Tài liệu Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin as-48 của vi khuẩn enterococcus faecium trong tế bào

Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỞ ĐẦU Hàng năm, trên thế giới và Việt Nam, các vụ ngộ độc thực phẩm không ngừng gia tăng. Nguyên nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm được xác định là do vi sinh vật gây bệnh và các yếu tố độc (độc tố nấm hay thuốc trừ sâu có trong rau quả...). Các vi sinh vật gây bệnh đều có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt trong các loại thực phẩm như thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản và các sản phẩm sữa. Ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và tính mạng con người, đồng thời gây tác động không nhỏ đến nền kinh tế, chính trị của mỗi quốc gia. Chính vì thế, vấn đề bảo quản lương thực, thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong chính sách kinh tế, sức khỏe cộng đồng của mỗi quốc gia, đặc biệt là bảo quản tránh khỏi các vi sinh vật gây bệnh. Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp bảo quản thực phẩm truyền thống (bảo quản theo phương pháp hóa học, vật lý), các nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu, ứng dụng chất bảo quản sinh học không độc hại gọi chung là bacteriocin. Đây là các peptit có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt an toàn, không gây tác dụng phụ khi sử dụng do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong đường tiêu hóa ở người. Nhiều bacteriocin đã được nghiên cứu nhưng hiện nay mới có nisin và pediocin PA-1/AcH được thương mại hóa, sử dụng trong công nghệ thực phẩm dưới dạng bột. Do đó, việc nghiên cứu và tìm ra các bacteriocin an toàn, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là rất cần thiết. Enterocin là các bacteriocin được tạo ra từ chi vi khuẩn Enterococcus rất phong phú và đa dạng, có những đặc tính đáng quan tâm trong chế biến, bảo quản thực phẩm. Điển hình là enterocin AS48 - mét bacteriocin cấu trúc dạng vòng, có phổ ức chế rộng cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Những đặc trưng khác của AS-48 như tính ổn định, bền nhiệt và tính tan tiêu biểu trong phạm vi pH rộng (thích hợp với nhiều loại thực phẩm) hứa hẹn là sự lùa chọn thay thế cho các chất bảo quản hóa học trong tương lai. Từ tính ưu việt của enterocin, đặc biệt là enterocin AS-48 trong bảo quản nhiều loại thực phẩm, các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm thu lượng lớn peptit Page 1 of 96 1 Luận văn Thạc sĩ Sinh học này với mong muốn sử dụng thành thương phẩm. Vấn đề gặp phải là các chủng vi khuẩn Enterococcus có khả năng sinh enterocin thường tiết ra độc tè. Việc lên men và thu hồi sản phẩm theo tiêu chuẩn sạch để có thể sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn và đạt hiệu suất thấp. Do đó, việc tập trung nghiên cứu tạo enterocin tái tổ hợp không những khắc phục hạn chế trên mà còn chủ động được nguồn enterocin. Enterocin AS-48 hoàn toàn có thể được tổng hợp bằng con đường tái tổ hợp khi biết trình tự ADN của gen mã hóa cho AS-48 mà không cần phải phân lập từ các chủng tự nhiên. Như vậy, enterocin AS-48 có thể được tổng hợp với hiệu suất cao bằng con đường tái tổ hợp nhờ vi khuẩn E. coli. Từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin AS-48 của vi khuẩn Enterococcus faecium trong tế bào Escherichia coli ER2566” nhằm mục đích tổng hợp enterocin AS-48 tái tổ hợp để ứng dụng làm chất bảo quản nông sản, thực phẩm sinh học. Công trình này được thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Page 2 of 96 2 Luận văn Thạc sĩ Sinh học CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 1.1.1. Giới thiệu chung 1.1.1.1. Ngộ độc thực phẩm Mặc dù con người đã sử dụng những công nghệ bảo quản thùc phẩm mới và an toàn (ví dụ: HACCP - hệ thống kiểm soát rủi ro về vệ sinh an toàn thực phẩm mang tính phòng ngõa) trong chế biến và bảo quản nhưng các ca ngộ độc thực phẩm vẫn không ngừng gia tăng Error! Reference source not found.. Các hóa chất, kim loại nặng, ký sinh trùng, nấm, virus và vi khuẩn đều có thể gây ngộ độc thực phẩm. Trong đó, vi khuẩn là nguyên nhân phổ biến nhất với hơn 90% các ca ngộ độc thực phẩm hàng năm, chủ yếu do Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và Escherichia coli O157:H7 6, Error! Reference source not found.. Trường hợp nhẹ là những hậu quả về rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức, trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị kịp thời, đúng cách. Do đó, an toàn thực phẩm luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mỗi quốc gia mà trọng tâm là bảo quản thực phẩm phòng tránh các vi sinh vật gây bệnh 6. Theo uỷ ban Khoa học và Công nghệ Hoa Kỳ, ước tính hàng năm nước này có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây ra 5000 ca tử vong. Thực phẩm chính là thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản và các sản phẩm sữa, tiêu tốn từ 6,5-34,9 tỷ đô la Error! Reference source not found.. Các mầm bệnh thực phẩm như Listeria spp. có khả năng chịu nhiệt độ thấp và nồng độ muối cao, gây ra hơn 2500 vụ ngộ độc thực phẩm với 500 ca tử vong chỉ riêng ở Hoa Kỳ 12. Ở Việt Nam, hàng năm cũng có hàng nghìn ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn thất về sức khỏe và kinh tế. Trong năm 2008, tính đến tháng 7, đã có 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 người mắc và 43 người đã bị tử Page 3 of 96 3 Luận văn Thạc sĩ Sinh học vong. Bởi vậy, những chất bảo quản thực phẩm an toàn là vô cùng quan trọng 1, 12. Cùng với sự gia tăng nhu cầu về những thực phẩm tự nhiên và an toàn hơn, con người cần những công nghệ bảo quản mới để ngăn ngõa sự hư háng và nhiễm độc thực phẩm. Các cách truyền thống đã được thay thế bởi những công nghệ mới, cải tiến như khử trùng nhẹ bằng nhiệt, giảm không khí, đóng gói chân không, áp suất thuỷ tĩnh cao, chiếu tia tử ngoại và sử dụng chất kháng khuẩn tự nhiên - các bacteriocin 6, Error! Reference source not found.. Việc sử dụng bacteriocin một mình hoặc kết hợp với xử lý hoá lý và chất bảo quản hoá học có thể là biện pháp hiệu quả để đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng của nguyên liệu thô và thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản, kìm hãm vi khuẩn làm háng, gây bệnh 2. 1.1.1.2. Bacteriocin Bacteriocin được Gratia phát hiện lần đầu tiên năm 1925 với tên là principe V bắt nguồn từ một chủng E. coli có khả năng chống lại các chủng E. coli khác trong cùng môi trường nuôi cấy. Thuật ngữ “colicin” do Gratia và Fredericq đặt ra năm 1946. Ngày nay, colicin được dùng cho protein kháng khuẩn từ các loài E. coli và có quan hệ gần với Enterobacteriaceae Error! Reference source not found.. Năm 1953, Jacob và CS. đã đặt tên cho các protein có hoạt tính kháng khuẩn đặc hiệu cao là bacteriocin. Thuật ngữ bacteriocin được giải thích đơn giản. Tương tự “ase” sử dụng trong enzyme, tiếp tố “cin” dùng để biểu thị hoạt tính tạo bacteriocin. Tiếp tố “cin” được viết thêm vào tên chi (hay đúng hơn là tên loài). Colicin được phân lập đầu tiên từ E. coli, monocins từ L. monocytogenes, subtilin được tạo ra bởi Bacillus subtilis, staphylocin từ S. aureus và nhiều loại khác. Các chữ cái theo thứ tù tìm ra được viết sau tên bacteriocin để phân biệt với bacteriocin duy nhất từ chủng khác cùng loài. Ví dụ, lactacin F là bacteriocin thứ 6 được tìm ra từ loài Lactobacilli 34. Page 4 of 96 4 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trong tự nhiên, vi sinh vật có khả năng tạo ra các hợp chất khác nhau nhằm hạn chế hoặc chống lại các vi sinh vật khác 44, 60. Các hợp chất này được biết đến như kháng sinh, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp như axit lactic, các yếu tố phân giải như lysozym, các dạng exotoxin protein và bacteriocin. Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian... Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp 69. Họ bacteriocin gồm các protein đa dạng về mặt kích thước, vi khuẩn đích, dạng hoạt động và cơ chế miễn dịch. Hiện nay, có hàng trăm loại bacteriocin. Những bacteriocin này được tìm thấy trong hầu hết các vi khuẩn, gần đây còn tìm thấy trong vi khuẩn cổ - Archaea (gọi là các Archaeocin) 60. Nhiều nghiên cứu được tiến hành với bacteriocin trên các loài vi khuẩn khác nhau cho thấy chúng được mã hóa bởi các gen trên plasmid (ví dô, Col plasmid trong E. coli). Mét số được mã hóa bởi các gen nằm trên ADN hệ gen, như plantaracin A và sakacina 674, trong khi có trường hợp được xác định trên các transposon như nisin 69. Vì cũng có hoạt tính kháng khuẩn nên trước đây, bacteriocin bị nhầm lẫn như là “các chất kháng sinh”. Năm 1965, Reeves và CS. đã tìm ra sự khác biệt của bacteriocin với các chất kháng sinh bởi đặc điểm đặc trưng: Bacteriocin có bản chất là protein. Chính sự khác biệt này đã tạo nên đặc tính ưu việt của bacteriocin trong ứng dụng bảo quản thực phẩm 34. Sù tranh luận nên được đặt vào bối cảnh khám phá ra nisin năm 1924, trước cả penicillin và colicin. Khi đó những chất kháng khuẩn protein bị xem là các chất kháng sinh. Chất kháng sinh được tạo ra bởi một nhóm hạn chế vi sinh vật, là sản phẩm trao đổi chất bậc hai. Các chất này không có chức năng rõ ràng trong sinh trưởng và sinh sản của bản thân vi khuẩn, được tiết dễ dàng ra khỏi tế bào 60. Khi khám phá ra trong cấu trúc nisin có chứa một số axit amin hiếm như dehydroalanin, dehydrobuterin và cầu lanthion