Tài liệu Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ------ LÊ THỊ THẢO TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ------ LÊ THỊ THẢO TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Đào Thị Kim Oanh 2. PGS.TS. Nguyễn Hải Nam HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase”, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp. Trƣớc tiên, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Đào Thị Kim Oanh, PGS. TS. Nguyễn Hải Nam – những ngƣời thầy đã tận tâm hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài tại Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Huỳnh Kim Thoa – ngƣời Thầy đã tạo điều kiện cho tôi cơ hội đƣợc nâng cao kiến thức và có thời gian để thực hiện cơ hội đó. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa dƣợc - Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các anh chị Khoa hóa học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongji, Hàn Quốc) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này. Cuối cùng, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến chồng, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2014 Lê Thị Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 3 1.1.1. Khái niệm HDAC 3 1.1.2. Phân loại HDAC 4 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự hoạt động bất thƣờng của HDAC 5 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs) 6 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 6 1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 9 1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 9 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC 10 HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY 1.3.1. Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới 10 1.3.1.1. Thay đổi cầu nối 11 1.3.1.2. Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt 16 1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc 21 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC 24 1.4.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 24 1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic 25 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 26 2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 26 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1. Nội dung nghiên cứu 27 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.2.1. Tổng hợp hóa học 28 2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 28 2.3.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc 28 2.3.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 29 2.3.2.5. Docking 31 2.3.2.6. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được 31 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 33 3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC 33 3.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất (IIa-g) 33 3.1.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIa) 34 3.1.1.2. Tổng hợp 5- fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIb) 34 3.1.1.3. Tổng hợp 5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIc) 34 3.1.1.4. Tổng hợp 5-bromoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IId) 34 3.1.1.5. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin (IIe) 35 3.1.1.6. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin (IIf) 35 3.1.1.7. Tổng hợp 7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIg) 35 3.1.2. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat và dẫn 35 chất (IIIa – g) 3.1.2.1. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)–2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIa) 36 3.1.2.2. ethyl-7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 36 3.1.2.3. Tổng hợp ethyl-7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat 36 Tổng hợp yl)heptanoat (IIIb) (IIIc) 3.1.2.4. Tổng hợp ethyl-7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 37 3.1.2.5. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat 37 yl)heptanoat (IIId) (IIIe) 3.1.2.6. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1- 37 3.1.2.7. Tổng hợp ethyl-7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat 37 yl)heptanoat (IIIf) (IIIg) 3.1.3. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và 38 dẫn chất (IVa-g) 3.1.3.2. Tổng hợp N-hydroxy-7-(5-fluoro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 39 N-hydroxy-7-(5-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 39 N-hydroxy-7-(5-bromo-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 39 N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1- 39 3.1.3.6. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1- 40 yl)heptanamid (IVb) 3.1.3.3. Tổng hợp yl)heptanamid (IVc) 3.1.3.4. Tổng hợp yl)heptanamid (IVd) 3.1.3.5. Tổng hợp yl)heptanamid (IVe) yl)heptanamid (IVf) 3.1.3.7. Tổng hợp N-hydroxy-7-(7-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 40 yl)heptanamid (IVg) 3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 41 3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 42 3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) 42 3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS) 43 3.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 43 3.3.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 44 3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR 45 3.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 47 3.4.1. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase 47 3.4.2. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 47 3.5. KẾT QUẢ DOCKING 47 3.6. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP 49 Chƣơng 4. BÀN LUẬN 50 4.1. VỀ HÓA HỌC 50 4.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (IIa-g) 50 4.1.2. Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian (IIIa-g) 50 4.1.3. Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic (IVa-g) 51 4.2. VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 52 4.2.1. Phổ hồng ngoại 52 4.2.2. Phổ khối lƣợng 54 4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 55 4.2.3.1. Phổ 1H – NMR 56 4.2.3.2. Phổ 13C – NMR 61 4.3. VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 64 4.3.1. Về tác dụng ức chế HDAC 64 4.3.2. Về tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72 1. KẾT LUẬN 72 1.1. Về tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc 72 1.2. Về hoạt tính sinh học 72 2. ĐỀ XUẤT 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỔ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AsPC-1 Tế bào ung thƣ tụy 13 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C C-NMR DCM Dicloromethan DMF Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid FDA Cục quản lý dƣợc phẩm và thực phẩm Mỹ HAT Histon acetyl transferase HDAC Enzym histon deacetylase HDACIs Các chất ức chế HDAC 1 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H H-NMR IC50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào IR Phƣơng pháp phổ tử ngoại LD50 Liều gây chết cho 50% số cá thể nghiên cứu MCF-7 Tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol MS Phổ khối lƣợng NCI-H460 Tế bào ung thƣ phổi NMR Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân PC-3 Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic SW620 Tế bào ung thƣ ruột kết THF Tetrahydrofuran TLC Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng TSA Trichostatin A DANH MỤC HÌNH VẼ Tên hình Trang Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo nucleosom 3 Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV 4 Hình 1.3: Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ 5 H h 1.4: HDACIs có cấu trúc hydroxamat 10 Hình 1.5: Các dẫn chất thế 2’ của SAHA 12 Hình 1.6: Các dẫn chất -alkoxy của SAHA 12 Hình 1.7: Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid 13 Hình 1.8: SAR của các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC 14 Hình 1.9: Các dẫn chất amid ngƣợc của SAHA 14 Hình 1.10: Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối của SAHA 16 Hình 1.11: Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA 16 Hình 1.12: Các aryl-hydroxamic tƣơng tự SAHA 17 Hình 1.13: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic 17 Hình 1.14: Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA 18 Hình 1.15: Một số acid phenylthiazol hydroxamic 19 Hình 1.16: Dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049 19 Hình 1.17: Dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic acid 19 Hình 1.18: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol hydroxamic 20 Hình 1.19: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol hydroxamic 20 Hình 1.20: Cấu trúc N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid 21 Hình 1.21: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động 22 benzothiazol Hình 1.22: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động 22 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol Hình 1.23: Cấu trúc của các dẫn chất 3-oxim-isatin 24 Hình 3.1: Kết quả phân tích Western blot của các chất IVa – g 47 Hình 3.2: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC8 48 Hình 3.3: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC2 48 Hình 4.1: Hiện tƣợng hỗ biến của