Tài liệu Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất alkyl hóa của N- Methyl - asimilobin

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CẤN THỊ QUỲNH LIÊN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT ALKYL HÓA CỦA N-METHYL-ASIMILOBIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CẤN THỊ QUỲNH LIÊN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT ALKYL HÓA CỦA N-METHYL-ASIMILOBIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hải DS. Đặng Vũ Thanh Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, Trưởng Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội; TS. Nguyễn Văn Hải, Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội; DS. Đặng Vũ Thanh Tùng - những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy ThS. Nguyễn Văn Giang đã cho tôi nhiều ý kiến trao đổi khoa học và nhận xét bổ ích trong quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành được đề tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn ở bên, giúp đỡ và là nguồn động viên to lớn giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Cấn Thị Quỳnh Liên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................... 3 1.1. Cây sen .................................................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm thực vật ...................................................................................3 1.1.2. Thành phần hóa học ................................................................................3 1.1.3. Công dụng ...............................................................................................4 1.2. Nuciferin (I) ..........................................................................................................4 1.2.1. Công thức, tính chất lý hóa .....................................................................4 1.2.2. Tác dụng dược lý ....................................................................................5 1.2.3. Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu ....6 1.3. N-methyl-asimilobin (II).......................................................................................9 1.3.1. Công thức, tính chất ................................................................................9 1.3.2. Tác dụng dược lý ....................................................................................9 1.3.3. Phương pháp demethyl hóa nuciferin tạo N-methyl-asimilobin...........10 1.4. Muối amoni bậc 4 - sản phẩm của phản ứng N-alkyl hóa ..................................12 1.4.1. Tổng quan về các phương pháp N-alkyl hóa tạo muối amoni bậc 4 ....12 1.4.2. Tác dụng sinh học .................................................................................14 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................15 2.1. Nguyên vật liệu ...................................................................................................15 2.2. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................16 2.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................17 2.3.1. Chiết nuciferin từ lá sen ........................................................................17 2.3.2. Demethyl hóa nuciferin ........................................................................17 2.3.3. N-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin đã thu được bằng tác nhân 2-cloroethanol .....................................................................................................17 2.3.4. Thử tác dụng sinh học ...........................................................................18 2.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................18 2.4.1. Chiết và phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen .....................................18 2.4.2. Bán tổng hợp dẫn chất từ nuciferin.......................................................18 2.4.3. Xác định cấu trúc sản phẩm ..................................................................19 2.4.4. Thử tác dụng sinh học ...........................................................................19 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIÊM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................. 