sulfur đơn, nisin không được xem là Page 5 of 96 5 Luận văn Thạc sĩ Sinh học một protein bởi riboxom không tạo những axit amin này (kÓ cả những chất tương đồng với nisin như subtilin và epidermin). Chỉ đến khi Hansen và CS. (1990) phát hiện ra rằng, nisin thực tế được tạo ra bởi riboxom qua quá trình khử nước các axit amin và sự hình thành cầu lanthion diễn ra sau dịch mã, nisin mới được công nhận là một bacteriocin. Sự có mặt của các gen riêng rẽ trong tổng hợp bacteriocin xác nhận rằng chúng là protein peptit thực sự. Như vậy, bacteriocin được phân biệt để tránh sự nhầm lẫn và liên quan tới chất kháng sinh y học - có thể gây dị ứng bị cấm sử dụng trong thực phẩm đối với con người. Đặc điểm khác biệt chính là: Bacteriocin được tổng hợp trong riboxom, không phải là các chất chuyển hóa. Do có bản chất protein (thử nghiệm với các enzyme phân giải protein như trypsin, chymotrypsin và pepsin) 4 nên bacteriocin không gây tác dụng phụ do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong đường tiêu hóa ở người. Bacteriocin có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp, được tiết vào môi trường để ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn hay bào tử, đôi khi tiêu diệt các vi khuẩn quan hệ gần gũi với chủng sản xuất. Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin. Các bacteriocin có dạng hoạt động kháng khuẩn khác với kháng sinh. Các đặc điểm trên được tổng kết trong bảng 1 12, Error! Reference source not found. . Bảng 1. Sù khác nhau giữa bacteriocin và kháng sinh Các đặc điểm Bacteriocins Các kháng sinh Ứng dông Thực phẩm Y học Tổng hợp Riboxom (sản phẩm chuyển hóa bậc 1) Sản phẩm chuyển hóa bậc 2 Hoạt tính Phổ hẹp Phổ rộng Miễn dịch tế bào chủ Có Không Sự có mặt của các tế bào Có mặt Vắng mặt miễn dịch trong tế bào chủ Page 6 of 96 6 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Dạng hoạt động Hầu hết qua sự hình thành lỗ nhưng đôi Màng tế bào hay các khi cũng tác động lên sự tổng hợp sinh đích nội bào học thành tế bào Ảnh hưởng độc lên tế bào Không Có nhân chuẩn 1.1.2. Phân loại bacteriocin Có nhiều tiêu chuẩn phân loại bacteriocin: Theo đặc điểm cấu trúc, khối lượng phân tử, phổ kháng khuẩn, sinh vật sản xuất... 56, 59. Riley và CS. (2007) đã chia bacteriocin thành hai nhóm lớn theo vi khuẩn gram dương và gram âm. Bacteriocin của vi khuẩn gram dương phong phú và đa dạng hơn ở vi khuẩn gram âm. Chúng phân biệt với bacteriocin gram âm theo hai cơ sở. Thứ nhất, quá trình tạo bacteriocin không cần sự giết chết bản thân nó như ở vi khuẩn gram âm. Đây là do cơ chế vận chuyển, giải phóng bacteriocin ở vi khuẩn gram dương. Một số tham gia vào hệ thống vận chuyển đặc hiệu bacteriocin, trong khi một số khác tham gia vào con đường vận chuyển phô thuộc chuỗi tín hiệu (signal sequences dependent export pathway). Thứ hai, vi khuẩn gram dương tạo quá trình điều hòa đặc hiệu bacteriocin, trong khi các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm chỉ phụ thuộc vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ 60. 1.1.2.1. Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm Các bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn gram âm là những protein kích thước lớn. Hơn 30 loại bacteriocin từ E. coli đã được xác định. Tuy nhiên, đến nay các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng. Những hiểu biết này rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần thể vi khuẩn trong môi trường tự nhiên mà còn để giải quyết vấn đề ứng dông 60. Page 7 of 96 7 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Đại diện tiêu biểu cho bacteriocin từ vi khuẩn gram âm là colicin với phổ kháng khuẩn hẹp và hoạt động thông qua tương tác với thụ thể đặc hiệu màng ngoài của tế bào đích. Colicin có các cụm gen phân bố trên các plasmid và được sắp xếp thành gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và bất hoạt protein gây độc) và gen phân giải mã hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng colicin thông qua phân giải tế bào chủ 12, 60. Sù tạo colicin được thông qua đơn vị điều hòa SOS (SOS regulon - là một dạng phản ứng của vi khuẩn với sự hư hại ADN, trong đó, các gen lexA và recA có vai trò chủ chốt giúp điều hòa chuỗi phản ứng SOS) 35, 73 và do đó, nã được tạo ra chủ yếu dưới những điều kiện ức chế. Colicin tiêu diệt vi khuẩn qua các cơ chế khác nhau, bằng cách ngăn chặn tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm của màng tế bào đích do sự hình thành lỗ hay hoạt hoá hoạt động của nuclease 60. Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram âm Các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm được đặt tên theo chi, loài sản xuất, như klebicin của Klebsiella pneumoniae hay theo loài như colicin của E. coli, marcescin của Serratia marcescens, alveicins của Hafnia alvei và cloacins của Enterobacter cloacae) 60. Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm có thể được phân thành ba nhóm dùa vào kích thước: Nhóm 1 - Colicin kích thước lớn (25-80 kDa), nhóm 2 - Các microcin kích thước nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3 - Bacteriocin như phần đuôi của phage gồm các đơn vị lắp ghép peptit. Trong đó, microcin là những peptit khối lượng phân tử thấp không cảm ứng SOS, có cấu trúc tương tự bacteriocin líp II của vi khuẩn gram dương, được tổng hợp trong pha cân bằng 42. Bacteriocin như đuôi phage là các nuclease và protease kháng vi khuẩn que, tiêu diệt tế bào nhạy cảm bởi sự khử cực màng. Chúng là những phage thiếu sót hay có nguồn gốc từ phage với chức năng như bacteriocin. Ví dô: Pyocin R2 (từ Pseudomonas spp.) là một phần thừa của phage P2 trong khi pyocin F2 tương tự như phage  60. Page 8 of 96 8 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 1.1.2.2. Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương Nisin là đại điện được nghiên cứu sớm nhất trong các bacteriocin vi khuẩn gram dương. Đây là lantibiotic được tạo ra từ Lactococcus lactis spp. gọi là “các chất ức chế nhóm N” 59. Hầu hết bacteriocin từ vi khuẩn gram dương là các peptit nhá, mang điện dương, kỵ nước hay lưỡng tính và thường không có thụ thể nhận biết đặc hiệu trên màng tế bào (trừ một số trường hợp ngoại lệ). Các bacteriocin này khác nhau ở dạng giải phóng, vận chuyển trong tế bào và sự phân cắt trình tự dẫn đầu trong quá trình chế biến tạo phân tử trưởng thành 56, 60. Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram dương Nhiều nhà khoa học phân loại bacteriocin từ vi khuẩn gram dương theo các líp có một số điểm khác nhau. Dùa trên các kết quả của Klaenhammer et al. 1993, Kemperman et al. (2003a), Cotter et al. (2005b) … bacteriocin từ vi khuẩn gram dương được chia thành bốn líp theo hình 1: Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương Lớp I: các lantibiotic Loại mạch dài A: dài Lớp II: các nonlantibiotic, Mr bé (<10 kDa) Lớp III: các protein Mr lớn (>10 kDa) Lớp IV: các peptit vòng Loại C: đa thành phần Loại B: hình cầu Phân lớp IIa: như pediocin IIc: còn lại IIIa: các lysin IIIb: không phân giải IIb: đa thành phần AI: như nisin AII: như SA-FF22 Hình 1. Sơ đồ phân loại các bacteriocin từ vi khuẩn gram dương Page 9 of 96 9 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Líp I - Các lantibiotic (từ lanthionin - chứa antibiotic) là các peptit bền nhiệt, tác động lên cấu trúc màng (<5 kDa), chứa các axit amin hiếm, bị biến đổi sau dịch mã như lanthionin (Lan), -methyllanthion, -methyl lanthionin (MeLan), dehydroalanin và dehydrobutyrin. Líp I còn được phân nhỏ hơn thành các lantibiotic loại A, B, C theo cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng khuẩn.  Lantibiotic loại A là các peptit có cấu trúc mạch thẳng kéo dài và linh động. Loại A được phân thành hai phân loại AI và AII dùa trên kích thước, sự tích điện và trình tự peptit dẫn đầu. Ví dụ: nisin thuộc phân loại AI, streptococcin A-FF22 (SA-FF22) tạo ra bởi S. pyogenes chủng FF22 thuộc phân loại AII.  Lantibiotic loại B là các peptit có hình cầu và kém linh động so với loại A, thường không mang điện hay mang điện âm ở pH trung tính. Hoạt động kháng khuẩn dùa trên sự can thiệp những phản ứng enzyme thiết yếu của các tế bào nhạy cảm. Mersacidin đại diện cho loại này là peptit gồm 20 axit amin.  Lantibiotic loại C là các lantibiotic đa thành phần, chủ yếu cấu tạo gồm hai peptit biến đổi sau dịch mã. Trong đó, mỗi peptit có một Ýt hay không có hoạt tính kháng khuẩn nhưng chúng có vai trò điều phối, nghĩa là chỉ khi kết hợp hai peptit mới tạo phân tử bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn. Ví dụ lactacin 3147 từ Lactococcus lactis DP3147 gồm hai peptit LtnA1 và LtnA2 34. Líp II - Bacteriocin <10kDa gồm các bacteriocin peptit đa dạng về khối lượng phân tử, bền nhiệt và chứa các axit amin thông thường (non-lantibiotic). Đây là líp được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhất 60. Những peptit này được chia thành ba phân líp là:  Phân líp IIa gồm các bacteriocin với cấu trúc tương tù nh- pediocin- có một trình tự liên ứng đầu N của bacteriocin hoàn chỉnh - Tyr-Gly-Asn-Gly-ValXaa-Cys. Phân líp này được tập trung nghiên cứu nhiều do hoạt tính diệt mầm bệnh L. monocytogenes hiệu quả. Ví dụ: pediocin PA-1, mét peptit 44 axit amin từ Pediococcus acidilactici 17 . Page 10 of 96 10 Luận văn Thạc sĩ Sinh học  Phân líp IIb là bacteriocin nhiều thành phần cũng tương tù nh- ở lantibiotic loại C. Ví dụ, lactococcin G từ L. lactis. Mặc dù rất hiếm gặp nhưng cũng có những bacteriocin ba hay bốn thành phần. Ví dụ : SLUSH -hemolysin từ Staphylococcus lugdunensis, là bacteriocin ba peptit; aureocin A70 từ S. aureus gồm bốn peptit.  