi phân tử αamylase đều có chứa 1 - 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca2+ còn có vai trò duy trì sự tồn tại và độ bền cực lớn của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử - 9 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Theo Wallerstein (1969), các ion Ca2+ có tác dụng ổn định hoạt tính của α-amylase nhưng chỉ có tác dụng ở nồng độ thấp. Với nồng độ ion Ca2+ 0,1 nguyên tử gam/lít sẽ có tác dụng làm giảm hằng số vận tốc vô hoạt K của malt đại mạch xuống 1500 lần trong điều kiện pH 4,0; còn đối với nấm mốc hằng số này chỉ giảm 13 lần. Khi nồng độ tăng quá 0,3 nguyên tử gam/lít tác dụng giảm rõ rệt. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Người ta cho rằng đặc tính này của α-amylase có liên quan tới hàm lượng Ca2+ trong phân tử (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa nhiều Ca2+ hơn nấm mốc khoảng 3 - 4 lần nên nó bền nhiệt hơn). Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ và các ion thuộc nhóm halogen có tác dụng bất hoạt α-amylase theo thứ tự Cl - < Br - < F - < I -. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+ và Sn2+ không ảnh hưởng lắm đến α-amylase. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của α-amylase Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không - 10 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn: Giai đoạn dextrin hóa Giai đoạn đường hóa Phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen Maltotetrose, maltotriose và maltose Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase  Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).  Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng αamylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1).  Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose.  Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin - 11 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó, khi enzyme này tác dụng lên tinh bột thì sẽ làm giảm nhanh độ nhớt của tinh bột. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của enzyme α-amylase:  Giai đoạn dextrin hóa: α-amylase Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp  Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra Trimaltose Di & monosaccharide Amylose Oligosacharide Poliglucose Maltose Maltotriose Maltotetrose 1.2.1.2. Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase (α-1,4 glucanmaltohydrolase) Enzyme β-amylase là enzyme có chứa gốc -SH đặc trưng. Nhiều nhà khoa học cho rằng có sự tham gia của nhóm imidazol và carboxyl trong trung tâm hoạt động của β-amylase. Nhóm carboxyl của enzyme sẽ tương tác với C1 của glucoside tạo ra phức trung gian đồng hóa trị kiểu ester axcetal. Ester này tiếp đó sẽ bị phân giải do tác dụng của một phân tử nước lên nhóm carboxyl để giải phóng ra β-maltose và nhóm carboxyl của enzyme lại được phục hồi. Phân tử β-amylase chỉ gồm một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử 60.000 Da. Enzyme β-amylase có pH hoạt động tối ưu giữa 5 và 6, β-amylase khá bền trong môi trường acid ở pH = 3 - 4, nhiệt độ tố ưu là 50 - 65oC. β-amylase bị - 12 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm bất hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ ở nhiệt độ 70oC. Thường β-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn β-amylase có nguồn gốc từ thực vật. β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên vẹn, chỉ tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca+2. Hình 1.3. Cấu trúc không gian của β-amylase Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylase là một enzyme đường hóa, phân cắt được các liên kết α-1,4 glucoside trong phân tử amylose cũng như trong amylopectin, bắt đầu từ bên ngoài đầu không khử giải phóng maltose dưới dạng β. Tác dụng của enzyme này sẽ bị dừng lại khi gặp liên kết α-1,6. Enzyme βamylase thủy phân hoàn toàn amylose, ngược lại nó chỉ thủy phân được 54 - 58% amylopectin thành β-amylose. Phần amylopectin còn lại là một β-dextrin giới hạn có khối lượng phân tử cao và có chứa toàn bộ các liên kết α-1,6 của phân tử ban đầu. Quá trình này xảy ra ở phần thẳng của mạch và dừng lại ở vị trí phân nhánh.  Enzyme β-amylase có thể thủy phân lần lượt nhiều liên kết glucoside của cùng một chuỗi trước khi được giải phóng trở lại vào môi trường. Số lần tác dụng trên một chuỗi α-glucan phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi, thường là 4 lần đối với chuỗi ngắn và nhiều lần đối với chuỗi dài.  