21 3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen ...............................................21 3.1.1. Quy trình chiết nuciferin .......................................................................21 3.1.2. Tinh chế nuciferin. ................................................................................21 3.2. Bán tổng hợp N-methyl-asimilobin bằng phản ứng demethyl hóa nuciferin .....22 3.2.1. Nguyên lý phản ứng ..............................................................................22 3.2.2. Quy trình phản ứng ...............................................................................22 3.2.3. Khảo sát ................................................................................................ 23 3.2.4. Kết quả: .................................................................................................24 3.3. Tổng hợp N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (III) và N,O-di(2hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (IV) bằng phản ứng N-alkyl hóa Nmethyl-asimilobin ............................................................................................... 25 3.3.1. Nguyên lý phản ứng: ............................................................................25 3.3.2. Lựa chọn thời gian và dung môi phản ứng ...........................................25 3.3.3. Đề xuất quy trình phản ứng ..................................................................29 3.3.4. Kết quả ..................................................................................................30 3.4. Kết quả phân tích cấu trúc của các dẫn chất N-alkyl của N-methyl-asimilobin.31 3.4.1. Xác định cấu trúc sản phẩm N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid ...............................................................................................................31 3.4.2. Xác định cấu trúc sản phẩm N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid ................................................................................................ 32 3.5. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi của 2 dẫn chất N-alkyl hóa của Nmethyl-asimilobin ............................................................................................... 34 3.5.1. Thiết bị nghiên cứu ...............................................................................34 3.5.2. Dòng tế bào ...........................................................................................34 3.5.3. Phương pháp thử độc tế bào .................................................................34 3.5.4. Kết quả ..................................................................................................34 3.6. Bàn luận ..............................................................................................................35 3.6.1. Về quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin ........................35 3.6.2. Về các phản ứng bán tổng hợp .............................................................36 3.6.3. Về xác định cấu trúc sản phẩm .............................................................39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ac2O Anhydrid acetic ATCC American Type Culture Collection DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMF Dimethylformamid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EC 2-Cloroethanol ESI-MS Phổ khối lượng phun m điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) EtOH Ethanol EtSNa Natri thioethoxid FBS Huyết thanh phôi bò 1 H-NMR IC50 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Nồng độ ức chế tối đa một nửa (The half maximal inhibitory concentration) IR IUPAC Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) Hiệp hội Hóa học Quốc tế thuần túy và ứng dụng (International Union of Pure and Applied Chemistry) MeOH Methanol MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2 yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromid OD Mật độ quang SKLM Sắc ký lớp mỏng SN2 Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (Nucleophilic Substitution) SOD Superoxid tonc Nhiệt độ nóng chảy DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây sen………………………………………………………… 3 Hình 1.2 Công thức một số alkaloid chính trong lá sen............................ 4 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của nuciferin (I)……………………………. 4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của N-methyl-asimilobin (II)…………….. 9 Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF…………………………………………………………… 10 Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48% …... 10 Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac2O…….. 11 Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng didemethyl hóa nuciferin sử dụng AlBr3 trong acetonitril………………………………………………........... 