Tài liệu Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất n-hydroxyheptanamid mang khung 3-spiro[1,3]Dioxolan-2-oxoindolin

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CHU THANH HẰNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYHEPTANAMID MANG KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2-OXOINDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CHU THANH HẰNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYHEPTANAMID MANG KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2-OXOINDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Phan Thị Phương Dung 2. ThS. Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian dài nỗ lực và cố gắng thực hiện đề tài, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những ngƣời đã dạy dỗ, hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất cùng với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Hải Nam, TS. Phan Thị Phƣơng Dung, ThS. Trần Thị Lan Hƣơng và DS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn và chỉ bảo tận tình trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, khoa Dƣợc - trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc), Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Chu Thanh Hằng MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2 1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 2 1.1.2. Phân loại các HDAC 3 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và hoạt động bất thƣờng của HDAC 4 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 6 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 6 1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 9 1.3. MỘT SỐ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 9 1.3.1. Thay đổi cầu nối 9 1.3.2. Thay đổi nhóm khóa hoạt động 12 1.4. MỘT SỐ HƢỚNG THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƢỚC 14 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16 2.1.1. Hóa chất 16 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 16 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 2.2.1. Tổng hợp hóa học 16 2.2.2. Thử hoạt tính sinh học 17 2.2.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc 17 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1. Tổng hợp hóa học 17 2.3.2. Thử tác dụng sinh học 18 2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc 22 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. HÓA HỌC 23 3.1.1. Tổng hợp hóa học 23 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 30 3.1.3. Khẳng định cấu trúc 31 3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 35 3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC 35 3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 35 3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC DẪN CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC 35 3.4. BÀN LUẬN 35 3.4.1. Về tổng hợp hóa học 35 3.4.2. Về khẳng định cấu trúc 38 3.4.3. Về tác dụng sinh học 40 3.4.4. Về đánh giá sơ bộ liên quan giữa hoạt tính sinh học và tính chất lý hóa 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid desoxyribonucleic AOE : Acid 2-amino-8-oxo-9,10-epoxydecanoic APC : U đa polyp tuyến (Adenomatous polyposis coli) APL : Bệnh ung thƣ bạch cầu hạt tủy bào cấp tính (Acute promyelocytic leukemia) AsPC-1 : Dòng tế bào ung thƣ tuyến tụy ATP : Adenosin triphosphat 13 : Cộng hƣởng từ hạt nhân 13C C-NMR DCM : Dichloromethan