Phân líp IIc là các bacteriocin còn lại của líp này nh- bacteriocin tiết ra bởi con đường phụ thuộc chuỗi tín hiệu. Ví dô : Sakacin Q. Líp III - Bacteriocin kích thước lớn >10kDa là các protein không bền nhiệt, trừ propionicin SM1 từ Propinonibacterium jensenii. Do đó, lớp này Ýt được ứng dụng trong thực phẩm 60. Có thể chia thành hai phân líp, đầu tiên là bacteriolysin (các enzyme bacteriolytic) tiêu diệt các chủng nhạy cảm bằng cách phân giải tế bào, ví dụ : lysostaphin từ Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Phân líp thứ hai là các protein kháng khuẩn không phân giải, phải kể đến đầu tiên là helveticin J, mét bacteriocin 37 kDa từ Lactobacillus helveticus. Lớp IV - Các bacteriocin vòng là líp đặc biệt gồm các bacteriocin có cấu tróc vòng (Bảng 2). Đây là các peptit được biến đổi sau dịch mã bằng liên kết cộng hoá trị nội phân tử tạo cấu trúc vòng cho peptit trưởng thành. Đến nay, líp này gồm một số thành viên nh- enterocin AS-48, circularin A, gassericin A … được tổng kết ở bảng 2 60, 63. Bảng 2. Các bacteriocin vòng tạo ra từ vi khuẩn gram dương Bacteriocin Nguồn gốc Kích thước (axit amin) Đặc điểm đặc trưng 1. Enterocin AS48 Enterococcus faecalis 70 - Dạng chuẩn và là bacteriocin vòng biết rõ nhất cả về hóa sinh và di truyền 2. Gassericin A Lactobacillus gasseri LA39 58 - Bacteriocin vòng đầu tiên được báo cáo chứa hỗn hợp D và L-axit amin (ít nhất D-Ala) 3. Reutericin 6 Lactobacillus reuteri LA6 58 - Trình tự axit amin bậc nhất tương tự như gassericin A nhưng khác biệt ở phổ ức chế do thành phần thay đổi DAla (tỷ lệ của D-Ala:L-Ala) Page 11 of 96 11 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 4. Circularin A Clostridium beijerinckii ATCC 25752 69 - Có quá trình cải biến sau dịch mã khác thường; locus gen (cir) chứa các gen cùng nguồn gốc với các gen được tìm thấy trong locus của as-48 5. Butyrivibriocin AR10 Butyrivibrio fibrisolvens AR10 58 - Bacteriocin vòng đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn dạ cỏ, tương đồng 45% với gassericin A 6. Uberolysin Streptococcus uberis 42 70 - Từ chi Streptococcus, đáng chó ý do tính không bền nhiệt và chỉ phân giải các tế bào sinh trưởng nhanh 7. Acidocin B Lactobacillus acidophilus M46 58 - Bacteriocin có trình tự tương tự gassericin A, gen mã hóa (acdB) ở trên một plasmid của chủng sản xuất 8. Subtilosin A Bacillus subtilis 35 - Bacteriocin vòng mang điện âm, tác động lên cả vi khuẩn gram dương và gram âm, đáng chú ý ở khả năng chống chịu các điều kiện ức chế 1.1.3. Ứng dụng của bacteriocin Đối với vi sinh vật, bacteriocin là phương thức để cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống giữa các loài, giúp cân bằng sinh thái vi sinh vật 69. Đối với con người, bacteriocin còng có vai trò quan trọng. Những ứng dụng tiềm năng của bacteriocin gồm: 1.1.3.1. Bảo quản sinh học thực phẩm Trước đây bảo quản thực phẩm dùa trên việc sử dụng các chất phụ gia tổng hợp hóa học. Điều này khiến người tiêu dùng lo ngại do những ảnh hưởng có hại đến sức khỏe. Bảo quản sinh học thực phẩm với việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng (giống bảo vệ) hay các sản phẩm trao đổi của chúng (chất bảo quản sinh học) để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn là giải pháp có nhiều tiềm năng 56. Ưu điểm của bacteriocin trong bảo quản sinh học thực phẩm là tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hư háng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng như những xử lý nhiệt khắt khe. Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dưỡng và vitamin, cung cấp những thực phẩm mới (ít axit, hàm lượng muối thấp và hàm lượng nước cao) Page 12 of 96 12 Luận văn Thạc sĩ Sinh học thỏa mãn nhu cầu công nghiệp và người tiêu dùng Error! Reference source not found., 44. Mét xu hướng trong công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu là hạn chế sử dụng chất phụ gia và thành phần nhân tạo, hạn chế sự chế biến nhưng phải đảm bảo an toàn, giữ nguyên chất lượng. Những yêu cầu này có thể được đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin 30, 34. Bacteriocin có các đặc điểm lý tưởng trong bảo quản sinh học thực phẩm. Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng. Các bacteriocin được xem là hợp chất an toàn do bị phân giải như những protein khác trong thức ăn 56. Bacteriocin không mùi, không màu, không vị, ảnh hưởng không đáng kể lên khu hệ vi sinh vật đường ruột, có phổ kháng khuẩn tương đối rộng lên nhiều mầm bệnh và vi khuẩn gây háng thực phẩm 30. Mét sè bacteriocin cho thấy hiệu quả bổ trợ khi sử dụng phối hợp với các yếu tố kháng khuẩn khác như hợp chất phenolic tự nhiên cũng như những protein kháng khuẩn khác. Sự kết hợp các bacteriocin khác nhau có thể giúp ngăn ngõa sự phát triển của những chủng kháng. Ngoài ra, sự kết hợp bacteriocin với xử lý vật lý như áp suất cao hay xung điện trường giúp bảo quản thực phẩm hiệu quả hơn, nhất là đối với những dạng có khả năng sống sót cao như vi khuẩn sinh bào tử. Tính hiệu quả của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm và cấu trúc, cũng như vi khuẩn thực phẩm. Thực phẩm phải được xem như là hệ sinh thái mà các tương tác vi khuẩn có thể ảnh hưởng lớn đến cân bằng vi sinh vật và sự phát triển những vi khuẩn có lợi hay gây hại. Do đó, cần xác định hiệu quả của bacteriocin cho mỗi hệ thống thực phẩm 34. Các bacteriocin được sử dụng trong bảo quản sinh học thực phẩm dưới ba dạng chính: 12. - Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic - LAB: Lactic axit bacteria) để tạo bacteriocin in situ. Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định. - Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm. Page 13 of 96 13 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm Error! Reference source not found.. Một lùa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng màng polythen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm 12. 1.1.3.2. Các sản phẩm chăm sóc sức khỏe Do nisin có khả năng ức chế phổ rộng các vi khuẩn gram dương nên được sử dụng trong ngăn ngõa chứng viêm vú ở gia súc. Hiện nay, mutacin từ cầu khuẩn thuộc các chủng của Streptococcus mutans biến đổi di truyền được sử dụng trong sản phẩm chăm sóc sức khỏe răng miệng như kem đánh răng, nước súc miệng để ức chế sâu răng và cao răng. Bacteriocin có trong xà phòng, mỹ phẩm giúp loại trừ mụn, trứng cá 34, 52. Các bacteriocin gần đây cũng được ứng dụng trong lĩnh vực y tế. Do vi sinh vật đang tăng dần tính kháng kháng sinh nên các liệu pháp trong điều trị chống lại bệnh nhiễm trùng sẽ trở nên vô hiệu. Bacteriocin có thể là một giải pháp cho trình trạng này, giúp điều trị nhiễm trùng da cục bộ hay nhiễm trùng kháng đa thuốc 56. Chóng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn với ưu điểm: Sản phẩm tự nhiên, từ “vi khuẩn tốt” và không có rủi ro nhiễm bệnh hay các vấn đề khác. Các chủng probiotic và các chủng tạo bacteriocin có khả năng bảo vệ đường tiêu hóa chống lại vi khuẩn gây bệnh 12, 34. 1.1.3.3. Các giống khởi động Giống khởi động (Starter cultures) là các sản phẩm công nghiệp mà bản thân tế bào vi sinh vật được sử dụng làm nguyên liệu cấy. Thông thường giống khởi động là hỗn hợp các loài vi sinh vật có vai trò tạo màu, tạo mùi thơm đặc trưng, làm giảm độ pH, ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn có hại trong thực phẩm. Khi sử dụng như là một giống khởi động, chủng sinh bacteriocin phải thực hiện lên men tối ưu, ngoài ra phải tạo lượng bacteriocin đủ khả năng bảo vệ. Ở mét số trường hợp, Page 14 of 96 14 Luận văn Thạc sĩ Sinh học sự tạo bacteriocin có thể giúp tăng tính cạnh tranh và ổn định giống nhưng không được can thiệp đến chức năng của giống khởi động ban đầu. Do đó, giống khởi động phải kháng với bacteriocin. Chúng được tạo ra qua quá trình chọn lọc các thể đột biến kháng tự nhiên, bằng nuôi cấy phụ lặp lại với việc tăng nồng độ bacteriocin để chọn lọc các giống thích nghi hay bằng biến đổi gen. Ví dụ, sự nuôi cấy một chủng Enterococcus sinh enterocin AS-48 như là giống đồng nuôi cấy kết hợp với một giống khởi động thương mại trong sản xuất phomat không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của giống khởi động hay đặc tính hóa sinh của phomat tạo ra. Đồng thời bacteriocin được tạo ra trong phomat đủ đảm bảo ức chế Bacillus cereus Error! Reference source not found., 34. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp đã tạo ra các giống khởi động tái tổ hợp chứa gen miễn dịch và gen tạo bacteriocin. Các gen này nằm trên một đoạn ADN cụ thể, được cài vào vector nhân dòng và chuyển vào các giống khởi động. Chúng có thể được đưa vào giống khởi động trong sữa và trong sản xuất các thực phẩm lên men khác để ức chế sự sinh trưởng của mầm bệnh in situ và tăng thời hạn sử dụng; vào nấm men để ức chế các vi khuẩn gây háng lactic... 34. 1.1.3.4. Các probiotic Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic tăng lên nhanh chóng. Nhiều sản phẩm probiotic đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng các loại sản phẩm đa dạng như viên bọc, bột, sữa chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác. Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống. Theo đó, probiotic là: “Những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể một lượng đủ lớn sẽ tác động có lợi cho sức khỏe của vật chủ” Error! Reference source not found.. Vi sinh vật sử dụng cho các sản phẩm probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là nhóm LAB). Ví dô, Lactobacillus acidophilus là LAB lên men đồng hình được tìm thấy trong đường tiêu hoá của người và động vật. Chúng được bổ sung vào các sản phẩm sữa lên men thương mại nh- sữa chua acidophilus. Những vi khuẩn này có ảnh hưởng tích cực lên sức khoẻ con người nhờ khả năng sinh bacteriocin - giúp ức Page 15 of 96 15 Luận văn Thạc sĩ Sinh học chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh. Các bacteriocin từ L. acidophilus và L. gasseri có tác dụng kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch, bất hoạt các hợp chất gây đột biến và ung thư tiềm năng, giảm cholesterol trong máu. Probiotic từ LAB hiệu quả trong ngăn ngõa sự rối loạn đường ruột và điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân khác nhau. Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi cạnh tranh với vi sinh vật bản xứ còng nh- hệ vi khuẩn đường ruột gây bệnh 31, 34. 1.1.3.5. Các dấu chuẩn tạo vector tách dòng trong thực phẩm Các gen kháng kháng sinh (kanamycin, erythromycin, tetracyclin,…) được sử dụng phổ biến nh- là dấu chuẩn chọn lọc trong vector tách dòng. Với mục đích khoa học, các gen kháng kháng sinh dùng là dấu chuẩn hữu hiệu cho chọn lọc những thể biến nạp 69, 73. Tuy nhiên, các dấu chuẩn này không được chấp nhận trong thao tác với giống khởi động bởi lo ngại chúng có thể truyền tính kháng kháng sinh vào hệ vi khuẩn đường ruột. Do đó, các gen kháng bacteriocin có thể được sử dông nh- là dấu chuẩn chọn lọc thay thế, tạo vector tách dòng an toàn trong thực phẩm 34. Tương tù nh- dấu chuẩn chọn lọc kháng sinh, chúng có thể được truyền và chọn lọc trong tế bào nhạy cảm với các yếu tố chọn lọc (bacteriocin) hay thiếu khả năng chuyển hóa yếu tố sử dụng chọn lọc (khả năng sử dông hydrat cacbon) 69. Ví dụ, gen miễn dịch lafI kháng lactacin F dùng cho các chủng Lactobacillus - nhạy cảm với lactacin F. Gen miễn dịch ltnI kháng lacticin 3147 từ L. lactis, gen kháng nisin... 69, 73. Page 16 of 96 16 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Thuốc chữa bệnh Đường tiêu hóa của người Các probiotic Tinh sạch LAB Bacteriocin Chất phụ gia (Nisin) Giống khởi động hay đồng nuôi cấy Thực phẩm An toàn và chất lượng thực phẩm Hình 2. Các ứng dụng của bacteriocin 1.1.4. Các bacteriocin thương mại Những năm gần đây, mối quan tâm về tính an toàn và chất lượng của thực phẩm đã thôi thúc các nhà khoa học khám phá và phát triển phương pháp mới trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt là các bacteriocin. Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các bacteriocin trong thực phẩm chủ yếu là trên thí nghiệm. Có thể do yêu cầu khắt khe đối với một sản phẩm bảo quản sinh học an toàn còng nh- những quan điểm trái ngược về những giống khởi động cải biến di truyền trong thực phẩm. Tuy nhiên, khi người tiêu dùng cần những sản phẩm được bảo quản, Ýt bị chế biến, việc sử dụng bacteriocin có thể trở nên phổ biến hơn, nh- là một phương tiện giúp bảo quản thực phẩm “tự nhiên” 20. Dưới đây là một số tiêu chuẩn đặt ra cho sản phẩm bacteiocin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm: -Về tiêu chuẩn an toàn: Chủng sản xuất phải có dạng GRAS (Generally regarded as safe - được đánh giá là những vi sinh vật an toàn), phải được thử nghiệm tính độc, không có rủi ro về sức khỏe qua quá trình xác định các mặt như ảnh hưởng tích lũy, điều phối và tiềm tàng 69. Page 17 of 96 17 Luận văn Thạc sĩ Sinh học -Tính hiệu quả: Bacteriocin phải ức chế sự sinh trưởng lên phổ rộng các mầm bệnh và vi khuẩn gây háng nh- L. monocytogenes và C. botulinum hay có hoạt tính chống lại một mầm bệnh đặc hiệu. Bacteriocin phải bền nhiệt và có hoạt tính cao khi kết hợp trong thực phẩm. Tất nhiên, bacteriocin cũng không được ức chế sinh trưởng của các giống khởi động khác 12, 44. Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin được thương mại là nisin từ Lactococcus lactis và pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chóng đều được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại tương ứng là NisaplinTM, ALTATM 12. Nisin được khám phá ra đầu tiên với mong muốn ứng dụng trong công nghệ trị liệu. Tuy nhiên những nghiên cứu sau đó cho thấy nisin không bền ở pH sinh lý và tính nhạy cảm cao với sự phân hủy của enzyme. Với khả năng ức chế các mầm bệnh (đặc biệt là L. monocytogenes) giúp nisin phù hợp hơn trong công nghiệp thực phẩm. Nisin được thương mại đầu tiên ở Anh năm 1953. Ngày nay, nisin là một sản phẩm được FDA phê chuẩn, được WHO công nhận an toàn 69 và bán dưới dạng bột sấy khô - từ sữa tách bơ qua quá trình lên men. Nisaplin được sử dông hơn 50 nước như là một chất phụ gia thực phẩm, chủ yếu trong chế biến phomat, sản phẩm sữa và thực phẩm đóng hộp 12. Pediocin PA-1 đã được thương mại và kiểm soát bởi một số hãng độc quyền Hoa Kỳ và Châu Âu. Quá trình lên men tạo pediocin PA-1 đã sẵn sằng để thương mại và được sử dụng như là một chất bảo quản thực phẩm Error! Reference source not found.. Các bacteriocin khác như lacticin 3147, enterocin AS-48 hay variacin cũng có nhiều triển vọng. Trong khi đó, các bacteriocin phổ hẹp có thể được dùng trong ức chế lùa chọn đặc hiệu cao với vi khuẩn gây hại nguy hiểm như L. monocytogenes 34. 1.2. ENTEROCIN Page 18 of 96 18 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 1.2.1. Enterocin 1.2.1.1. Giới thiệu enterocin Đa số các chủng của Enterococci có khả năng tạo bacteriocin. Chúng được gọi là các enterocin hay enterococcin và hầu hết thuộc về líp II. Hầu hết các enterocin được tinh chế và xác định di truyền nhiều năm nay đều từ E. faecalis và E. faecium 52. Điều thó vị là enterocin có khả năng chống lại các Enterococci khác, LAB, L. monocytogenes, S. aureus và Clostridium spp. (gồm C. botulinum, C. perfringens và C. tyrobutyricum) 57. Hoạt tính kháng Listeria có thể được giải thích bởi thực tế rằng Enterococci và Listeria có quan hệ gần về mặt phát sinh Error! Reference source not found.. Enterocin có tính bền với nhiệt độ cao và sự dao động pH 26. Enterocin là các peptit nhỏ được tổng hợp trong riboxom, không bị biến đổi sau dịch mã, trừ việc phân cắt peptit dẫn đầu. Những nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để xác định liệu enterocin được mã hóa bởi gen xác định trên ADN hệ gen hay ADN plasmid; xác định các đặc điểm của bacteriocin giúp cho việc tinh sạch, nhân dòng và biểu hiện gen thuận tiện 57. 1.2.1.2. Phân loại enterocin Các enterocin có thể được phân chia thành hai líp chính: Líp I: Lantibiotic với duy nhất một đại diện là cytolysin hai peptit từ E. faecalis 27. Đây là peptit duy nhất được phân lập từ Enterococci với hoạt tính cytolytic (hemolytic-tiêu máu). Cytolysin là một yếu tố độc nên nã không được xem là yếu tố kháng khuẩn. Các gen mã hóa cho cytolysin được tìm thấy không chỉ trong các chủng Enterococcus từ bệnh viện, người bệnh mà còn từ thực phẩm, động vật 42, 52. Líp II gồm các enterocin tương tự với bateriocin từ các chi LAB khác 23, là bacteriocin kích thước nhỏ, mang điện dương, kỵ nước, bền nhiệt. Líp này có thể được chia thành các phân líp 27, 34: Page 19 of 96 19 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phân líp IIa - tương tự pediocin. Chóng bao gồm enterocin A từ E. faecium CTC 492, enterocin CCM 4231 từ E. faecium CCM 4231, enterocin CRL35 từ E. faecium CRL35 và mundticin từ E. mundtii. Nhiều loại E. mundtii khác cũng tạo bacteriocin nhưng cấu trúc của chúng chưa được xác định. Những bacteriocin phân líp IIa này có hoạt tính kháng khuẩn cao, điển hình là Listeria. Đặc biệt, enterocin CRL35 có hoạt tính ức chế thậm chí cả virus Herpes simplex 18, 27. Phân líp IIb là các enterocin gồm hai chuỗi polypeptit. Mét trong hai chuỗi có hoạt tính nhưng cả hai chuỗi đều cần thiết trong sù tạo hoạt tính sinh học đầy đủ 27. Enterocin 1071A và 1071B từ E. faecalis, enterocin L50A và L50B với hoạt động điều phối. Chúng không bị biến đổi sau dịch mã và không cần sự có mặt của một peptit tín hiệu cho quá trình tiết Error! Reference source not found., enterocin I (tương tự enterocin L50A). Phân líp IIc gồm bacteriocin không thuộc các phân líp trên, như enterocin P từ E. faecium P13, bacteriocin 31 từ E. faecalis tiết ra bởi con đường phụ thuộc chuỗi tín hiệu, enterocin Q, enterocin M (một biến thể của enterocin P), enterocin B. Phân líp cuối cùng là bacteriocin vòng với đại diện enterocin AS-48, đây là bacteriocin đầu tiên được tinh sạch từ chi Enterococcus 27, 42, 52, 57, 67. 1.2.2. Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp enterocin: Enterococci 1.2.2.1. Enterococci Enterococci lần đầu tiên được miêu tả bởi Thiercelin năm 1899, là một chi lớn thuộc họ LAB 12, 23. Enterococci gồm các cầu khuẩn gram dương, kỵ khí tùy tiện, thường tồn tại dưới dạng cặp và chuỗi, lên men đồng hình và tạo L(+)LA (axit lactic đồng phân hình học dạng L). Đây là quá trình lên men hydrat cacbon thành axit lactic như là sản phẩm cuối cùng duy nhất, phân biệt với lên men dị hình (axit lactic là sản phẩm chính, ngoài ra còn các sản phẩm phụ như axit axetic, ethanol, CO2, format hay succinat) 12, 59, 67. Enterococci phân bố rất rộng rãi, được tìm Page 20 of 96 20