Tài liệu Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học một số dẫn chất n - hydroxypropenamid mang khung 3- methoxyimino -2 - oxoindolin

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ------ TRẦN THỊ THANH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG 3-METHOXYIMINO-2-OXOINDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ------ TRẦN THỊ THANH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG 3-METHOXYIMINO-2-OXOINDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. GS.TS. Nguyễn Hải Nam 2. TS. Phương Thiện Thương Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Những dòng đầu tiên của khóa luận, em xin đƣợc dành để gửi lời cảm ơn tới thầy cô và các bạn, những ngƣời đã đồng hành và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành khóa luận. Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: - GS.TS. Nguyễn Hải Nam: Ngƣời thầy giáo đã truyền cho em cảm hứng và đam mê với nghiên cứu khoa học, và trực tiếp hƣớng dẫn, dìu dắt, hỗ trợ em trong suốt quá trình học tập, và nghiên cứu tại ộ môn óa ƣợc - TS. Phương Thiện Thương: Ngƣời thầy giáo đã giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận này - DS. Đỗ Thị Mai Dung: Ngƣời cô giáo đã chỉ bảo, hỗ trợ, hƣớng dẫn tận tình giúp em thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này. - Cùng toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của bộ môn dƣợc trƣờng Đại học ƣợc à Nội và Khoa óa - Đại học Khoa học tự nhiên Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Chungbuk - óa à ƣợc - Đại học Quốc gia àn Quốc đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện để em thực hiện khóa luận tại Bộ Môn Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, thầy cô giáo Khoa công nghiệp óa ƣợc và bạn bè đặc biệt là các bạn trong nhóm thực nghiệm Bộ Môn ƣợc, các bạn lớp M2K65 đã luôn quan tâm, chia sẻ vui buồn và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. à Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Thanh MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ IỆU, CÁC C Ữ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC ẢNG DANH MỤC CÁC ÌN VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2 1 1 1 Định nghĩa histon deacetylase (HDAC) 2 1.1.2. iston deacetylase và ung thƣ 3 1 2 CÁC C ẤT ỨC CHẾ HDAC 4 1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 4 1.2.1 1 Các chất ức chế C thúc đ y biệt hóa tế bào ung thƣ 4 1.2.1 2 Các chất ức chế C gián tiếp gây chết theo chu trình 5 1.2.1 3 Các chất ức chế C ức chế sự tạo mạch 6 1.2.2 Phân loại các chất ức chế C đang thử nghiệm lâm sàng 7 1 2 3 Liên quan cấu trúc và tác dụng 1 2 3 1 Cấu trúc của các chất ức chế 8 C 8 1.2.3.2. Liên quan cấu trúc và tác dụng của các acid hydroxamic ức chế 1.3. MỘT SỐ NG IÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC CI C 10 Y ROX MIC ỨC CHẾ 10 C TRÊN T Ế GIỚI V VIỆT N M 1 3 1 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt PXD101 1 3 2 Các chất ức chế 10 C do nhóm nghiên cứu bộ môn óa dƣợc, trƣờng đại 13 học ƣợc à Nội thiết kế và nghiên cứu 1 4 CÁC P ƢƠNG P ÁP TỔNG ỢP CI Y ROX MIC 14 1 4 1 Tổng hợp acid hydroxamic t acid carboxylic 14 1 4 2 Tổng hợp acid hydroxamic t ester 15 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2 1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16 211 óa chất 16 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 16 2.2. NỘI UNG NG IÊN CỨU 16 2.2.1. Tổng hợp hóa học 16 2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp đƣợc 16 2 3 P ƢƠNG P ÁP NG IÊN CỨU 16 2.3.1. Tổng hợp hóa học 17 2.3.2. Thử tác dụng sinh học 18 2 3 3 Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc 20 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 31 21 Ó ỌC 3.1.1. Tổng hợp hóa học 21 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 29 3 1 3 Xác định cấu trúc 30 3.2. THỬ HOẠT TÍN SIN HỌC 35 3.2.1. Thử hoạt tính sinh học 35 3 2 2 Đánh giá mức độ giống thuốc 35 33 N LUẬN 36 3.3.1. Tổng hợp hóa học 36 3.3.2. Hoạt tính sinh học 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 T I LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AML : Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy AML-ETO : Protein gây tăng sinh APL : Ung thƣ bạch cầu APAF1 : Yếu tố hoạt hóa protease CBHA : Carboxy cinnamic acid bis-hydroxamic CD : Receptor gây chết tế bào nội tại DCM : Dicloromethan DMF : Dimethylformamid MeOH : Methanol MHC : Phức hợp tƣơng thích mô chính ROS : Gốc oxy tự do hoạt động R Rα : Receptor của acid retinoic SPB : SulforhodamineB SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic TOnc : Nhiệt độ nóng chảy VEGF : Yếu tố gây phát triển màng trong mao mạch WAF1 : Chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng STT 1 Bảng 1.1: Các chất ức chế 2 Bảng 1.2: Kết quả thử tác dụng ức chế Trang C đang thử nghiệm trên lâm sàng C và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất đã công bố 3 Bảng 1.3: Kết quả thử tác dụng ức chế 11 C của một số dẫn chất 12 IIa, IIb, IIc, IId 4 Bảng 1.4: Kết quả thử hoạt tính kháng ung thƣ của các acid hydroxamic mang khung 3-methoxyimino-2-oxoindolin 5 7 14 Bảng 3.1: Chỉ số lí hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic t ester 29 6 Bảng 3.2: Giá trị Rf và Tonc của các chất 4a-d 30 7 Bảng 3.3: Số liệu phổ IR của 4a-d 31 8 Bảng 3.4: Số liệu phổ khối lƣợng của các chất 4a-d 32 9 Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 4a-d 33 10 Bảng 3.6: Số liệu phổ 13C-NMR của các chất 4a-d 34 11 Bảng 3.7: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 4a-d theo quy 35 tắc Lipinsky 12 Bảng 3.8: So sánh kết quả ức chế 13 Bảng 3.9: Kết quả thử độc tính tế bào của các chất tổng hợp đƣợc 14 Bảng 3.10: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 2 dãy 4a, 4b, 4d và IIIa, IIIb, IIId C của 4a-d với S 37 38 40 DANH MỤC CÁC H NH V Tên hình vẽ STT 1 Hình 1.1: Cấu trúc nucleosom 2 Hình 1.2: Quá trình deacetyl hóa nhờ Trang 2 C và quá trình acetyl hóa 3 nhờ HAT 3 Hình 1.3: Cấu trúc cơ bản của các chất ức chế 4 Hình 1.4: Sự có mặt của cấu trúc cần thiết trong các chất acid hydroxamic ức chế C 8 9 C đã thử nghiệm trên lâm sàng 5 Hình 1.5: Cấu trúc các dẫn chất acid indol - hydroxamic đã công bố 11 6 Hình 1.6: Công thức tổng quát dãy dẫn chất N-hydroxy-3-(4-(5- 12 aryl/arylalkyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)acrylamid và N-hydroxy-3(4-(5-aryl/arylalkyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl)benzamid 7 Hình 3.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất 4a-d 37 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ ồ Trang 1 Sơ ồ 1.1: Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic t ester với 15 xúc tác N O và dung môi MeO 2 Sơ ồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 21 3 Sơ ồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất 2a 21 4 Sơ ồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất 3a 22 5 Sơ ồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất 4a 23 6 Sơ ồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất 4b 25 7 Sơ ồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất 4c 26 8 Sơ ồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất 4d 28 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, nhờ những tiến bộ trong di truyền học