nhóm chức hydroxamic 53 Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của chất IVa 54 Hình 4.3: Phổ khối lƣợng của chất IVa 55 Hình 4.4: Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVa 57 Hình 4.5: Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVg 58 Hình 4.6: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 19e 59 Hình 4.7: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của IVe 59 Hình 4.8: a, Phổ 13C – NMR của chất IVf. 63 b, Phổ 13C – NMR dãn rộng của chất IVf Hình 4.9: Kết quả phân tích Western blot của 2 dãy chất 19a-g và IVa-g 64 Hình 4.10: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn 67 chất IVa-g DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC 7 Bảng 1.2: Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV 8 Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ 13 in vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid Bảng 1.4: Tác dụng kháng các tế bào ung thƣ in vitro của N25 21 Bảng 1.5: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế 23 enzym HDAC của các chất 18a-d Bảng 3.1: Kết quả tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất 35 Bảng 3.2: Kết 7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 38 Bảng 3.3: Kết quả tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1- 40 quả tổng hợp ethyl yl)heptanoatvà dẫn chất yl)heptanamidvà dẫn chất Bảng 3.4: Giá trị Rf và Tnc của các chất IVa-g 41 Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-g 42 Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ khối lƣợng của các chất IVa-g 43 Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất IVa-g 44 Bảng 3.8: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất IVa-g 46 Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất IVa-g theo quy tắc 49 Lipinsky Bảng 4.1: Bảng so sánh phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 2 chất 19e và IVe 60 Bảng 4.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các chất IVa-g 66 Bảng 4.3: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-g và 19a-g 69 Bảng 4.4: So sánh giá trị logP của các chất 19a-g và IVa-g 70 DANH MỤC SƠ ĐỒ Tê sơ đồ Trang Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của 24 Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid biaryl hydroxamic 25 Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic 25 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung 3-methoximisatin Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIa - g 33 Sơ đồ 3.3: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIIa - g 36 Sơ đồ 3.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IVa-g 38 Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIIa-g 50 Sơ đồ 4.2: Phản ứng thế ái nhân acyl 51 Sơ đồ 4.3: Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-g từ ester 51 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ là bệnh khó có thể điều trị khỏi mặc dù đã có những tiến bộ vƣợt bậc trong y học trong hai thập kỷ qua. Theo ƣớc tính và thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 9 – 10 triệu ngƣời mắc ung thƣ mới và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này. Chỉ tính riêng năm 2012 đã có 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ, đây trở thành căn bệnh gây tử vong nhiều nhất trên Thế giới [51]. Để giảm thiểu tỷ lệ tử vong trong ung thƣ, việc phòng và điều trị ung thƣ đóng vai trò vô cùng quan trọng. Với những tiến bộ trong y học, di truyền học và sinh học phân tử thế kỷ 21, đặc biệt khi tìm ra bản đồ gen ngƣời, điều trị ung thƣ đã có những bƣớc tiến mới trong phẫu thuật, xạ trị, điều trị hóa chất và gần đây nhất là điều trị ung thƣ hƣớng đích. Phƣơng pháp điều trị này có hiệu quả hơn và ít gây độc hơn so với các phƣơng pháp điều trị ung thƣ đã có trƣớc đó. Mục tiêu phân tử trong điều trị ung thƣ hƣớng đích bao gồm các enzym đặc hiệu, protein hoặc thụ thể khác nhau có liên quan đến sự phát triển tế bào ung thƣ, ví dụ nhƣ: proteasome, telomerase, histon deacetylase, hoặc protein kinase,... [12]. Nghiên cứu thuốc điều trị ung thƣ hƣớng đích hiện nay chủ yếu ở giai đoạn tiền lâm sàng, một số đang trong giai đoạn lâm sàng và số ít đã đƣợc FDA phê duyệt đƣa vào điều trị. Trong số đó, histon deacetylase (HDAC) là mục tiêu phân tử đem lại nhiều kết quả khả quan khi nghiên cứu, thiết kế và thử nghiệm lâm sàng các thuốc tác dụng hƣớng ức chế enzym này [5, 8, 33, 50]. Acid suberoylanilid hydroxamic (Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên đã đƣợc FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dƣới da [37]. Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đã đƣợc nghiên cứu và đang đƣa vào thử nghiệm lâm sàng nhƣ NVP-LAQ824, MS-275, cyclodepsipeptid FK-228,... Đáng ngạc nhiên, các chất ức chế HDAC thử nghiệm có hiệu quả điều trị cao và độc tính thấp đối với tế bào lành tính [33], vì thế hiện nay chất ức chế HDAC trở thành mục tiêu hấp dẫn và mang đầy tính khả quan trong công cuộc nghiên cứu tìm ra chất chống ung thƣ của các công ty dƣợc phẩm và các tổ chức chính phủ. 1 Tại Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thiết kế công thức và tổng hợp các chất ức chế HDAC. Trong các chất đã tổng hợp, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế histon deacetylase đã cho thấy có hoạt tính tốt trên tế bào ung thƣ trong thử nghiệm in vitro, đặc biệt là một số dẫy chất mang khung benzothiazol [1, 40, 41], 3-oximisatin [4]. Với mong muốn đem lại nhiều ứng viên lâm sàng để tìm ra thuốc điều trị ung thƣ mới, theo hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase” với mục tiêu: 1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và một số dẫn chất. 2. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro trên một số dòng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc. 2 Chƣơ g 1. TỔNG QUAN 1.2. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.2.1. Khái niệm HDAC Histon – một phần của cấu trúc nhiễm sắc thể, là các protein cơ bản giàu acid amin nhƣ lysine, arginin, đƣợc chia thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4) [26]. Các cặp histon lõi (H2A, H2B và H3, H4) có 2 phần quan trọng: đuôi C nằm bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom. Phần đầu N tận của histon, đặc biệt H3, H4 là nơi diễn ra rất nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã nhƣ acetyl hóa/deacetyl hóa lysin, methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và ubiquinin, sumoyl hóa lysin [52]. Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo nucleosom [52] Histon có thể tồn tại ở một trong hai dạng đối lập nhau là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa. Các enzym đóng vai trò trong sự chuyển đổi này là histon acetyl transferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [13, 50]. Histon acetyl transeferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến liên kết với nhóm ε-amino của lysine ở phần đầu N của histon, sự chuyển đổi này xảy ra nhiều hơn trên histon H3 và H4. Sự acetyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dƣơng của phần đầu N của histon, do vậy làm giảm ái 3 lực của histon với phần điện tích âm trên ADN [45]. Ngƣợc lại, histon deacetylase (HDAC) xúc tác việc loại bỏ nhóm acetyl của lysin ở phần đầu N của histon, dẫn đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã [18]. 1.1.2. Phân loại HDAC HDAC đƣợc bảo tồn trong quá trình tiến hóa và biểu hiện trong tổ chức của các sinh vật từ đơn bào nguyên thủy cho tới loài ngƣời. Hiện nay, 18 HDAC đƣợc tìm thấy và chia thành 4 nhóm: I, II, III và IV [13, 35]. HDAC nhóm I, II, IV là những enzym phụ thuộc Zn2+ và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn2+ [50], khác với các HDAC nhóm III có cơ chế hoạt động phụ thuộc cofactor NAD+. Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn2+ là coenzym của các HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống. Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau. Trên miệng túi có 1 vành nhỏ đƣợc tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein, phần vành này sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC [25, 49]. Hình 1.2. Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV [25] (Ion Zn2+ biểu thị là hình tròn màu tím) HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không histon cũng bị ảnh hƣởng bởi hoạt tính của các HDAC. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC “kinh điển” nhóm I, II và IV [9] – mục tiêu phân tử mà các nghiên cứu điều trị ung thƣ hƣớng đích đang tiến hƣớng đến. 4 1.1.3. Mối liên quan giữa u g thƣ và sự hoạt động bất thƣờng của HDAC Hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới quá trình acetyl hóa histon. Do đó, sự mất cân bằng trong hoạt động của enzym này có thể dẫn tới những thay đổi trong cấu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào điều khiển chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào, do đó dẫn đến ung thƣ [13]. Sự gia tăng bất thƣờng của HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 đƣợc quan sát trong một số bệnh ung thƣ tạng đặc nhƣ ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ dạ dày, trực tràng, ung thƣ vú và ung thƣ não cũng nhƣ các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B) và bệnh u lympho da tế bào T. Việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein nhƣ p53, GATA1, GATA2, E2F, Rb, Bc16, Gli1,… liên quan đến xu hƣớng gây ung thƣ và tiến triển của bệnh ung thƣ đã khẳng định vai trò của HDAC trong ung thƣ [16], chúng có liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chƣơng trình trình kể cả sự xâm lấn, sự di chuyển và sự tạo mạch [20, 28, 48, 50]. Hình 1.3. Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ [50] Nhƣ vậy ức chế quá trình phiên mã đƣợc điều hòa bởi sự gia tăng HDAC và có thể kiểm soát ung thƣ bằng cách ức chế hoạt động của HDAC, chính điều này đã mở ra tƣơng lai mới hứa hẹn hơn cho điều trị ung thƣ hƣớng đích. 5 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs) 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC Trichostatin (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên có tác dụng ức chế trực tiếp HDAC đƣợc Yoshida và cộng sự phát hiện ra năm 1990 với tác dụng chống nấm. Sau đó, dựa vào những hiểu biết về mối liên quan giữa HDAC và ung thƣ đồng thời xác định đƣợc cấu trúc 3D của các HDAC, một số dẫn chất ức chế HDAC đã đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung thƣ [36]. Năm 2006 và 2009, SAHA (Vorinostat®, Merck) và Depsipeptid (Istodax®, Celgene) đã đƣợc FDA cấp phép dùng trong điều trị u lympho tế bào T dƣới da. Cho tới nay, nhiều HDACIs đƣợc tìm thấy có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với cấu trúc đa dạng. Dựa vào những cấu trúc hóa học này, HDACIs đƣợc chia thành 5 nhóm: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton (bảng 1.1). Mỗi nhóm HDACIs có những hạn chế riêng.Các acid hydroxamic là những chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC. Các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế. Dẫn chất ceton dễ bị khử hóa trong huyết tƣơng. Trong khi các peptid vòng có cấu trúc phức tạp, khó tạo thành về mặt hóa học, gây ra sự chảy máu khó chữa và FK-228 trong cấu trúc có một phần liên kết với ion Zn2+ có chứa lƣu huỳnh không mong muốn [24]. Khi nghiên cứu về hoạt tính của HDACIs trên các HDAC kinh điển, các nhà khoa học nhận thấy hoạt tính sinh học của các HDACIs phụ thuộc vào khả năng liên kết với túi enzym và khả năng tạo phức với ion Zn2+ ở phần đáy kênh của các chất này. Do HDAC đƣợc bảo vệ trong túi enzym, hầu hết các HDACIs đều không thể ức chế chọn lọc riêng một HDAC nào, chúng có thể ức chế tất cả các HDAC hoặc ức chế đồng thời nhiều thành viên HDAC khác nhau (bảng 1.2). 6 Chất Bảng 1.1.Phân loại các chất ức chế HDAC [18] Cấu trúc Chất Cấu trúc Các acid hydroxamic O TSA (Trichostatin A) O O NHOH Oxamflatin NHOH H N O S N O Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) OH O H N NHOH O H N NVP-LAQ824 NHOH N O HN O CBHA (Acid mcarboxycinnamic bishydroxamid) Acid sulfonamid hydroxamic Scriptaid Peptid vòng O Depsipeptid (FK-228) HN O CH3 O H N NH S S CH3 CH3 H3C O HN O CH3 O Acipidin CHAP Benzamid O MS-275 O N H H N NH2 N CI-994 O Các acid béo O Acid valproic Phenyl butyrat OH Các dẫn chất ceton Trifluoromethyl ceton Alphacetoamid 7 ONa O Bảng 1.2. Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV [50] Nhóm I HDAC10 HDAC11 nd nd nd NVP-LAQ824 nd nd nd Panbinostat nd nd nd Belinostat nd nd nd nd Chất ức chế không chọn lọc Depsipeptid nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd Apicidin Valproic acid nd Trapoxin nd nd SB-429201 nd Bispyridinum diene nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd SHI-1:2 R306465 nd SB-379278A nd nd PCI-34051 Cpd2 nd nd APHA derivaties nd nd nd Tubacin nd nd nd NCT-10a/14a Ghi chú: nd nd MGCD0103 Mercaptoacetamide HDAC6 Vorinostat (SAHA) nd HDAC9 nd MS-275 HDAC7 nd nd HDAC5 HDAC4 HDAC8 HDAC3 HDAC2 HDAC1 nd PCI-24781 Chất ức chế nhóm I Nhóm IV TSA HDACIs Chất ức chế nhóm II Nhóm II B Nhóm II A nd nd nd Ức chế mạnh Ức chế yếu nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd Không ức chế nd: không có dữ liệu công bố Trong số các HDACIs, nhiều chất đang đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng pha I, II hoặc III trên các đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ máu, ung thƣ thể rắn hoặc ung thƣ các cơ quan khác trong cơ thể nhƣ: Phenyl butyrate, SAHA, LAQ824, Acid valproic, PXD101, ITF-2357, Depsipeptid, MS275, CI-994, Pyroxamid,… [36]. Những dữ liệu bƣớc đầu của các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, HDACIs có hiệu quả tốt trong điều trị ung thƣ và độc tính thấp đối với các tế bào lành tính. Các 8