Tổng hợp N1-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl )-N4-Phenylsuccinamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase

  • Số trang: 87 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 23 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯOfNG THỊ THANH HUYÈN TỔNG HỢP N^-(3-(HYDROXYAMINO)-3OXOPROPYL)-N^-PHENYLSUCCINAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT HƯỚNG ức CHÉ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ • • • Người hướng dẫn: 1. ThS. Đào Thị Kim Oanh 2. DS. Trần Thị Oanh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược I ^ thư HÀ NỘI - LỜI CẢM ƠN Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến PGS. TS Nguyễn H ải Nam, ThS. Đào Thị Kim Oanh, DS. Trần Thị Oanh - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những ngưòi đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa dược - Trưòng Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học KHTN Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và xin cảm ơn sự chỉ bảo dạy dỗ của tất cả các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội trong thời gian học tập tại trưÒTig. Tuy nhiên chỉ thực hiện khóa luận tốt nghiệp trong một thời gian ngắn, nên với tầm hiểu biết hiện có của mình, chắc chắn bài khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong muốn nhận được sự đóng góp, phê bình của các thầy cô và các bạn để bài khóa luận tốt nghiệp được hoàn chỉnh hơn. Cuối cùng Tôi xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn luôn ở bên khích lệ, động viên, giúp đỡ em trong học tập cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 08/05/2011 Sình viên Lương Thị Thanh Huyền DANH MỤC KÝ HIỆU, DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT Ký hiệu - NMR - NMR Chú giải Phổ cộng hưỏrng từ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân GDI 1,1 CHAP Dan chất acid hydroxamic có chứa peptid vòng CTCL ư lympho tế bào T dưới da CTCT Công thức cấu tạo DCM Dicloromethan DMF N,N-dimethylformamid HAT Histon transferase HDAC Enzym histon deacetylase HDACi Các chất ức chế HDAC IC50 Nông độ ức ché 50% IR Phổ hồng ngoại MeOH Methanol MS Phổ khối lượng NST Nhiễm sắc thể TLC Sắc ký lófp mỏng ’-carbonyl diimidazol DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Khả năng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư của 1 số chất ức 1 chế HDAC 16 2 Tổng hợp tính chất lý hóa, R f và hiệu suất của dãy chẩt H1-H4 30 3 Tổng hợp tính chất lý hóa, R f và hiệu suất của dãy chất H elH e4 34 4 Tổng hợp tính chất lý hóa, hiệu suất tổng hợp dãy chất H al-Ha4 39 5 Tông hợp nhiệt độ nóng chảy và R f của các chât từ Hal-H a4 40 6 Phân tích phô hông ngoại dãy chât H1-H4 40 7 Phân tích phô khôi dãy chât H el-H e4 41 8 Phân tích phô hông ngoại dãy chât Hal-H a4 43 9 Phân tích phô khôi dãy chât Hal-H a4 44 10 Ket quả phân tích phổ ’H-NMR của dãy chất H al-Ha4 45 11 Ket quả phân tích phổ *^C-NMR của dãy chất Hal-H a4 46 12 Bảng giá trị IC 50 của dãy chât H al-H a4 49 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1 Câu trúc AND, nucleosom và nhiêm săc thê 3 2 Vai trò cân băng động giữa HD A C và HAT 4 3 Biêu đô mô tả các loại HD A C 6 4 Câu trúc của HDAC7, 8 8 Vị trí hoạt động của HDLP khi có mặt acetyl ly sin histon 5 vàTSA 9 6 Cơ chê phản ứng deacetyl hóa của HD A C 9 7 Công thức một sô chât ức chê HD A C 11 8 Tác dụng chính của các chât ức chê HD A C 15 Công thức cô điên của HD A Ci và vị trí của HD A Ci 9 17 trong túi enzytn HD A C 10 Phản ứng điêu chê SAHA từ methyl suberanilat 20 11 Cơ chê hoạt hóa anhydride băng pyridin 21 12 Cơ chê hoạt hóa acid carboxylic với CDI 21 13 K êt quả phân tích Westen B lot 49 14 So sánh câu trúc 3D của Ha2 và SAHA 50 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................................1 PHẦNI: TỐNG Q U AN .............................................................................................. 