và sinh học phân tử cộng với sự ra đời của bản đồ gen đã giúp các nhà khoa học hiểu biết sâu sắc về khối u cấp độ phân tử nên việc nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thƣ theo phƣơng pháp thiết kế công thức dựa trên đích tác dụng phân tử ngày càng đạt đƣợc nhiều thành tựu iston deacetylase C là một trong những đích tác dụng phân tử đƣợc chú hiện nay Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006), depsipeptid (Romidepsin®, 2009), belinostat (Beleodaq®, PXD101, 2014 là 3 chất ức chế C đã đƣợc Cục quản lí thực ph m và dƣợc ph m M phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T đã chứng tỏ US- C là đích lựa chọn khả quan [10]. ội nhập với xu hƣớng nghiên cứu và tìm kiếm chất ức chế tính kháng ung thƣ tốt, nhóm nghiên cứu tại bộ môn ƣợc chế óa C có hoạt ƣợc trƣờng Đại học à Nội c ng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất định hƣớng ức C cho hoạt tính kháng tế bào ung thƣ tốt. Trong luận văn thạc sĩ của ƣợc sĩ Lê Thị Thảo đã thiết kế và tổng hợp dãy acid hydroxamic mang khung 3(methoxyimino)-2-oxoindolin cho kết quả khả quan Trên cơ s nghiên cứu trên và mới đây nhất, belinostat (PXD101) đã chứng minh hiệu quả và đƣợc công nhận, chúng tôi tiến hành thay thế nhóm nhận diện bề mặt của PXD101 với khung 3methoxyimino-2-oxoindolin và tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học một số dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung 3-methoxyimino-2oxoindolin” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp N-hydroxy-3-[4-[{3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl}methyl] phenyl]propenamid và 3 dẫn chất 2. Thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các chất tổng hợp đƣợc. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) Toàn bộ bộ gen của con ngƣời đƣợc gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức hợp đại phân tử protein-ADN. Đơn vị cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom. Một nucleosom điển hình bao gồm một octamer hình đĩa của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với 2 và 2 cặp của H3 với 4 đƣợc quấn quanh b i 146 cặp nucleotid [19,24,33] hình 1.1). uôi histon Cầu nối ADN Lõi histon (147bp ADN) uôi histon Hình 1.1: Cấu trúc của nucleosom Đầu amin của histon mang nhiều điện tích dƣơng nên tƣơng tác mạnh với đầu phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể, quy định quá trình biểu hiện gen. Khi histon tích điện dƣơng lớn, tƣơng tác này mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, làm ức chế sự biểu hiện gen Ngƣợc lại khi tƣơng tác điện tích này yếu, nhiễm sắc thể tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính gen biểu hiện thông qua các tính trạng. Mức độ tích điện dƣơng của histon phụ thuộc vào quá trình acetyl hóa đầu amin histon liên quan đến hoạt động của 2 enzym histondeacetylase phần đuôi của C và histon acetyltransferase (HAT). 1.1.1.Định nghĩa histon deacetylase (HDAC) Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại nhóm acetyl t ε-N-acetyl lysin amino acid của histon. Nó có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT)- enzym xúc tác vận chuyển nhóm acetyl t acetyl coenzym 3 đến ε-amino của lysin đầu N của histon C xúc tác việc loại bỏ nhóm acetyl của lysin của phần đầu N của histon, dẫn đến NST bị đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã [33] (hình 1 2). Hình 1.2: Quá trình deacetyl hóa nhờ HDAC và quá trình acetyl hóa nhờ HAT 1.1.2. Histon deacetylase (HDAC) và ung thƣ T xúc tác cho phản ứng acetyl hóa nhóm ε-NH2 trong phân tử lysin phần đuôi của histon làm trung hòa cực dƣơng trên lysin và giúp tháo xoắn cấu