DMF : Dimethyl formamid DMSO : Dimethyl sulfoxid FBS : Huyết thanh bào thai bò (Fetal Bovine Serum) HAT : Histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase 1 : Cộng hƣởng từ hạt nhân 1H H-NMR IC50 : Nồng độ gây ra sự giảm 50% số lƣợng tế bào IR : Phổ hồng ngoại Ki s : Hằng số ức chế HDAC MeOH : Methanol MS : Phổ khối lƣợng NAD+ : Nicotinamid adenin dinucleotid NCI-H460 : Dòng tế bào ung thƣ phổi PC-3 : Dòng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến PLZF : Promyelocytic leukaemia zinc finger protein PML : Gen bệnh bạch cầu tủy bào (promyelocytic leukemia gene) RAR : Receptor của acid retinoic RARE : Yếu tố đáp ứng acid retinoic (retinoic acid - responsive elements) RPMI 1640 : Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc phát triển bởi Viện tƣởng niệm Roswell Park SAHA : Suberoylanilid hydroxamic acid SIRT : Sirtuin SW620 : Dòng tế bào ung thƣ đại tràng Tonc : Nhiệt độ nóng chảy TCA : Trichloroacetic acid TLC : Sắc ký lớp mỏng TMS : Tetramethylsilan TSA : Trichostatin A TsOH : p-toluensulfonic acid δ : Độ chuyển dịch hóa học DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1: Kết quả thử hoạt tính in vitro của các hợp chất 10 aryltriazolylhydroxamat 1 2 Bảng 1.2: Kết quả thử hoạt tính in vitro của các hợp chất 10 aryltriazolylhydroxamat 2 3 Bảng 1.3: Cấu trúc và hoạt tính ức chế của một số hợp chất 14 nhóm 19 và 20 4 Bảng 2.1: Pha mẫu thí nghiệm định lƣợng HDAC2 19 5 Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid 30 hydroxamic từ ester 6 Bảng 3.2: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất IVa-d 31 7 Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IVa-d 32 8 Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất IVa-d 32 9 Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất IVa-d 33 10 Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất IVa-d 34 11 Bảng 3.7: Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất IVa-d 35 theo quy tắc Lipinsky 12 Bảng 3.8: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC2 của các dẫn 41 chất IVa-d và SAHA 13 Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các 43 dẫn chất IVa-d 14 Bảng 3.10: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các acid hydroxamic có khung isatin-3-oxim, isatin-3-methoxim và 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã 2 2 Hình 1.2: Phân loại và một vài đặc tính của các HDAC 4 3 Hình 1.3: Đích tác dụng của HDAC 6 4 Hình 1.4: Phân loại các chất ức chế HDAC 7 5 Hình 1.5: Cấu trúc cơ bản của chất ức chế HDAC 9 6 Hình 1.6: Các dẫn chất acid hydroxamic có khung alkyl 11 piperidin và piperazin 7 Hình 1.7: Các chất tƣơng tự TSA có nhóm thế và độ bão hòa 11 mạch carbon khác nhau 8 Hình 1.8: Cấu trúc chất 17 và chất 18 12 9 Hình 1.9: Cấu trúc các acid hydroxamic có khung benzothiazol 15 10 Hình 1.10: Cấu trúc acid hydroxamic mang khung isatin-3- 15 oxim và isatin-3-methoxim 11 Hình 1.11: Cấu trúc acid hydroxamic mang khung 5-phenyl- 18 1,3,4-thiadiazol 12 Hình 3.