Theo phương pháp sản xuất truyền thống β-amylase được thu nhận từ malt, tuy nhiên ở các nước phương Đông nó có thể được thu nhận từ đậu tương hoặc khoai lang. Các loại thực vật nói trên không chỉ chứa β-amylase mà - 13 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm còn chứa cả α-amylase. Điều kiện thích hợp của β-amylase malt đại mạch là 60 65oC, pH 5,4 - 5,6 (trong dung dịch tinh bột). Vùng pH thích hợp cho β-amylase hoạt động hẹp hơn so với α-amylase. Trước đây, β-amylase được coi là nguồn enzyme chỉ có trong hệ thực vật. Ngày nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra loại enzyme này và ứng dụng vào sản xuất. Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp β-amylase là Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Streptomyces sp. và Pseudomonas. Đặc biệt là Bacillus cereus và mycoides có thể đồng thời tạo ra cả pullulanase. 1.2.1.3. Đặc tính và cơ chế xúc tác của glucoamylase (α-1,4 glucanglucohydrolase) Cũng giống như các enzyme khác, glucoamylase từ các nguồn gốc khác nhau có những đặc tính, cấu tạo và tính chất khác nhau. Khối lượng phân tử của chúng thường nằm giữa 27.000 và 112.000 Da. Nói chung khối lượng phân tử glucoamylase của nấm mốc lớn hơn so với nấm mem. Theo Pazur (1959) khối lượng phân tử của glucoamylase từ Aspergillus awamori là 62.000 Da. Trong khi đó khối lượng phân tử của glucoamylase từ Endomycopsis sp. 20-9 là 53.000 Da (Gratrova và Sadova, 1959) và từ Endomycopsis sp. IFO.011 là 55.000 Da. Trong cấu tạo phân tử của các glucoamylase đều chứa gốc Met, Trp và một nửa gốc Cys trong trung tâm hoạt động. Các glucoamylase của nấm mốc là những glucoprotein chứa từ 5 đến 20% glucid cao phân tử của glucose, manose và glucosamin. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ Aspergillus niger là 6,5; từ Aspergillus awamori là 7,5; Rhizopus delemar là 7,4; Endomyces sp.IFO.0111 là 4,8 - 5,5. - 14 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm Hình 1.4. Cấu trúc không gian của glucoamylase Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Vì thế, các nhà nghiên cứu Nhật Bản (Ono và cộng sự, 1961) đề nghị đặt một tên phân loại khác cho nó là α-1,4:1,6 glucan-4:6-glucohydrolase. Nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ đề nghị này (Dobrolinxkai, 1965; Fenikxova và Ruza-kova, 1976). Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách lần đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katitara và Kurushima, 1966). Sau đó nó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae rồi ở các nhóm vi sinh vật khác. Enzyme này còn có nhiều tên gọi khác nhau như: amyloglucosidase, taka-amylase Bac, -amylse, matulase,… Glucoamylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside (Sawasaki 1960; Ueyama và cộng sự, 1965; Watanabe và Fukimbara, 1965, 1966). Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomaltose và maltose thành glucose (Azarova, 1981; Jerebtxov và Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia và Rodzevits, 1974; Logina Karpukhina, 1978). Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh như amylopectin, - 15 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm glucogen, -dextrin) bị glucoamylase thủy phân với tốc độ khá nhanh. Khi thủy phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy các polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn các cơ chất phân tử thấp. Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”. Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 - 5,5; nhiệt độ tối ưu là 40 - 60oC. So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid và khi có mặt các oligosaccharide trong môi trường sẽ làm cho enzyme bền hơn, nhưng kém bền dưới tác dụng của rượu ethylic, aceton và không được bảo vệ khi có mặt Ca2+ mà sẽ bị Ca2+ ức chế enzyme và làm cho enzyme dễ dàng biến tính. Glucoamylase thường tồn tại ở 2 hoặc 3 dạng đồng phân, trong đó đồng phân AM-1 (HM), AM-2 (LM) có phân tử lượng tương ứng là 82.000 và 70.000 Da. Dạng đồng phân HM cắt mạch nhánh mạnh hơn dạng LM. Cơ chế tác dụng của glucoamylase cũng như cơ chế tác dụng của enzyme amylase khác. Việc phân cắt liên kết glucoside được tiến hành thông qua việc tạo thành một hợp chất Oxycacbonium trung gian, tiếp theo là sự nghịch đảo cấu hình của carbon C1 của phân tử glucose được giải phóng ra. Các nhóm Tyr, Trp, Histidine (His) và amin có vai trò gắn cơ chất vào, còn các nhóm -COOH và COO- thì tham gia vào quá trình xúc tác hóa học. Việc thủy phân các liên kết α1,4 và α-1,6 một cách không phân biệt của enzyme là do các nhóm thực hiện việc gắn cơ chất không phải do các nhóm tham gia vào quá trình xúc tác hóa học. Khi nghiên cứu các cơ chế của quá trình thủy phân một số oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Barker và cộng sự (1957) thấy rằng quá thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế đa mạch. Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzyme glucoamylase như sau: Glucoamylase kiểu Rhizopus delemar Tinh bột hay oligosaccharide 100% glucose (có liên kết α-1,4 và α-1,6 ) Glucoamylase kiểu Aspergillus niger Tinh bột hay oligosaccharide 80 - 85% glucose + Oligosaccharide khác nhau - 16 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm 1.2.1.4. Đặc tính và cơ chế xúc tác của pullulanase (α-dextrin 6glucosidase) Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glycogen, pululan và các dextrin. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme. Đặc biệt sự có mặt của hai liên kết α1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên kết này. Do đó pullulan chính là cơ chất lý tưởng của pullulanase, vì nó là một phân tử không phân nhánh cấu tạo bởi những đơn vị maltotriose (có hai liên kết α-1,4) liên kết với nhau bằng cầu nối α-,6 glucoside. Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-amylase và pullulanase làm dextrin này bị thủy phân hoàn toàn. Pullulanase có pH tối ưu là 5 - 7, nhiệt độ tối ưu là 10 – 50oC. Ion Ca2+ hoạt hóa các enzyme này, trong khi đó các ion Hg2+, Zn2+, Cu2+, Ag2+ và Co2+ lại có tác dụng kìm hãm. Hình 1.5. Cấu trúc không gian của enzyme pullulanase 1.2.1.5. Đặc tính và cơ chế xúc tác của oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6-glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở vi sinh vật đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy - 17 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm mầm). Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase hay R-enzyme và dextrin-1,6-glucoside hay amylo-1,6-glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase. Hai loại enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các dextrinase là 40oC và pH tối ưu là 5,1. Theo số liệu của Kirxanov và Pankratov (1969), hoạt tính của enzyme này từ Rhizopus delemar được bảo vệ ở điều kiện nhiệt độ 30oC; pH 5,0 - 6,0 sau 96 giờ. Cũng ở pH này hoạt tính của enzyme này sẽ giảm 15% khi tăng nhiệt độ lên tới 50oC sau 2 giờ. Hình 1.6. Cấu trúc không gian của oligo-1,6-glucosidase 1.2.1.6. Đặc tính và cơ chế xúc tác của transglucosidase Ở nhiều loài nấm sợi Aspergillus, enzyme transglucosidase luôn luôn tương tác với glucoamylase. Transglucosidase có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân. Vì thế sự có mặt của transglucosidase trong dung dịch thường gây nên sự nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase thực hiện việc chuyển gốc glucosyl sang các nhóm mono, di và oligosaccharide, xúc tác tạo thành liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside. Pazur (1961) đã tách được enzyme này từ Aspergillus niger bằng phương pháp sắc ký hấp phụ trên DEAE - cellulose và cho biết cơ chế tác dụng của nó. Transglucosidase không những chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izotriose và panose; tức là có - 18 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết α-1,6 để tạo thành panose hoặc izomaltose. Rodzevit và Butova (1965) đã tìm thấy trong canh trường nuôi cấy nấm sợi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và Aspergillus awamori có enzyme transglucosidase, đồng thời cho biết enzyme này xúc tác sự tổng hợp các oligosaccharide với các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ maltose. Các tác giả cho rằng, trong các vi sinh vật trên có hai hệ enzyme transglucosidase. Một hệ tổng hợp các sản phẩm có liên kết α-1,4 glucoside kiểu maltose và chuyển các gốc glucose từ maltose tới vị trí C4 của gốc glucose cuối: n-maltose-(1,4-αglucose)n + n-glucose. Một hệ chuyển các gốc glucose có vị trí C6 khi tổng hợp các kiểu sản phẩm isomaltose: n-maltose-(1,6-glucose)n + n-glucose. Hệ thứ nhất bền ở pH 8,5 còn hệ thứ hai thì bất hoạt hoàn toàn ở pH này trong 2 giờ. Còn ở pH 3,3 trong thời gian 1 giờ thì hoạt tính transglucosidase của cả hai hệ đều không thay đổi. Transglucosidase của nấm sợi bị bất hoạt hoàn toàn ở pH = 1,9 2,0 sau 24 giờ. Ở các chủng nấm sợi khác nhau thì có khác biệt về hoạt tính transglucosidase (Buger, 1956), các loài Rhizopus có ưu thế hơn các loài Aspergillus là không tạo transglucosidase. Sự có mặt của transglucosidase trong các chế phẩm amylase (dùng trong công nghiệp sản xuất mật tinh bột, đường glucose và công nghiệp sản xuất rượu...) là điều không mong muốn. Glucoamylase xúc tác sự thủy phân tinh bột, còn transglucosidase lại tổng hợp các isosaccharide từ các sản phẩm thủy phân này, do đó làm giảm mức độ thủy phân sâu sắc tinh bột và làm cho dịch thủy phân có vị đắng. - 19 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm Hình 1.7. Quá trình thủy phân tinh bột dưới sự xúc tác của một số loại enzyme amylase 1.2.2. Enzyme protease Nhóm enzyme protease (peptide - hydrolase E.C.3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Hình 1.8. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân protein - 20 -