trúc của nucleosom, giúp nhân tố sao mã dễ dàng tiếp cận phiên mã Ngƣợc lại, các N, hoạt hóa quá trình C xúc tác loại bỏ nhóm acetyl t histon và protein không phải histon, làm tăng tích điện dƣơng trên đầu N của histon và đóng xoắn nhiễm sắc thể, làm ngăn cản các nhân tố sao mã tiến đến đích của chúng trên N, làm ức chế quá trình phiên mã Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân hình thành khối u [1,26]. C còn liên quan tới nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu trình chết tế bào, sự biệt hóa tế bào, sự chết tế bào theo chƣơng trình, sự xâm lấn tạo mạch và sự di chuyển. Vậy có thể kiểm soát ung thƣ b ng cách ức chế hoạt động của C, và đây chính là một trong những mục tiêu phân tử cho chiến lƣợc điều trị ung thƣ đã và đang đƣợc các nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới nhắm đến với đích đến là tìm ra chất có tác dụng ức chế chọn lọc t ng loại C. 4 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1. Cơ chế t c dụng c a c c chất c chế HDAC (HDACi) Tác dụng chống ung thƣ của các Ci bắt nguồn t khả năng tác dụng lên nhiều giai đoạn quan trọng trong chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính ơn nữa các Ci tác dụng chọn lọc trên tế bào ác tính có thể do Ci làm tăng sinh yếu tố ROS reactive oxygen species - gốc tự do oxy hóa [14]. Các Ci tác động tới tế bào ung thƣ theo ba cơ chế chủ yếu:  Thúc đ y sự biệt hóa tế bào ung thƣ  Thúc đ y sự chết tế bào theo chƣơng trình.  Ci hoạt hóa phiên mã các yếu tố tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch đối với các tế bào ung thƣ, ức chế sự tạo mạch của khối u, ngăn cản r rệt sự phát triển khối u ban đầu và sự di căn 1.2.1.1. C c chất c chế HDAC th c y sự biệt h a tế bào ung thƣ: Khi sử dụng đơn độc, các chất ức chế C có thể ức chế chu trình tế bào khiến cho nhiều loại tế bào ung thƣ bạch cầu và u rắn khác nhau phải thể hiện tính biệt hóa và ng ng tăng sinh tế bào Các nghiên cứu có chu trình tế bào của tế bào ung thƣ đã đƣợc tiếp xúc với nghĩa thống kê cho thấy Ci thƣờng d ng pha G1, đôi khi lại tích tụ trong tế bào đến pha G2 của chu trình tế bào [1,20,23]. Trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp PL , các chất ức chế C có thể hiệp đồng tác dụng với acid retinoic để thúc đ y sự biệt hóa in vitro và in vivo của protein gây ung thƣ nhƣ PLZ -RARα Sự biệt hóa tế bào tủy phụ thuộc vào R Rα receptor acid retinoic hoạt hóa quá trình phiên mã và các protein gây ung thƣ PLZF-RARα cản tr chƣơng trình biệt hóa bình thƣờng Quá trình tƣơng tự có thể xảy ra trong bệnh bạch cầu tủy bào cấp các protein gắn kết ML Các Ci ức chế chức năng của ML1- TO và T L- ML1, khôi phục sự nhạy cảm của các tế bào ác tính với acid retinoic Thêm vào đó, các Ci có thể gây biệt hóa nhiều loại tế bào và các hiện tƣợng phân tử liên quan tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn chƣa đƣợc sáng tỏ [22]. 5 ầu hết các chất ức chất ức chế C có khả năng hoạt hóa quá trình phiên mã gây ra b i chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin cyclin - dependent kinase inhibitor , là W W 1 còn gọi là CIP1, p21; đƣợc mã hóa b i vị trí gen C KN1 1 có thể ức chế cyclin bào thiếu hụt C KN1 - C K2 và cyclin với các - C K2 Sự tiếp xúc của các tế Ci dẫn đến tích tụ các tế bào có N đa bội và làm cho các tế bào này nhạy cảm với sự chết tế bào Sự phối hợp hoạt động của cyclin, các C K cyclin-dependent kinase , những chất ức chế C K và các thành viên R retinoblastoma protein rất cần thiết cho sự biệt hóa của nhiều hệ thống Sau khi tiếp xúc với ch p Ci, các tế bào ung thƣ d ng lại pha G1 để sao N, sau đó đi vào sự chết tế bào Một số