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các chất IVa-d 41 13 Hình 3.2: Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế HDAC2 của các dẫn 42 chất IVa-d với SAHA 14 Hình 3.3: Biểu đồ so sánh hoạt tính kháng tế bào ung thƣ SW620, PC-3 và AsPC-1 của các dẫn chất IVa-d và SAHA 44 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang 1 Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 23 2 Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa 23 3 Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa 24 4 Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất IVa 25 5 Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất IVb 26 6 Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất IVc 28 7 Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất IVd 29 8 Sơ đồ 3.8: Cơ chế phản ứng tạo thành IIa-d 36 9 Sơ đồ 3.9: Cơ chế phản ứng tạo thành IIIa-d 36 10 Sơ đồ 3.10: Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ là một trong những bệnh hiểm nghèo và có tỷ lệ tử vong cao nhất hiện nay, gây hao tốn tiền của không chỉ cho ngƣời bệnh mà còn cho toàn thể xã hội. Y học hiện đại đã làm rõ đƣợc cơ chế bệnh sinh cũng nhƣ quá trình tiến triển của nhiều bệnh ung thƣ. Tr n cơ sở đó, các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu tìm ra các thuốc mới có tác dụng tại đích nhằm chống lại các bệnh này. Một trong các nhóm chất có khả năng đề kháng và hạn chế sự phát triển của tế bào ung thƣ đang đƣợc tập trung nghi n cứu phát triển hiện nay là nhóm chất ức chế sự hoạt động của histon deacetylase (HDAC) - enzym li n quan đến sự bất thƣờng trong hoạt động biểu hiện gen. Hai đại diện của nhóm chất này là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) (Zolinza®, 2006 và depsipeptid Romidepsin®, 2009 có tác dụng điều trị u lympho tế bào T tại da cho hiệu quả cao. Dựa trên kết quả nghiên cứu của thế giới, ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất mới nhằm ức chế HDAC và cho hoạt tính kháng tế bào ung thƣ tốt. Các kết quả thu đƣợc cho thấy, việc thay đổi cấu trúc nhóm khóa hoạt động ảnh hƣởng lớn tới tác dụng ức chế tế bào. hi thay khung phenyl thành khung benzothiazol làm nhóm khóa hoạt động, tác giả Đào Thị Kim Oanh [2] và Trƣơng Thanh Tùng [30] đã tổng hợp đƣợc một số chất cho tác dụng đề kháng tế bào ung thƣ tốt hơn nhiều lần so với SAHA. Tác giả Nguyễn Hải Nam và cộng sự [21] cũng đã rất thành công trong việc tổng hợp ra các acid hydroxamic mang khung 5phenyl-1,3,4-thiadiazol để thu đƣợc các dẫn chất có hoạt tính mạnh hơn hẳn SAHA. Với mong muốn góp phần tìm ra đƣợc nhiều hơn nữa các dẫn chất mới có tác dụng trên tế bào ung thƣ, các chất ức chế HDAC có nhóm khóa hoạt động đƣợc thay đổi thành khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin với cầu nối heptanamid đƣợc tiến hành tổng hợp. Tr n cơ sở đó, đề tài: "Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất N-hydroxyheptanamid mang khung 3- spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin" đƣợc thực hiện với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid và 3 dẫn chất. 2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. HISTON DEACTYLASE (HDAC) 1.1.1. Khái niệm về histon deactylase Nhiễm sắc thể là một phức hợp gồm 3 thành phần: ADN, protein histon và protein không phải histon [15,33]. Đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể là nucleosom. Mỗi nucleosom gồm khoảng 146 cặp base ADN đƣợc gói trong một protein histon octame [9] đƣợc tạo bởi 4 thành phần: 1 tetrame H3-H4 và 2 dime H2A-H2B [7,15,18]. Cầu nối histon H1 giúp ổn định nếp gấp ở bậc cao hơn bằng cách trung hòa điện tích của đoạn cầu nối ADN thông qua vùng carboxy tận cùng tích điện dƣơng. Đuôi histon, đặc biệt là H3 và H4, là đích đến của các biến đổi đa dạng sau dịch