3 1.HISTO N .................................................................................................................3 2. HISTON DEACETYLASE..................................................................... 4 2.1. Định nghĩa.........................................................................................................4 2.2. Phân loại............................................................................................................ 5 2.3. Sự phân bố của HD AC..................................................................................... 7 2.4. Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl h ó a................................. 7 2.5. Sự hình thành khối u và vai trò của HD A C .................................................. 10 3. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE............................................ 1 1 3.1. Phân loại.............................................................................................................11 3.1.1. Acid hydroxamic......................................................................................12 3.1.2. Benzamid..................................................................................................12 3.1.3. Acid béo mạch ngắn................................................................................ 13 3.1.4. Peptid vòng...............................................................................................13 3.1.5. Các chất khác........................................................................................... 14 3.2. Cơ chế tác dụng..................................................................................................14 3.2.1. Trên tế bào thường...................................................................................14 3.2.2. Trên tế bào ung th ư ................................................................................. 14 3.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HD A C ............................... 17 3.3.1. Công thức cấu tạo chung của các chất ức chế HD AC.......................... 17 3.3.2. Liên quan giữa cấu trúc - tác dụng ........................................................17 3.3.2.1. Thay đổi nhóm nhận diện bề m ặ t........................................................17 3>3.2.2. Thay đổi phần cầu n ố i.......................................................................... 19 3.3.2.3. Thay đổi nhóm chức tạo chelat với kẽm............................................. 19 4. TỔNG HỢP HÓA H Ọ C ........................................................................................20 4.1. Tổng họp acid hydroxamic............................................................................20 4.2. Acyl hóa amin bằng anhydrid acid................................................................ 20 4.3. Acyl hóa amin bằng acid carboxyclic............................................................ 21 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚXJ........................................................................................................... 2 2 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT B Ị.................................................................... 22 2.1.1. Hóa chất........................................................................................................ 22 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 22 2 .2 . NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u .............................................................................. 23 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu......................................................................23 2.3.1. Tổng họp hóa h ọ c ........................................................................................ 23 2.3.2. Xác định cấu trúc......................................................................................... 23 2.3.3. Thử tác dụng ức chế HDAC và kháng tế bào ung th ư ............................. 24 2.3.3.1. Phân lập histon và Western B lo t.................................................... 24 23.3.2. Thử độc tính tế bào in vitro:............................................................ 25 2.3.4. Đánh giá mối liên quan cấu trúc - tác dụng...............................................26 PHẦN 3: THựC NGIỆM - KẾT QUẢ - BÀN LUẬN...........................................27 3.1. HÓA HỌC........................................................................................................... 27 3.1.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC............................................................................... 27 3.1.1.1. Tổng họp acid 4-oxo-4-(phenylamino)butanoic và dẫn chất (dãy H lH4)........................................................................................................................... 27 3.1.1.2. Tổng hợp methyl 3-(4-oxo-4-(phenylamino)butanamido)propanoat và dẫn chất (dãy He 1-He4)......................................................................................... 31 3.1.1.3. Tổng hợp N'-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N‘^-phenylsuccinamid và dẫn chất (dãy Hal-Ha4).................................................................................... 35 3.1.2. KIỂM TRA Đ ộ TINH KHIẾT CỦA SẢN PH Ẩ M ....................................39 3.1.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚ C..............................................................................40 3.1.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại dãy H 1-H4.......................................40 3.1.3.2. Phổ khối của dãy chất H el-H e4.............................................................. 41 3.1.3.3. Phổ hồng ngoại của dãy chất H al-H a4...................................................42 3.1.3.4. Phổ khối của dãy chất H al-Ha4............................................................. 44 3.1.3.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Hl-NM R của dãy Hal-H a4.................... 44 3.1.3.6. Phổ cộng hưởng từ C13-NMR của dãy H al-H a4................................. 46 3.2. THỬ TÁC DỤNG ức CHẾ HDAC VÀ KHÁNG TẾ BÀO ƯNG THƯ.... 47 3.3. BÀN LU Ậ N ........................................................................................................47 3.3.1. Tổng hợp hóa h ọ c ........................................................................................ 47 3.3.2. Tác dụng ức chế histon deacetylase và độc tính tế bào.............................. 48 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUÁT......................................................................51 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội đang ngày càng phát triển, và một trong những mục tiêu phát triển xã hội là không ngừng cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển tiến bộ của xã hội loài người là sự gia tăng ô nhiễm môi trường, cạn kiệt tài nguyên và đặc biệt là sự xuất hiện và phát triển của nhiều loại bệnh khác nhau. Mô hình bệnh tật của con người càng ngày càng trở nên phức tạp, do đó việc nghiên cửu và phát triển thuốc mới là rất cần thiết. Một trong các bệnh lý đang gia tăng nhanh chóng trong những năm gần đây là ung thư. Hiện nay các thuốc điều trị ung thư đều là các thuốc gây độc tế bào, tác dụng lên cả tế bào ung thư và tế bào thường nên có nhiều tác dụng không mong muốn. Vì vậy xu hướng chính trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới hiện nay là nghiên cứu các thuốc điều trị ung thư với con đường nghiên cứu ngắn nhất là sàng lọc thuốc theo các mục tiêu phân tử như: Histon deacetylase, các protein kinase, telomerase, phosphoinositide-3-kinase (PI3K)... Vai trò của các enzyme histon deacetylase (HDAC) và histon transferase (HAT) trong sự hình thành và phát triển của tế bào ung thư ngày càng được khẳng định. Sự mất cân bằng giữa HDAC và HAT là một trong những nguyên nhân chính hình thành khối u. Do vậy việc nghiên cứu các thuốc ức ché HDAC (HDACi) là một hướng đi quan trọng để phát triển các thuốc kháng ung thư mới. Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA- biệt dược Varinostat, Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da (2006) và tiếp theo đó là Romidepsin (2009). Điều này chứng tỏ tiềm năng mạnh mẽ của các thuốc ức chế HDAC trong điều trị ung thư. Các chất ức chế HDAC có ưu điểm là công thức không phức tạp, dễ tổng hợp đồng thời tác dụng chọn lọc trên tế bào ung thư. Cho đến nay các dẫn chất acid hydroxamic vẫn là nhóm chất được nghiên cứu nhiều nhất trong các chất ức chế HDAC do khả năng ức chế mạnh HDAC với IC50 ở mức nanomol. Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tồng hợp N^-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N*-pĩtenylsuccinamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase^’ với 2 mục tiêu chính: - Tổng họp N ’-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N'*-phenylsuccinamid và một sổ dẫn chất. - Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và độc tính tế bào in vitro của các chất tổng hợp được. PHẦN I: TỒNG QUAN 1. HISTON Nhiễm sắc thể của sinh vật nhân ứiật được cấu tạo từ ADN và các protein khác nhau. Chiều đài của ADN lớn hơn rất nhiều so với chiều dài tế bào, do đó ADN ở ữong tế bào phải tồn tại ở dạng cuộn xoắn quanh lõi protein và liên kết với các protein. Các protein này được chia thành 2 loại: protein histon và các protein không phải histon. Trong đó các histon có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa hoạt tính của ADN. Đom vị cấu trúc cơ bản của NST là các nucleosom, được cấu tạo từ một chuỗi ADN gồm 146 cặp nucleotid quấn quanh 8 phân tử histon: 2H2A, 2H2B, 2H3 ,2H4. Các nucleosome kề nhau được nối với nhau qua một phân tử histon trung gian HI. ^ 'V ^> '.i ^ Ằ / ’ ^ ứ• ^ \ - c*irc”io s o re í :N A he .H r S m I Hiyvly Ccỉ‘-Jtí'ise0 ơ'r^'\a\r 30 H i 1L'tỉ' Linker DNA X ecscrres - 3eads D-' a st'ing NjCi’frDScme Hình 1: cẩu trúcADN, nucleosom và nhiễm sẳc thể Từng cặp histon H2A, H2B, H3, H4 liên kết với nhau tạo thành lõi protein octamer hình đĩa. Chuỗi ADN cuốn quanh lõi protein 2 vòng và được cố định đầu ra đầu vào bởi histon HI. Protein liên kết này có vai trò quan trọng trong quá ữình hình thành các bậc cấu trúc cao hom của NST. Liên kết giữa histon và chuỗi ADN là liên kết phosphodiester giữa phần đuôi amin (mang điện dương) của histon và gốc phosphat (mang điện âm) của ADN. Phần đuôi histon (phần đầu N) là nơi xảy ra nhiều quá trình chuyển hóa khác nhau sau dịch mã (methyl hóa, acetyl hóa, phosphoryl hóa, ubiquitin hóa...) làm thay đổi cấu trúc và chức năng của NST. Trong đó, quá trình acetyl hóa và deacetyl hóa nhóm amin của phân tử lysin cuối cùng trên đuôi histon H3 và H4 có vai frò rất quan trọng trong việc kiểm soát quá trình phiên mã. Tham gia điều hòa cân bằng động giữa 2 quá trình này là 2 enzym histon acetylfransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC): ÍỈAT xúc tác cho phản ứng acetyl hóa đuôi histon, ngăn cản sự methyl hóa histon làm cho ADN tháo xoắn, chuẩn bị cho qua trình phiên mã. Ngược lại quá trình deacetyl hóa histon tạo điều kiện cho sự methyl hóa đuôi lysin, làm cho ADN cuộn xoắn chặt hơn và ngăn cản các yếu tố phiên mã xâm nhập vào ADN, dẫn đến ức chế phiên mã. Nhóm acetyl được lấy từ Acetyl-CoA [11,14]: (DNA méthylation) (Histone deacetylation) (Histone méthylation) — Active chromatin ^ 1 CoA* ^ ậ ệ ĩ Inactive chromatin Hình 2: Vai trò của cân bằng động giữa HDAC và HAT (DMMTs - DNA methyl transferase, HMT- histon methyltransferase, hình tròn màu vàng: nhóm methyl, hình tam giác: nhóm acetyl, hình vuông màu xanh: nhóm methyỉ trên đuôi histone) 2. HISTON DEACETYUVSE 2.1. Định nghĩa Histon deacetylase (HDAC) là nhóm các en2ym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ e-N acetyl lysin amino acid của histon, do đó làm giảm mức độ acetyl hóa NST làm cho NST cuộn xoắn chặt hơn và ức chế phiên mã. Nó có tác dụng đối kháng với histon acetyltransferase (HAT). Hiện nay, HDAC còn được gọi là các chất deacetyl hóa lysin, nhằm mô tả một cách chính xác hơn chức năng của chúng. 