trƣờng hợp, một số tế bào ung thƣ lại tích tụ đến điểm kiểm soát G2 (G2 checkpoint), vị trí mà tại đó chu trình tế bào tạm thời d ng lại, chờ đến khi các điều kiện tr nên phù hợp thì chu trình lại tiếp tục Những tế bào bình thƣờng trải qua điểm kiểm soát G2 và tiếp tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thƣ tái tạo N thành dạng N đa bội 4n N và chuyển sang giai đoạn gây chết tế bào theo chƣơng trình Tuy nhiên cơ chế phân tử để chất ức chế C thúc đ y G2 checkpoint vẫn chƣa biết r 1.2.1.2. C c chất c chế HDAC gi n tiếp g y sự chết tế bào theo chƣơng trình Sự chết tế bào là một chƣơng trình sinh lí của tế bào để kiểm soát số lƣợng các tế bào bình thƣờng trong suốt quá trình phát triển iện nay đã xác định đƣợc hai con đƣờng gây chết tế bào và cả hai con đƣờng đều có sự tham gia của các enzym cystein protease các caspase [1,22,15]. Con đƣờng thứ nhất đƣợc hoạt hóa b i các receptor gọi là các deathreceptor nhƣ C 95, receptor TN tumour-necrosis factor và receptor TR IL (TNF-related apotosis-inducing ligand). Các yếu tố này khi gắn với các phối tử bắt đầu hoạt hóa các caspase gần màng tế bào caspase-8 và -10 Các caspase này sau đó sẽ hoạt hóa các caspase kích thích caspase-3 và -7 và dẫn đến sự chết tế bào Con đƣờng thứ hai cần có sự phá vỡ màng ty thể, gián tiếp giải phóng cytochrome C, các protein hỗ trợ sự chết tế bào khác nhƣ SM C second mitochondria-derived activator of caspase , I LO the TR 2 high temperature 6 requirement 2 và yếu tố thúc đ y sự chết tế bào I và sự hoạt hóa caspase-9 thông qua yếu tố hoạt hóa protease gây chết tế bào P 1 Sự toàn v n của màng ty thể đƣợc kiểm soát b i các protein trong họ protein CL2 bao gồm các protein hỗ trợ sự chết tế bào BCL- X, K và các protein kháng lại sự chết tế bào CL2, ) [1,20]. Các chất ức chế C đƣợc ghi nhận có khả năng hoạt hóa các receptor gây chết tế bào và quá trình gây chết tế bào nội sinh Nhƣ trƣờng hợp apicidin và C có thể kích thích biểu hiện của C 95 và gốc kết hợp CD95 (CD95L). Tuy nhiên butyrat làm cho tế bào nhạy cảm với sự chết tế bào gián tiếp b i C 95 mà không thúc đ y sự phiên mã của gốc kết hợp hay receptor epsipeptid ức chế sự biểu hiện C 95L sau khi hoạt hóa tế bào T và ngăn cản sự chết tế bào T sau đó Vì vậy, quá trình death- receptor có thể quan trọng cho sự chết tế bào gây ra b i các chất ức chế C, phụ thuộc vào loại tế bào và nhóm chất ức chế C đƣợc sử dụng Việc biểu hiện quá mức của CL2 yếu tố ngăn cản quá trình chết tế bào nội sinh trong khi quá trình death - receptor còn nguyên v n cùng với khả năng ức chế sự chết tế bào gián tiếp b i Ci cho thấy tầm quan trọng của các quá trình nội sinh đối với vai trò của các Ci Các chất ức chế chết tế bào không kèm theo hoạt hóa caspase S C có thể vẫn gây ra sự hoạt hóa quá trình chết tế bào nội sinh b ng cách thúc đ y bẻ gãy liên kết và hoạt hóa chất chủ vận sự chết tế bào tƣơng tác với hoạt động ROS 3 I , dẫn đến sự phá vỡ màng ty thể và tạo thành các dạng oxy Ngƣợc lại, các chất ức chế ROS ngăn cản sự chết tế bào do SAHA. 1.2.1.3. C c chất c chế HDAC c chế sự tạo mạch Các chất ức chế C có thể hoạt hóa phức hợp hòa hợp mô M C nhóm I và II liên quan đến phiên mã, những phân tử đồng kích thích C 40, C 80 và C 86, phân tử gắn vào khoảng gian bào IC M1, và các interferon loại I và II, nh m làm tăng sự nhận dạng và hoạt hóa của các tế bào miễn dịch ơn nữa, sự phát triển và sống sót của ung thƣ tạng đặc phát triển nhanh đòi hỏi sự hình thành mạch trong khối u để duy trì cung cấp liên tục oxy và chất dinh dƣỡng Trichostatin 7 TS có thể ức chế sự biểu hiện giảm oxy mô của yếu tố phát triển màng trong mạch máu V G