mã, bao gồm sự acetyl hóa, phosphoryl hóa và methyl hóa. Các hoạt động biến đổi ở đuôi histon bởi histon acetyltransferase (HAT), histon deacetylase (HDAC), methyltransferase và kinase chính là cơ chế điều hòa biểu hiện gen [14,15]. Hình 1.1: Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã a. Sự methyl hóa và deacetyl hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn nhiễm sắc thể và ức chế phiên mã. b. Sự acetyl hóa và demethyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể, và cho phép phiên mã. Histon acetyltransferase là enzym có nhiệm vụ acetyl hóa nhóm -NH2 của lysin ở phần đầu N của histon bằng cách chuyển nhóm acetyl của acetyl coenzym A [19], nhờ đó làm trung hòa điện tích dƣơng của histon, dẫn tới giảm khả năng li n kết với ADN tích điện âm. Th m vào đó, việc acetyl hóa histon H4-K16 làm phá vỡ việc hình thành cấu trúc nhiễm sắc thể ở mức độ cao hơn. Nhiễm sắc thể tháo xoắn giúp các tác nhân phiên mã có thể tiếp cận và tiến hành phiên mã [12]. 3 Histon deacetylase là một họ enzym đƣợc tìm thấy trong nhiều loài gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Chúng có nhiệm vụ ngƣợc với HAT, nghĩa là loại bỏ nhóm acetyl từ -N-acetyl lysin ở phần đầu N của nhiều loại protein cơ bản, gồm histon, tác nhân sao chép, α-tubulin và chất vận chuyển vào tế bào có nhân [11,34]. 1.1.2. Phân loại các HDAC Ở ngƣời có 18 HDAC đã đƣợc nhận diện và chia thành 4 nhóm dựa trên tính tƣơng đồng với HDAC của nấm men (hình 1.2) [11,16,29,32]: - Nhóm I gồm HDAC1, 2, 3 và 8 tƣơng đồng với Rpd3 của nấm men. Các chất này có kích thƣớc nhỏ [11], đƣợc tìm thấy trong nhân tế bào, là những HDAC nhiều nhất, có mặt ở khắp mọi nơi [7,11,16,29] và thƣờng có vai trò cơ bản trong sự phân đôi, sự sinh sôi và sự sống còn của tế bào [11]. Đích cơ bản của HDAC nhóm I là các histon. + HDAC1 và 2 chỉ ở trong nhân tế bào, do thiếu tín hiệu xuất của nhân (NES). + HDAC3 có cả tín hiệu nhập và xuất của nhân tế bào, gợi ý rằng HDAC3 có thể có ở cả tế bào chất. + HDAC8 có sự biểu hiện quá mức điều này là cần thiết bởi số lƣợng của chúng ít , do đó có thể chứng minh protein này ở trong nhân [32]. Ngoài ra, HDAC8 cũng đƣợc tìm thấy trong tế bào chất hoặc màng liên kết [11]. - Nhóm II gồm HDAC4, 5, 6, 7, 9 và 10 tƣơng đồng với Hda1 của nấm men. Các chất này có kích thƣớc lớn hơn nhóm I và nhóm IV [11,16], đƣợc tìm thấy cả trong nhân và tế bào chất [11,16,29], hoạt động trong sự liên kết với các tác nhân sao chép đặc biệt của mô và có chức năng điều hòa đặc biệt của mô hơn nhóm I. HDAC nhóm II có đích cơ bản là các histon và protein không phải histon [11]. Dựa trên sự tƣơng đồng liên tục và có tổ chức, có thể phân nhóm nhỏ hơn cho nhóm II: + Nhóm IIa (HDAC4, 5, 7 và 9) có chứa enzym deacetylase C tận cùng đƣợc bảo tồn cao, tƣơng đồng với yHdac1, nhƣng có N tận cùng không tƣơng đồng. + Nhóm IIb (HDAC6 và 8 đƣợc mô tả bởi 2 vùng deacetylase [7,29]. - Nhóm III còn đƣợc gọi là sirtuin - SIRT) gồm SIRT1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 [11,29] có cấu trúc tƣơng đồng với protein Sir2 của nấm men [16]. Các chất này có 4 cả ở trong nhân (SIRT1, 6 và 7), ty thể (SIRT3, 4 và 5) và tế bào chất (SIRT2) [7]. HDAC nhóm III điều hòa quá trình biểu hiện gen trong đáp ứng với những biến đổi trạng thái oxy hóa khử của tế bào [11]. - Nhóm IV chỉ gồm HDAC11 [11,16]. Chất này tƣơng đồng với vùng nhân xúc tác của