2.2. Phân loại Hiện nay có 18 HDAC khác nhau được phát hiện trong cơ thể người, được chia làm 4 nhóm: - Nhóm I: gồm HDAC 1, 2, 3, 8 tương đồng với Rdp3 ở tế bào nấm men S.cerevisiae, có chức năng ức chế phiên mã, chỉ hoạt động khi nằm trong phức hợp protein. Các phức hợp này cần thiết cho sự deacetyl hóa, liên kết HDAC với ADN và là trung gian cho sự thâm nhập của HDAC vào vị trí hoạt hóa gen. Khả năng ức chế phiên mã và sự hình thành phức hợp protein được điều hòa bởi quá trình phosphoryl hóa các HDAC. cấu trúc của HDAC 1 và 2 khá tương đồng với nhau (82%) còn HDAC 8 có cấu trúc gần giống với HDAC 3. - Nhóm II: gồm HDAC 4,5,7,9 (nhóm lia) và HDAC 6,10 (nhóm Ilb) tương đồng với Hdal trong tế bào nấm men. HDAC nhóm II có kích thước phân tử lớn (855-1122 aa) và khác biệt so với HDAC nhóm 1 do có đầu N tham gia vào qua trình ức chế phiên mã. Nhòm này có chứa tín hiệu định vị ngoài nhân NES nên có thể di chuyển từ nhân ra bào tương và ngược lại. + HDAC 4,5,7,9 có cấu trúc tương đồng với nhau và có vùng xúc tác nằm ở đầu c của protein, tham gia ức chế yếu tổ phiên mã myogen MEF2 làm tế bào cơ không phân hóa được. Các HDAC này được vận chuyển qua lại giữa nhân-tế bào chất nhờ liên kết với protein 14-3-3, quá trình này được điều hòa bởi sự phosphoryl hóa HDAC bởi CaMK (calmodulin dependent kinase). + Điểm khác biệt của HDAC 6 và 1o so với nhóm lia là chúng có 2 vùng xúc tác, tuy nhiên HDAC 10 có 1 vùng xúc tác bị bất hoạt. HDAC 6 thể hiện nhiểu chức năng đặc biệt và nghiêng về sự thoái hóa. Nó có vai trò deacetyl hóa a-tubulin, HSP90 (ảnh hưởng đến sự vận động, bám dính của tế bào), smad7... HDAC 10 có khả năng liên kết với HDACl, 2, 3, 4, 5, 7, nhimg không tương tác với HDAC6 và vẫn thể hiện hoạt tính deacetyl hóa khi không tạo phức. cia ss I HDAC1 B Ị HDAC2 60 kDa 482 a.a 488 a.a HDACS 428 a.a HDACS 377 a.a 55 kDa cÌMulióinl -(8,4 kDa \rái?!Óichk -II kDa rìr.uyióinll Class Ha 1084 a.a 119 kDa 1122 a.a 122kDa Vmẹáictk bất ho-ạt (ità HDACÌO Amig Cofled-CoO 8S5 a.a 105 kDa 1011a.a 1 1 1 kDa Class llb Vìbis NLS HDAC6 HDAC10 \’ÌDíg»1Ctác cimiiiiõmR’ — Ì ’■ ■ ■ ■ Ì I ........... lỂÊÊỂ^... Class IV HDAC11 i:"'“".":... 347 a.a ■Ì1215a.a 669a.a 71 lcDa 39 kDa Hình 3: Biểu đồ mô tả các loại HDAC - Nhóm III: nhóm protein điều hòa chuỗi thông tin (Sừtl,2,3,4,5,6,7, tương tự Sừ2 ở tế bào nấm men) Nhóm IV: HDAC 11 (chỉ có ở người), cấu trúc HDAC 11 có phần tương đồng với cả 2 nhóm I và II, có vùng xúc tác ở đầu N của protein. Chưa có nhiều nghiên cứu về các phức hợp chứa HDAC 11. HDAC nhóm III ít được nghiên cứu ở người, nhưng đã được xác định có cơ chế hoạt động phụ thuộc vào cofactor NAD+, khác với HDAC nhóm I, II, IV (HDAC kinh điển) phụ thuộc và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelet vói Zn^^. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC kinh điển [20, 29]. 2.3. Sự phân bố của HDAC Do chỉ có tín hiệu định vị nhân tế bào NLS và không có bộ phận định vị tín hiệu ngoài nhân (NES) nên các HDAC nhóm I chỉ có trong nhân tế bào, trừ HDAC 3 có thể di chuyển ra bào tương nhờ IKBa (chất ức chế di chuyển của NFkB). HDAC nhóm I có ở hầu hết các tế bào. HDAC nhóm II có chứa vùng tín hiệu định vị ngoài nhân NES nên có thể di chuyển tử nhân ra bào tương và ngược lại, trừ HDAC 6 chỉ có ở trong tế bào chất. HDAC nhóm 2 chỉ có ở một số tế bào: HDAC 4,5: Te bào cơ trơn, cơ tim, não HDAC 6 : Thận, gan, tim, tụy. HDAC 7: Cơ trơn, tim, tụy, nhau thai HDAC IC : Lá lách, thận, gan. HDAC9: Cơ trơn, não. - Nhóm IV: HDAC 11 có ở trong nhân, tuy nhiên phức hợp HDAC 11 với HDAC6 lại nằm trong bào tương, chủ yếu có ở tim, cơ trơn, thận, não [29, 32], 2.4. Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa Việc xác định cấu trúc của HDAC là rất cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kể công thức cho các chất ức chế HDAC. Cấu trúc HDAC đầu tiên được công bố là cấu trúc của HDLP (histon deacetylase like protein ở vi khuẩn Aquifex aeolicus, tương đồng 32% với HDACl [30], Từ đó, phương pháp xác định cấu trúc bằng kết tinh tạo tinh thể và chụp X quang được áp dụng để tìm ra cấu trúc tinh thể của các HDAC khác nhau, đặc biệt là trung tâm hoạt động của nó. Tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa tìm ra cấu trúc của HDACl và HDAC6- 2 enzym quan trọng trong nghiên cứu và phát triển các HDACi. cấu trúc của các HDAC khá giống nhau, trung tâm hoạt động của chúng gồm 3 phần chính: ion Zn^"^, kênh enzym dạng túi hình ổng, 2 cặp His-Asp đặc biệt còn gọi là hệ thống chuyển tiếp (charge relay system, ở HDLP là Aspl66 - Hisl31 và Aspl73- His 132, ở HDAC 8 là His 143-Asp 183 và His 142-Asp 176) làm tăng khả năng ái nhân của túi và có thể tham gia tạo liên kết hydro với và cơ chất, ở HDAC nhóm I còn có 1 phân tử Tyr tham gia tạo liên kết Hydro (ở HDAC 8 là Tyr 306, ở HDLP là Tyr 297), trong khi đó ở HDAC nhóm Ila Tyrosữi được thay thế bằng Histidùi [23, 31]. ỉl. b, Hình 4: cẩu trúc của HDAC7 (a, ion lon màu tím), HDACS (b, màu xanh lá) là coenzym của HDAC, nằm ở đáy kênh enzym. Trong phân tử HDAC, có thể tạo 5 liên kết phối trí: 3 liên kết với nguyên tử oxy, nitơ của các acid amin, tạo 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của phân tử acetyl-lysin ở đuôi histon, từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Khi có mặt các chất ức chế HDAC như các acid hydroxamic, ion tạo 2 liên kết phối trí với 2 nguyên tử oxy của nhóm hydroxamic [7, 13]. Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, tạo nhiều liên kết Van der Waals với cơ chất (đuôi lysin của histon/phần cầu nối của HDACi). Túi được cấu tạo từ các acid amin thân dầu: Phe, Tyr, Pro, His. Đáy túi còn có 1 vài phân tử nước làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deactyl hóa và tìiam gia tạo liên kết Hydro khi không có mặt nhóm OH- của Tyr. cấu trúc tủi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau. Bề rộng của túi được giới hạn bởi 2 vòng thơm được tìm thấy trên cùng một vị trí ở nhiều HDAC khác nhau. Trên miệng túi có 1 vành nhỏ được tạo nên tìt 1 vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC) [7, 13, 23, 31], h»5tone Mitcne ^ Ac-lys <■ HỈS132 A ap173 Tyr297 X. \ IỈ ' OH^c H, 4 A spi«e Tyr297 N ÌH» ị )- a; • ?■• ft : Asp166 \ % 1? , - H.S131 f4 z2 - y H.S170 ' •* r- A tp168 A sp2S8 A SP253 //i«A 5; cấ« trúc vị trí hoạt động của HDLP khỉ liên kết với đuôi Acetyl-lysin của histon (trái) và Trìchostatin A (phải) NH u H 143 H:^ '~íh ụwặ hI.H - .■hN 143 143 H5 :± 'ih ■'-■h• . -»-M .. „NH /ih „riH- r, ‘Nr% H u: '¿r rf Hình 6: cơ chế phản ứng deacetyl hóa của HDAC (đánh sổ theo HDAC8) Đầu tiên, nguyên tử oxy của nhóm carbonyl của phân tử N-acetyl lysin cuối cùng trên đuôi histon liên kết với Zrĩ*, làm nhóm carbonyl phân cực về phía oxy và carbon trở nên ái điện tử hơn. Một phân tò nước sẽ tạo liên kết phối trí với Zrĩ*. Nhờ liên hết Hydro với His 142, His 143 và nhờ hệ thống chuyển tiếp Asp267 và His 142, nguyên tử oxy của nước trở nên ái nhân hơn. Sau khi được hoạt hóa, oxy của nước tấn công vào nguyên tử c của nhóm carbonyl tạo ra oxyanion tứ diện ữung gian (oxy của nhóm carbonyl), được ồn định bởi Tyr306 và Zn^^. Cuối cùng liên kết C-N bị bẻ gẫy, 1 proton được chuyển từ His 143 cho nguyên tử nitơ tạo thành acetat và lysin [23, 31]. 10 2.5. Sự hình thành khối u và vai trò của HDAC Sự hình thành và phát triển của khối u là hậu quả của nhiều quá trình khác nhau, trong đó có vai trò của quá trình tích lũy đột biến và sự bất hoạt các gen ức chế khối u. Như đã biết ở trên, HAT và HDAC có vai trò quan trọng trong việc điều hóa quá trình phiên mã và biến đổi cấu trúc NST. Bất kỳ trường hợp nào mà cân bằng động giữa phản ứng acetyl hóa và deacetyl hóa bị phá vỡ đều có thể gây ra các sai lệch trong phiên mã, trong biểu hiện gen và cuối cùng dẫn đến sự hình thành tế bào ung thư. Sự mất cân bằng giữa HDAC và HAT đã được xác định trong nhiều loại ung thư. Sự bất hoạt HAT thông qua đột biến gen hay do tác động của một số virus đã được xác định là có liên quan đến một số loại ung thư như ung thư trực tràng, vú, glioblastom, bệnh bạch cầu...