và ngăn cản sự tạo mạch cả in vitro và in vivo. Sự kích thích đáp ứng miễn dịch và sự ức chế hình thành mạch khối u có thể ngăn chặn sự phát triển của các khối u lớn và ngăn cản sự di căn 1.2.2. Ph n loại c c chất c chế HDAC ang ƣợc thử nghiệm l m sàng Các chất ức chế C đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng để sử dụng trong điều trị ung thƣ có thể đƣợc chia làm 4 nhóm dựa trên cấu trúc [1,31]: - Các acid hydroxamic: panobinostat, belinostat, givinostat - Các peptid vòng: depsipeptid,… - Các acid b o mạch ngắn: phenylbutyrat, valproic acid,… - Các benzamid: entinostat, mocetinostat, chidamide II... Mỗi nhóm trên đều có những hạn chế nhất định nhƣ: các acid hydroxamic bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc lên các loại enzym C; các benzamid và acid b o có hiệu lực k m; các peptid vòng khó tạo thành về mặt hóa học Các nhóm khác nhau có tác dụng ức chế các loại acid ức chế mạnh mạnh C khác nhau: các hydroxamic C nhóm I và II, các acid carboxylic và peptid vòng ức chế C nhóm I 14 chất của 4 nhóm ức chế C đang đƣợc chú hiện nay và đang đƣợc thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị ung thƣ cụ thể trình bày trong bảng 1.1). Bảng 1.1 Các chất ức chế C đang thử nghiệm trên lâm sàng Nh m Hợp chất Pha Loại ung thƣ Acid b o mạch ngắn Acid hydroxamic AN-9 (tiền thuốc) I, II Tạng đặc, NSCLC Acid valproic I, II Tạng đặc, ung thƣ máu, ML, M S, u lympho T da, u trung biểu mô Phenyl butyrate II Vorinostat (SAHA) I, II Tạng đặc, AML/MDS Tạng đặc ung thƣ gan, ung thƣ vú, ung thƣ đƣờng tiêu hóa, ung thƣ phổi , CTCL, u lympho Hodgkin 8 Practinostat (SB-939) C c benzamid Peptid vòng I Tạng đặc, ung thƣ tuyến tiền liệt Belinostat (PXD101) II U biểu mô tuyến ức, u nguyên bào lympho, u biểu mô phúc mạc, u buồng trứng, u ống dẫn trứng Panobinostat (LBH-589) III Tạng đặc, u lympho T tại da, MDS, ALL Givinostat (ITF-2357) II U lympho phát Quisinostat (JNJ-16241199) I U lympho T tại da Romidepsin (4SC-201) I, II U lympho Hodgkin Chidamide (CS055) II Tạng đặc, u lympho Mocetinostat (MGCD01030) II Tạng đặc, ung thƣ bạch cầu Entinostat (MS275) II Tạng đặc, u lympho, ung thƣ da Romidepsin I, II ML, odgkin, u tủy xƣơng tái Tạng đặc, u lympho không phải Hodgkin Ghi chú: AML: ung thư bạch cầu tủy bào cấp; MDS: hội chứng loạn sản tủy; CTCL: u lympho da tế bào T; ALL: ung thư bạch cầu cấp. 1.2.3. Liên quan giữa cấu tr c và t c dụng 1.2.3.1. Cấu tr c c a c c chất c chế HDAC Hình 1.3: Cấu trúc cơ bản của các chất ức chế HDAC Cấu trúc chung của các chất ức chế C gồm 3 phần chính [23] hình 1.3): - Nhóm khóa hoạt động capping group hay vùng nhận diện bề mặt (surface recognition group) (A): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thƣờng n m trên bề mặt enzym. 9 - Vùng cầu nối sơ nƣớc (B): thƣờng là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hay vòng, có thể no hoặc không no để tạo các liên kết Van der Waals với kênh enzym - Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG) (C): tƣơng tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các C nhƣ acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton... Cấu trúc tinh thể kết tinh của các C cho thấy nhóm kết thúc, cầu nối và một phần của nhóm khóa hoạt động n m trong túi enzym làm lấp đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động tƣơng tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Nhóm nhận diện bề mặt có thể liên kết với phần cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dƣợc động học cho các chất ức chế HDAC. Việc nghiên cứu thiết kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này nhƣ hình 1 4 [17]. Hình 