cả nhóm I và II nhƣng không đủ mạnh để có thể đƣợc xếp vào bất kì nhóm nào [11]. HDAC11 đƣợc tìm thấy ở trong nhân tế bào. Tuy nhiên khi phân tích về khả năng hoạt động, HDAC11 cùng kết tủa với HDAC6 ở trong tế bào chất [7]. HDAC nhóm I, II và IV đều cần có một phân tử kẽm nhƣ một cofactor thiết yếu ở vị trí hoạt động và bị ức chế bởi chất ức chế HDAC liên kết với Zn2+ nhƣ vorinostat và trichostatin A (TSA) [11,16,29] tạo phức chelat. Khái niệm chất ức chế HDAC thƣờng sử dụng cho các hợp chất mà đích đến là các HDAC cổ điển nhóm I, II và IV và đã đƣợc đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng [32]. Trái lại, HDAC nhóm III lại cần NAD+ nhƣ 1 cofactor thay cho Zn2+. Vì vậy, các chất này không bị ức chế bởi chất ức chế HDAC [16] mà bởi nicotinamid [12]. Hình 1.2: Phân loại và một vài đặc tính của các HDAC Ghi chú: N: nhân; M: ty thể; C: tế bào chất. 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và hoạt động bất thƣờng của HDAC 5 Sự xuất hiện và tiến triển của nhiều bệnh nhƣ bệnh ung thƣ, là một quá trình gồm nhiều bƣớc đòi hỏi sự kết hợp của nhiều sự kiện. Một trong các sự kiện cơ bản là sự phiên mã gen khác thƣờng cũng nhƣ các bất thƣờng của nhiễm sắc thể dẫn tới mất chức năng của nhiều gen và/ hoặc giành lại chức năng hoặc tăng hoạt động của nhiều gen đặc biệt khác [11]. Ngƣời ta nhận thấy có sự tƣơng quan mạnh mẽ giữa sự biểu hiện quá mức hoạt động của HDAC, sự deacetyl hóa ở đuôi histon và cấu trúc nhiễm sắc thể. Nhƣ đã trình bày ở trên, HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và các protein không phải histon, làm tăng điện tích dƣơng ở đầu N của histon, dẫn đến đóng xoắn nhiễm sắc thể [16]. Nhiều gen có thể không kết nối đƣợc với các yếu tố phiên mã và không đƣợc phiên mã, dẫn tới cơ chế giới hạn hoặc im lặng của gen ức chế ung thƣ nhƣ p53, và chất ức chế kinase phụ thuộc vòng nhƣ p21, vì vậy nguy cơ phát triển ung thƣ là kết quả của sự phát triển các tế bào không kiểm soát [11]. Sự biểu hiện quá mức, chức năng và sự huy động bất thƣờng của HDAC nhóm I, II li n quan đến khối u ác tính bao gồm cả u hạch bạch huyết tế bào T cũng nhƣ sự biểu hiện tăng l n của HDAC nhóm I 1, 2, 3 đƣợc xem xét cần thiết cho sự tăng sinh và tồn tại của tế bào ung thƣ. Ví dụ, có sự tăng biểu hiện HDAC1 ở carcinoma dạ dày, tiền liệt tuyến, đại tràng và vú. Sự biểu hiện quá mức của HDAC2 cũng đƣợc tìm thấy trong ung thƣ cổ, dạ dày, trong carcinoma kết tràng với sự mất biểu hiện APC. Các nghiên cứu khác báo cáo mức độ hoạt động cao của HDAC3 và HDAC6 trong sự hình thành ung thƣ ruột kết và vú [26]. Th m vào đó, HDAC nhóm I biểu hiện trên cả u ác tính rắn và u máu tƣơng quan với một ti n lƣợng xấu, với sự biểu hiện quá mức của HDAC2 đƣợc nhìn thấy ở dạng tấn công của tế bào lympho T dƣới da. Đối với HDAC nhóm II (4, 5, 6, 7 và 10), sự biểu hiện của chúng hƣớng tới tiên lƣợng tốt hơn, đặc biệt trong tế bào lympho T dƣới da HDAC6 và ung thƣ phổi không phải tế bào nhỏ [11]. Ví dụ trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL), sự dịch mã nhiễm sắc thể sản xuất ra các protein gắn kết αRAR-PML và αRAR-PLZF. Những protein gắn kết này liên kết với các yếu tố đáp ứng acid retinoic RARE và huy động phức hợp ức 6 chế HDAC với ái lực cao, ngăn acid retinoic li n kết, vì vậy ức chế biểu hiện gen điều hòa sự biệt hóa và tăng của APL [15,26]. Do đó HDAC là yếu tố "chìa khóa" trong phát