12 Cơ chế của phản ứng Menshutkin ………………...................... 12 Hình 1.10 Sơ đồ phản ứng của Nerinckx và cộng sự……........................... 12 Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng của Colona và cộng sự……………………….. 13 Hình 1.12 Sơ đồ phản ứng của James Brunelle và cộng sự………………. 13 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48%...................... 22 Hình 3.2 Sơ đồ dụng cụ của phản ứng demethyl hóa……………………. 23 Hình 3.3 Nguyên lý của phản ứng N-alkyl hóa sử dụng tác nhân Hình 1.9 2-cloroethanol………………………….………………………. Hình 3.4 Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng N-alkyl hóa N-methyl-asimilobin…………………………………………. Hình 3.5 30 Cơ chế của phản ứng O-demethyl hóa nuciferin với tác nhân HBr 48%................................................................................... Hình 3.6 25 36 Cấu trúc sản phẩm phụ của phản ứng O-demethyl hóa nuciferin………………………………………………………. 37 Hình 3.7 Cơ chế của phản ứng N-alkyl hóa N-methyl-asimilobin …….. 38 Hình 3.8 Cấu trúc sản phẩm phụ của phản ứng N-alkyl hóa……………. 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số alkaloid trong lá sen……………………………………... 4 Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm….. 15 Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm…... Bảng 3.1 Khảo sát lượng HBr 48% ảnh hưởng đến hiệu suất bán tổng hợp N-methyl-asimilobin ……………………………………………. Bảng 3.2 28 Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của N-(2hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid……………………. Bảng 3.6 28 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của phản ứng N-alkyl hóa…………………………………………… Bảng 3.5 27 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng N-alkyl hóa được thực hiện trong dung môi acetonitril…………………. Bảng 3.4 24 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng N-alkyl hóa được thực hiện trong dung môi DMF………………………. Bảng 3.3 16 30 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của N-(2hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (1H-NMR, 500 MHz, MeOD)…………………………………………………………... 32 Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của N,Odi(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid……………….. Bảng 3.8 33 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của N,Odi(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (1H-NMR, 500 Bảng 3.9 MHz, D2O)……………………………………………………… 33 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LU-1……. 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến. Sự phát triển nhanh chóng các thuốc từ cây cỏ không chỉ nhằm tăng cường tự điều trị, giảm lo lắng về các tác dụng bất lợi của chế phẩm hóa dược mà còn nâng cao nhận thức của cộng đồng về vai trò của thuốc từ dược liệu trong điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thông thường [7]. Hiện nay, các công ty đa quốc gia đang có xu hướng phát triển các dược phẩm chứa một hoạt chất từ cây thuốc (tinh chất dược liệu) do các chế phẩm này có giá trị kinh tế lớn hơn nhiều so với các sản phẩm chứa cao thuốc (extracts) hoặc hợp chất toàn phần chưa xác định được trong các công thức cổ truyền, kinh điển [7]. Với lợi thế là một trong những quốc gia có nguồn dược liệu phong phú, đa dạng làm thuốc cùng những bài thuốc y học cổ truyền đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc phòng và điều trị bệnh, việc phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu dần trở thành thế mạnh của ngành dược Việt Nam. Trong rất nhiều loại dược liệu có ứng dụng trong điều trị phải kể đến Sen - một loài cây rất quen thuộc với người Việt với nhiều bộ phận ( hạt, lá, củ…) có tác dụng chữa bệnh rất tốt. Ngó sen có tác dụng cầm máu, hạt sen là thuốc bổ, chữa di tinh, mất ngủ, suy nhược thần kinh. Gương sen, lá sen có tác dụng chữa huyết ứ, băng huyết, tiểu tiện ra máu…[3]. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của sen. Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7 - 0,8%, với nuciferin là alkaloid chính. Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra được rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các bộ phận cây sen cũng như của nuciferin, điển hình như tác dụng chống ung thư [30], chống HIV [34], chống tăng lipid máu [30], hay có tác dụng chống oxy hóa mạnh [29]. Gần đây, ở Trung Quốc đã sản xuất nuciferin dưới dạng tinh khiết để bào chế thuốc và thực phẩm chức năng. Nhiều sản phẩm chứa nuciferin của Trung Quốc được sử dụng để chống béo phì, làm giảm trọng lượng cơ thể. Ở Việt Nam đã có nhiều loại thuốc được sản xuất từ cao tâm sen và cao lá sen nhưng chưa có cơ sở 2 nào sản xuất alkaloid tinh khiết của lá sen - nuciferin, bên cạnh đó việc nghiên cứu, bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh còn hạn chế. Để góp phần vào việc nghiên cứu các dẫn chất của nuciferin, cụ thể là N-methyl-asimilobin và các dẫn chất alkyl hóa của nó, trên cơ sở học tập, kế thừa và ứng dụng các nghiên cứu đã có trong và ngoài nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất alkyl hóa của Nmethyl-asimilobin”. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau:  Chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin tinh khiết từ dược liệu.  Demethyl hóa nuciferin tạo N-methyl-asimilobin.  Tổng hợp các dẫn chất alkyl hóa của N-methyl-asimilobin.  Thử tác dụng sinh học các dẫn chất alkyl hóa của N-methylasimilobin thu được. 3 CHƢƠNG 1. 1.1. TỔNG QUAN Cây sen 1.1.1. Đặc điểm thực vật  Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn, họ Sen - Nelumbonaceae [3].  Đặc điểm: Sen là một loại cây mọc dưới nước, thân rễ hình trụ, mọc trong bùn, lá mọc lên khỏi mặt nước, Hình 1.1: Cây sen cuống lá dài, có gai nhỏ, phiến lá hình khiên, có gân tỏa tròn. Hoa to màu trắng hay đỏ hồng, đều lưỡng tính. Đài 3 - 5, màu lục. Tràng gồm rất nhiều cánh màu hồng hay trắng một phần, những cánh ngoài có màu lục như lá đài. Nhị nhiều, bao phấn 2 ô, nứt theo 1 kẽ dọc. Noãn rời nhau. Quả chứa 1 hạt, không nội nhũ. Hai lá mầm dày [3].  Phân bố, thu hái: Sen được trồng ở nhiều nơi trong nước ta để ăn và d ng làm thuốc. Mùa thu hái vào các tháng 7 - 9 [3]. 1.1.2. Thành phần hóa học Lá sen - hà diệp có chứa nhiều alkaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc : nuciferin, N-nornuciferin, anonalin, roemetin, armepavin, N-methyl coclaurin, Nmethyl lizococlaurin, pronuciferin, liriodenin, dehydro nuciferin, spermatheridin, dehydro-roemetin, nelumboxit. Trong đó nuciferin là alkaloid chính [3]. Liên tâm cũng chứa nhiều alkaloid như: liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, methylcoryparin, nuciferin, pronuciferin [3]. 4 Công thức hóa học của một số alkaloid chính trong lá sen (Hình 1.2 và Bảng 1.1): Bảng 1.1: Một số alkaloid chính trong lá sen Tên Alkaloid R1 R2 R3 Nuciferin CH3 CH3 CH3 N-nor-nuciferin CH3 CH3 H O-nor-nuciferin H CH3 CH3 Roemetin -CH2- CH3 Anonaine -CH2- H Hình 1.2: Công thức một số alkaloid chính trong lá sen 1.1.3. Công dụng Tâm sen: Dùng chữa tim hồi hộp, mất ngủ, di mộng tinh. Ngày uống 4-10 g tâm sen khô dưới dạng thuốc sắc hay thuốc pha. Ngoài ra, tâm sen có tác dụng thanh tâm khứ nhiệt, dùng chữa tâm phiền, thổ huyết. Lá sen: có tác dụng tiêu ứ, cầm máu, dùng chữa bệnh đi đại tiện ra máu, băng đới, băng huyết, nôn ra máu [3]. 1.2. Nuciferin (I) 1.2.1. Công thức, tính chất lý hóa  Cấu trúc hóa học: Hình 1.3  Công thức phân tử: C19H21NO2.  Khối lượng phân tử: 295,2 đvC. Hình 1.3: Công thức cấu tạo của nuciferin (I) 5  Danh pháp: 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-dimethoxy-6-methyldiabenzo quinolin (IUPAC) [2,8]; hoặc 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4Hdibenzo [de,g]quinolin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo [de,g] quinolin; (+-)-1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin; 1,2-dimethoxy-6-methylaporphin [10].  Tính chất lí - hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu trắng ánh xanh, không mùi, không vị, tan tốt trong cloroform, methanol, ethanol nóng, hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165oC, Phổ UV (đo trong methanol) cho λmax tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [5]. 1.2.2. Tác dụng dược lý  Tác dụng trên hệ thần kinh, cơ: Nuciferin có tác dụng giãn co thắt cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic. Nuciferin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác - vận động và thể lưới thân não trên chuột thí nghiệm, có tác dụng an thần và kéo dài giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thí nghiệm [2].  Tác dụng tăng tiết insulin: Nuciferin có tác dụng kích thích tiểu đảo tụy tiết insulin, chống bệnh đái tháo đường theo cơ chế đóng các kênh K+- ATPase. Nuciferin kích thích tiết insulin ở cả nồng độ 3,3 và 16,7 mM. So với glibenclamide, nuciferin có tác dụng mạnh hơn và ít độc tế bào hơn [27].  Tác dụng chống HIV: Theo Yoshiki Hashiwada và cộng sự, nuciferin và một số alkaloid có trong dịch chiết lá sen trong cồn 95% có tác dụng kháng HIV. Trong đó nồng độ 50% tác dụng tối đa EC50= 0,8 µg/ml, chỉ số trị liệu (TI) là 36,3 [34].  