1.4: Sự có mặt của cấu trúc cần thiết trong các chất acid hydroxamic ức chế HDAC đã thử nghiệm trên lâm sàng. Ghi chú: A: Nhóm nhận diện bề mặt; B: Nhóm cầu nối; C: Nhóm liên kết với Zn2+ 10 1.2.3.2. Liên quan cấu tr c t c dụng c a c c acid hydroxamic c chế HDAC Cấu trúc của nhóm chất này c ng gồm 3 phần chính có liên quan đến tác dụng nhƣ sau [22]: - Nhóm khóa hoạt động (A): liên quan đến tính đặc hiệu và hiệu lực ức chế enzym C, thƣờng là các aryl, các nghiên cứu về các chất tổng hợp đƣợc cho thấy kích thƣớc vòng nhân thơm lớn sẽ cho tác dụng tốt hơn vòng nhỏ. - Cầu nối sơ nƣớc (B): liên quan đến khả năng ức chế enzym, quyết định sự phù hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài của kênh enzym Phần này thƣờng có cấu trúc amid - alkyl, là các hydrocarbon mạch h hoặc các vòng thơm có kích thƣớc nhỏ. Trong cầu nối liên kết amid là quan trọng nhƣng không phải là then chốt, độ dài mạch carbon tối ƣu là 5 - 6C. - Nhóm liên kết với Zn2+ (C): acid hydroxamic, là phần không thể thiếu để có tác dụng ức chế HDAC. 1.3. MỘT SỐ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN TOÀN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM . . . Tha i nhóm nh n iện m P D :  Hướng tổng hợp dãy các dẫn chất acid indol - hydroxamic: Nhóm các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã thiết kế thay thế nhóm nhận diện bề mặt của PXD 101, tổng hợp dãy các dẫn chất acid indol - hydroxamic và đƣợc công bố năm 2014 [20] nhƣ hình 1 5. 11 Hình 1.5. Cấu trúc các dẫn chất acid indol - hydroxamic đã công bố Bảng 1.2. Kết quả thử tác dụng ức chế H C và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất đã công bố 1 IC50 ± SD (µM) Chất 2 a HDAC KB H460b PC3c HCT116d 0,48 ± 0,02 0,75 ± 0,10 0,82 ± 0,11 1,74 ± 0,31 0,61 ± 0,03 SAHA 0,51 ± 0,03 2,92 ± 0,15 3,01 ± 0,25 4,01 ± 0,22 2,47 ±0,03 Ia 0,23 ± 0,11 1,26 ± 0,28 1,21 ± 0,24 3,21 ± 0,54 1,12 ± 0,03 Ib 0,50 ± 0,09 1,83 ± 0,41 2,79 ± 0,54 3,36 ± 0,58 3,34 ± 0,44 Ic 0,48 ± 0,04 0,61 ± 0,21 0,56 ± 0,11 1,11 ± 0,06 1,21 ± 0,17 Id 0,56 ± 0,04 1,24 ± 0,34 1,67 ± 0,34 1,97 ± 0,29 1,92 ± 0,44 Ie 0,10 ± 0,05 0,76 ± 0,23 0,57 ± 0,01 1,63 ± 0,41 0,39 ± 0,02 If 0,24 ± 0,11 0,87 ± 0,07 0,91 ± 0,06 1,24 ± 0,18 1,01 ± 0,04 Ig 0,60 ± 0,09 1,29 ± 0,18 1,82 ± 0,01 4,11 ± 0,43 2,04 ± 2,28 Ih 0,85 ± 0,11 1,52 ± 0,12 1,98 ± 0,16 3,64 ± 0,67 1,73 ± 0,29 Ik Ghi chú: 1Nồng độ (µM) làm ức chế 50% sự phát triển của tế bào (các kết quả được lấy trung bình qua 3 lần thử nghiệm với độ sai lệch không quá 10%),2 HDAC của nhân tế bào ung thư cổ tử cung, aung thư biểu mô, bung thư phổi, c ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, dung thư đại tràng. Sau khi tiến hành thử khả năng ức chế các chất công bố đã cho kết quả ức chế trên C, trong các loạt dẫn chất trên, C tốt và gây độc tính trên tế bào ung thƣ biểu mô, ung thƣ phổi, ung thƣ biểu mô tuyến tiền liệt, ung thƣ đại tràng. Đặc biệt chất (E)-3-(3-((1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-1-yl)sulfonyl)phenyl)-N-hydroxy acrylamid (If) với nhóm khóa hoạt động 7-azaindol đã cho kết quả chống tăng sinh tế bào ung thƣ biểu mô, ung thƣ phổi, ung thƣ biểu mô tuyến tiền liệt, ung thƣ đại tràng rất tốt. Nghiên cứu dƣợc lí đã chỉ ra r ng chất If có tác đụng ức chế HDAC với IC50 0,1µM Ngoài ra nó có tác dụng chọn lọc trên C6 gấp 5 lần chất ACY-1215 đang đƣợc thử nghiệm trên lâm sàng. Chất If đã đƣợc thử invivo trên chuột vào cho kết quả khả quan với sinh khả dụng đƣờng uống 33% trong khi SAHA 8,33% Và đƣợc đánh giá là chất 7-azaindolylsulfonylcinnamic hydroxamat (If) đầy tiềm năng để phát triển thuốc chống ung thƣ với khả năng ức chế chọn lọc