triển APL. Hình 1.3 dƣới đây biểu diễn các đích chọn lọc của từng loại HDAC [31]. Dƣờng nhƣ những isozym tƣơng đồng có ảnh hƣởng tới tế bào ung thƣ khác nhau, và tác dụng sinh lý có thể phụ thuộc môi trƣờng tế bào. Vì vậy nên cân nhắc thiết kế các chất ức chế HDAC chọn lọc cho điều trị ung thƣ [11,31]. Hình 1.3: Các đích tác dụng của HDAC 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC Các chất ức chế HDAC có thể tƣơng tác với vùng xúc tác của deacetylase histon để có khả năng nhận diện cơ chất của những HDAC này, dẫn đến giữ lại sự biểu hiện của những gen liên quan. Tác dụng sinh lý chính của chất ức chế HDAC là cảm ứng sự biệt hóa, ngừng chu kì tế bào và thúc đẩy sự chết theo chu trình của tế bào ung thƣ. Hơn nữa, chất ức chế HDAC có thể tăng tính nhạy cảm của tế bào ung thƣ với xạ trị hoặc hóa trị liệu và ngăn hình thành mạch [24]. 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 7 Chất ức chế HDAC gồm có 6 nhóm, dựa theo cấu trúc (hình 1.4) [10].  Carboxylat trọng lƣợng phân tử nhỏ AN-9 (pivaloyloxymethyl butyrat)  Acid hydroxamic Natri butyrat Natri phenylbutyrat Acid valproic Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) Trichostatin A (TSA)  Benzamid  Epoxyceton Acid 2-amino-8-oxo-9,10-epoxydecanoic (AOE)  Peptid vòng  Phân tử lai Peptid vòng chứa acid hydroxamic CHAP 31 Hình 1.4: Phân loại các chất ức chế HDAC - Carboxylat hay acid béo mạch ngắn bao gồm natri butyrat, acid valproic, và natri phenylbutyrat có hằng số ức chế HDAC (Kis) yếu hơn, thƣờng trong khoảng mM. Mặc dù hoạt động yếu, một vài tác nhân đƣợc nghiên cứu lâm sàng 8 một phần do các chất này đƣợc sử dụng trên lâm sàng cho các chỉ định thay thế. Các chất đƣợc nghiên cứu nhiều nhất của nhóm này là các phân tử đơn giản với alkyl hoặc phenylalkyl carboxylat. Carboxylat đƣợc cho là phối hợp với ion kẽm ở vị trí hoạt động, mặc dù yếu hơn so với hydroxamat [10]. - Dẫn chất của acid hydroxamic bao gồm TSA, SAHA… có 3 thành phần cơ bản: (a) phần tạo phức chelat với kẽm, (b) cầu nối kỵ nƣớc, (c) đầu kỵ nƣớc [10]. Hiện nay, các dẫn chất của acid hydroxamic đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới quan tâm, thiết kế tổng hợp và thử hoạt tính ức chế HDAC cũng nhƣ ức chế các dòng tế bào ung thƣ. Các dẫn chất này đƣợc đề cập cụ thể hơn trong mục 1.3. - Các chất ức chế nhóm benzamid nhƣ CI-994 và MS-275, ít hoạt động hơn nhóm hydroxamat hoặc peptid vòng, với Kis trong khoảng µM. Cơ chế ức chế HDAC của benzamid chƣa rõ ràng. Drummond D.C. và cộng sự đã mô tả 3-(4aroyl-1-methyl-1H-2-pyrrolyl)-N-hydroxy-2-alkylamid chứa 1 dãy nhóm phức chelat kim loại khác nhau với IC50 trong khoảng nồng độ µM [10]. - Các chất ức chế HDAC epoxyceton nhƣ trapoxin B, HC-toxin, hoặc acid 2-amino-8-oxo-9,10-epoxydecanoic (AOE), có thể hoạt động bẳng cách thay đổi vị trí hoạt động ái nhân với nhóm epoxy và hình thành liên kết hydro với ceton. Việc loại trừ ceton, hoặc thay ceton thành alcol, làm mất hoạt động của những phân tử này. Sự phối hợp của peptid vòng và epoxyceton dẫn đến ức chế hoạt động của HDAC ở nồng độ cỡ nM [10]. - Các chất ức chế HDAC peptid vòng đƣợc phát hiện hoặc phát triển có chứa nhóm epoxyceton (HC-toxin, trapoxin B) hoặc không chứa nhóm này (apicidin, depsipeptid . Thông thƣờng, các chất ức chế này có hoạt độ ức chế HDAC ở khoảng nM và có thể có cơ chế hoạt động không đảo chiều (dựa trên epoxyceton) hoặc