Tác dụng chống ung thư: Nuciferin có tác dụng đáng kể trong việc ức chế nicotin gây ra NSCLC (non small cell lung cancer) tiến triển thông qua việc làm giảm hoạt động của tín hiệu Wnt/β-catenin. Thử nghiệm trên chuột cho thấy nuciferin không chỉ ức chế sự tăng trưởng của NSCLC mà còn làm giảm đáng kể các tổn thương gây ra bởi nicotin trong chức năng gan [21]. 6 Ung thư vú là một trong những nguyên nhân phổ biến gây tử vong ung thư ở phụ nữ và có xu hướng di căn đến xương. Nuciferin và liensinin được thử nghiệm trên chuột ở nồng độ không gây độc tế bào cho thấy tác dụng ức chế sự hoạt hóa thụ thể của yếu tố gây hủy xương. Ngoài ra, liensinin và nuciferin còn có tác dụng ức chế việc tăng sinh tế bào ung thư vú ở người [18].  Tác dụng chống oxy hóa: Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết cồn của hạt Nelumbo nucifera để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên mô hình invitro và invivo. Tổng hàm lượng của các phenolic trong dịch chiết được tìm thấy là 7,61 ± 0,04% (kl/kl). Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng dọn gốc tự do tốt thể hiện qua các giá trị IC50 thu được. Tác dụng chống oxy hóa sử dụng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) cho IC50 có giá trị là 6,12 ± 0,41 µg/ml. Còn với phương pháp sử dụng nitric oxid là 84,86 ± 3,56 µg/ml. Các giá trị IC50 ở trên đều ít hơn so với giá trị IC50 ở rutin trong thử tác dụng chống oxy hóa với các phương pháp tương tự. Ngoài ra, người ta đánh giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ, không thấy có dấu hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lượng cơ thể [5]. Với rất nhiều tác dụng sinh học có ý nghĩa to lớn trong việc điều trị bênh đã và đang được tiếp tục nghiên cứu, nuciferin có tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu quan trọng trong ngành dược không chỉ của Việt Nam mà của toàn thế giới. 1.2.3. Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu 1.2.3.1. Phương pháp chung chiết xuất, phân lập và tinh chế alkaloid từ dược liệu [1,6] a. Phương pháp chiết xuất:  Chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực:  Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu Xay nhỏ dược liệu trước khi chiết. Kiềm hóa và làm trương nở dược liệu bằng dung dịch kiềm để chuyển alkaloid trong nguyên liệu sang dạng base.  Giai đoạn 2: Chiết xuất 7 Sử dụng dung môi chiết là các dung môi hữu cơ. Trong phòng thí nghiệm thường sử dụng benzen, cloroform, ether + cloroform. Trong sản xuất công nghiệp, thường dùng dung môi rẻ tiền, ít độc, khó cháy. Có thể dùng chiết nguội hoặc chiết nóng.  Giai đoạn 3: Tinh chế Tinh chế thu các alkaloid bằng cách chuyển dạng muối với acid - base và phân chia chúng giữa hai pha đó để loại tạp không phải alkaloid.  Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn acid.  Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu  Nguyên liệu được xay nhỏ, sau đó làm ẩm, cho trương nở bằng dung môi thích hợp (nước, nước acid, cồn acid).  Giai đoạn 2: Chiết xuất Chiết bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dược liệu ở dạng muối tan trong các dung môi trên (thông thường d ng nước nóng hoặc ethanol có các nồng độ khác nhau).  Giai đoạn 3: Tinh chế Lọc dịch chiết, kiềm hóa về dạng base, cô dung môi dưới áp suất giảm. Dùng dung mỗi hữu cơ thích hợp để chiết lấy alkaloid dạng base. Cất thu hồi dung mỗi hữu cơ rồi sấy khô sẽ thu được hỗn hợp alkaloid tinh khiết.  Chiết bằng methanol, ethanol: Một số alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan nhiều trong ethanol ở môi trường trung tính, do đó sau khi tán nhỏ dược liệu ở kích thước thích hợp, đem thấm ẩm và chiết bằng ethanol cho tới kiệt alkaloid. Quá trình tiếp theo thực hiện như trên. Methanol là một loại dung môi có độ hòa tan cao hơn ethanol, nhưng lại rất độc nên ít được sử dụng. 8  Phương pháp sử dụng dung môi siêu tới hạn – CO2 lỏng : Là phương pháp hiện đại nhất hiện nay. Phương pháp này cho hiệu suất cao, không gây cháy, khí CO2 được sử dụng nhiều lần và các alkaloid không bị thủy phân do quá trình chiết xuất tiến hành ở nhiệt độ thấp. b. Phân lập và tinh chế:  Kết tinh phân đoạn: Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất khi hòa tan hỗn hợp vào một hoặc một hỗn hợp dung môi. Trong quá trình để yên để dung môi bốc hơi từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ tủa hoặc kết tinh trước. Lọc lấy phần tinh thể thô và kết tinh lại sẽ thu được chất tinh khiết. Phần dung dịch còn lại có thể để bay hơi dung môi và kết tinh để tách các chất khác. Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt độ để quá trình kết tinh hiệu quả hơn. Dung môi d ng để hòa tan/kết tinh phân đoạn thường là một dung môi nhưng cũng có thể là một hỗn hợp 2 hay 3 dung môi trong trường hợp các chất khó kết tinh.  Phương pháp sắc ký cột: Dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp alcaloid có độ hấp phụ khác nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột, bột cellulose… khi cho dịch chiết alcaloid qua cột, các alcaloid sẽ phân bố lần lượt trong cột, ở phần trên của cột sẽ tập trung chất bị hấp phụ mạnh nhất, còn ở phần dưới của cột tập trung chất hấp phụ kém nhất.  Phương pháp sắc ký lớp điều chế: Dựa theo nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng, dịch chiết đậm đặc alcaloid được chấm lên những tấm kính đã tráng chất hấp phụ tương đối dày thành một đường thẳng. Sau khi khai triển bằng một hệ dung môi thích hợp, các chất khác nhau có tốc độ di chuyển khác nhau nên có thể quan sát một cách dễ dàng dưới ánh sáng tử ngoại. Sau đó cạo lấy riêng từng phần chất hấp phụ có chứa các alkaloid riêng biệt, rồi chiết riêng lấy từng chất bằng dung môi thích hợp. Sau khi bốc hơi dung môi sẽ thu được từng alkaloid riêng biệt. 9 1.2.3.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu Sử dụng phương pháp chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm và phân lập, tinh chế bằng phương pháp kết tinh (như đã nêu trong phần 1.2.3.1). 1.3. N- methyl-asimilobin (II) 1.3.1. Công thức, tính chất  Cấu trúc hóa học: Hình 1.4  Công thức phân tử: C18H19NO2.  Khối lượng phân tử: 281,35 đvC.  Nhiệt độ nóng chảy: 194–195°C.  Góc quay cực [α]D −221° (CHCl3) [16]  UV: 231, 272, 314 [14] Hình 1.4: Công thức cấu tạo  IR (CHCl3): 3500 [14] của N-methyl-asimilobin (II) 1.3.2. Tác dụng dược lý Thành phần alkaloid từ nụ hoa và lá của hoa sen có khả năng ức chế hoạt động tạo melanin trong các tế bào khối u ác tính B16: Dịch chiết methanol từ nụ hoa và lá của hoa sen (Nelumbo nucifera, Nymphaeaceae) đã được chứng minh là có tác dụng ức chế hoạt động tạo khối u ác tính tế bào B16 4A5 ở chuột. Trong số các thành phần phân lập được, nuciferin, N-methyl-asimilobin, lirinidin, và 2hydroxy-1-methoxy-6a, 7-dehydroaporphin đã cho thấy: Nuciferin và N-methylasimilobin ức chế sự biểu hiện của mRNA tyrosinase ở nồng độ 3-30 µM, Nmethyl-asimilobin ức chế sự biểu hiện của TRP-1 mRNA nồng độ 3-30 µM, và nuciferin ức chế sự biểu hiện của TRP-2 mRNA ở nồng độ 10-30 µM [13,8]. 10 Các alkaloid aporphin phân lập từ Nelumbo nucifera có tác dụng ức chế acetylcholinesterase, cụ thể: N-methyl-asimilobin là một chất ức chế mạnh acetylcholinesterase (AChE) (ức chế 50% hoạt động của AChE ở nồng độ 1,5 ± 0,2 µg ml -1 trong khi giá trị IC50 tiêu chuẩn của Physostigmine là 0,013 ± 0,002 µg ml1 ) và hai alkaloid aporphin có tác dụng kém hơn là nuciferin và nornuciferin được tách ra từ Nelumbo nucifera [8,15]. 1.3.3. Phương pháp demethyl hóa nuciferin tạo N-methyl-asimilobin  Phương pháp monodemethyl hóa nuciferin :  Phản ứng của Feutrill và cộng sự năm 1970 với tác nhân EtSNa Hình 1.5: Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và natri thioethoxid (lượng gấp 2,6- 2,7 số mol của nuciferin) vào dung môi DMF đun hồi lưu (sục N2) ở nhiệt độ 100oC trong 3 giờ. Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm monodemethyl nuciferin với hiệu suất khoảng 94 - 98% [12,20].  Phản ứng của Nguyễn Đắc T ng năm 2014 với tác nhân HBr 48% Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48% 11 Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và xúc tác KI vào dung dich HBr 48%, duy trì nhiệt độ 122-125oC và sục N2 trong suốt quá trình phản ứng. Kết thúc phản ứng sau 4 giờ, xử lý hỗn hợp và thu được sản phẩm N-methyl-asimilobin với hiệu suất 62,9% [8].  Phương pháp didemethyl hóa nuciferin :  Phản ứng của của Neumeyer và cộng sự (1973) với tác nhân HI: Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac2O Tiến hành phản ứng: 4 g nuciferin, 6 ml HI 57% và 4,5 ml Ac2O được làm nóng ở 140oC trong 30 phút. Kết thúc phản ứng: Xử lý thu được sản phẩm didemethyl nuciferin thu được tinh thể hình kim không màu, tonc =286oC với hiệu suất 82%) [26].  Phản ứng của Zhongduo và cộng sự năm 2014 với tác nhân AlBr3: Hình 1.8: Sơ đồ phản ứng didemethyl hóa nuciferin sử dụng AlBr3 trong acetonitril Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và AlBr3 vào dung môi acetonitril, duy trì nhiệt độ 70oC và sục N2 trong suốt thời gian 48 giờ. Kết thúc phản ứng, xử lý hỗn hợp và thu được sản phẩm với hiệu suất là 65% [32].