đảo chiều. Depsipeptid (FK228), một tiền thuốc đòi hỏi sự khử trong tế bào để giải phóng nhóm liên kết béo có chứa sulfhydryl nhằm tiến vào vị trí hoạt động để liên kết với kẽm và phân tử nƣớc ở vị trí hoạt động [10]. - Phân tử lai bao gồm CHAP31 và CHAP50, có cấu trúc peptid vòng và hydroxamat béo, có cơ chế hoạt động có thể đảo chiều và hoạt động ức chế khá tốt khi 9 hoạt động tối ƣu trong khoảng 1-5 nM. Cầu nối tối ƣu nhất trong các nghiên cứu này có 5 nhóm methylen, tƣơng tự những mô tả trƣớc đó của các hydroxamat khác [10]. Ngoài việc phân loại nhƣ tr n, một số nghiên cứu chia thành bốn nhóm chất ức chế HDAC: hydroxamat, peptid vòng, acid aliphatic và benzamid [16,24,29]. 1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC Dù đƣợc chia thành nhiều nhóm khác nhau, các chất ức chế HDAC vẫn có một số đặc điểm chung về cấu trúc, bao gồm 3 phần chính (hình 1.5) [2,8,29]: - Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt: thƣờng là các aryl hoặc 1 số vòng khác, li n quan đến quá trình nhận diện phân tử với amino acid bề mặt. - Cầu nối kỵ nƣớc: thƣờng là mạch hydrocarbon thân dầu có thể tạo nhiều liên kết Van der Waals với kênh enzym. - Nhóm chức năng (tạo phức chelat với ion Zn2+ trong trung tâm hoạt động): nhƣ acid hydroxamic, thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, ceton thân dầu... quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của chất ức chế HDAC. Nhóm khóa hoạt động Cầu nối Nhận diện bề mặt Nhóm chức năng Tạo phức chelat với Zn2+ trong trung tâm hoạt động Hình 1.5: Cấu trúc cơ bản của chất ức chế HDAC 1.3. MỘT SỐ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI Việc thiết kế các chất ức chế HDAC đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu chủ yếu theo 2 hƣớng là thay đổi cầu nối và thay đổi nhóm khóa hoạt động. 1.3.1. Thay đổi cầu nối 1.3.1.1. Thay đổi chiều dài cầu nối 10 Năm 2008, Chen P.C. và cộng sự đã tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính sinh học in vitro của những hợp chất hydroxamat béo giống SAHA (bảng 1.1 để nghiên cứu ảnh hƣởng của chiều dài cầu nối tới hoạt tính ức chế HDAC [6]. Bảng 1.1: Kết quả thử hoạt tính in vitro của các hợp chất aryltriazolylhydroxamat 1 STT Hợp chất Số nhóm -CH2của cầu nối (n) 1 1a 3 2 1b 4 110,0 3 1c 5 14,2 4 1d 6 9,6 5 SAHA IC50 (nM) hông xác định đƣợc 65 Từ bảng trên có thể thấy với 3 nhóm methylen, hợp chất 1a không có hoạt tính ức chế HDAC; khi chiều dài cầu nối đƣợc tăng l n (n = 4 - 6), các chất 1b-d có tác dụng ức chế HDAC tốt thể hiện qua giá trị IC50 nhỏ và có chiều hƣớng giảm dần. Tuy nhiên, chƣa kết luận đƣợc rằng cầu nối chứa 5 hay 6 nhóm methylen cho hiệu lực lớn hơn: với công thức trên, hợp chất có 6 nhóm methylen cho hoạt tính mạnh hơn một chút nhƣng khi thay thế nhóm phenyl thành p-N,N-dimethyl aminophenyl trên TSA (bảng 1.2, so sánh 2a và 2b), hợp chất có 5 cầu nối methylen có hoạt tính mạnh gấp 25 lần so với hợp chất có 6 cầu nối methylen [6]. Bảng 1.2: Kết quả thử hoạt tính in vitro của aryltriazolylhydroxamat 2 Chất R n IC50 (nM) 2a 5 4,3 2b 6 106,1 Tiếp sau đó, vào năm 2011, Rossi C. và các cộng sự đã nghi n cứu ảnh hƣởng của chiều dài cầu nối tới hoạt tính ức chế ung thƣ của các dẫn chất acid hydroxamic có khung alkyl piperidin và piperazin. Các tác giả đã nhận thấy khi cầu nối có 3 nhóm methyl sẽ cho hoạt tính ức chế ung thƣ lớn nhất (hình 1.6) [28].