[30]. Cũng như vậy, sự hoạt động quá mức cần thiết của HDAC cũng được xác nhận trong một số bệnh bạch cầu, đặc biệt thấy rõ ở ung thư bạch cầu tiền tủy cấp tính (APL). Sự hoạt động quá mức của HDAC dẫn đến các sai lệch trên NST (đột biến) và hình thành các gen gây ung thư. Ngoài deacetyl hóa histon, HDAC còn tạo phức với một số protein non-histon, thường là các tác nhân tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã, sửa chữa ADN, protein cấu trúc, protein virus, protein điều hòa nhân. Cho đến nay có ít nhất 50 loại protein non-histon là cơ chất của HDAC được xác định: p53, E2Fs, GATAl, Bcl-6 , STAT3, HSP90... trong đó nhiều protein có vai quan trọng trong sự hình thành tế bào ung thư như protein p53, PML-RARa... Sự acetyl hóa ảnh hưởng đến độ ổn định của protein, tương tác protein-protein cũng như chức năng của chúng, liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự biểu hiện gen, điều hòa sự tăng sinh, biệt hóa, di chuyển và sự chết của tế bào. Cụ thể HDAC 1,2,3 ức chế chu trình tế bào dẫn đến cái chết theo chương trình của tế bào (apotosis), HDAC 8 ảnh hưởng đến sự biệt hóa và tăng sinh của tế bào, còn HDAC nhóm II ảnh hưởng đến các chức năng đặc biệt như sự biệt hóa, sự tạo thành mạch, sự xâm nhập tế bào, độ ổn định và chức năng protein. Hầu hết các quá trình sinh học này đều bất thường ở tế bào ung thư. Do đó vai trò của HDAC trong sự hình thành và phát triển của khối u là rất quan trọng [20]. 11 3. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE Những nghiên cứu về các chất ức chế HDAC bắt đầu từ 30 năm trước với nghiên cứu đầu tiên về khả năng ức chế sự biệt hóa tế bào của dimethylsulfoxid (DMSO), sau đó là nghiên cứu về một số chất ức chế HDAC tự nhiên như TSA, apicidin... và các HDACi tổng họp. Cho đến nay, có khoảng ít nhất 15 chất ức chế HDAC được sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với các hóa trị liệu khác đã và đang được nghiên cứu trên lâm sàng và thể hiện khả năng chống ung thư khá hiệu quả ngay ở liều nhỏ. Hầu hết các chất này đều ức chế HDAC nhóm I và II. í H3C. NHOH i CH3 7 CH3 SAHA (2) ÒH3 TSA (1) ^OH Natri butyrat (7) PXD 101 (5) acid valproic ( 6 ) Hình 7: Công thức một sổ chất ức chếHDAC 3.1. Phân loai Các chất ức chế HDAC đang được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng được chia thành các nhóm chính: 12 Acid hydroxamic; SAHA, TSA - Acid béo mạch ngắn; acid valproic Benzamid: CI994, MS275 - Các nhóm khác: sulfamid, thiol Peptid vòng: depsipeptid 3.1.1. Acid hydroxamic Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC được nghiên cứu rộng rãi nhất, kể từ khi Trichostatin A (TSA) được phát hiện và đặc biệt sau khi Vorinostat (SAHA) được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị u lympho tế bào T dưới da. Nhiều hợp chất của nhóm này đã được thử nghiệm trên người. TSA là 1 HDAC tự nhiên được phân lập từ nấm Streptomyces hydroscopicus, ức chế mạnh HDAC với IC50 ở mức nM, TSA ức chế sự biệt hóa tế bào, chu trình tế bào ở phase Gl, G2/M. Do việc sản xuất TSA hiệu suất thấp và tốn kém nên ngày nay TSA chủ yếu được dùng làm chất đối chiếu. s AHA (2) là 1 HDAC được tổng hợp một cách tình cờ trong quá trình tìm kiếm các tác nhân gây độc quá trình biệt hóa. SAHA ức chế HDAC 1, 3 với IC50 tương ứng là 10, 20nM. SAHA làm giảm sự biệt hóa và dẫn đến sự chết tế bào theo chương trình ở nhiều tế bào khác nhau. In vivo, SAHA ức chế sự phát triển của nhiều tế bào ung thư thể rắn và u máu nên được thử nghiệm lâm sàng với nhiều loại ung thư khác nhau. Từ đó các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic được nghiên cứu rộng rãi và được chia thành nhiều phân nhóm nhỏ: hydroxamic mạch thẳng, dẫn chất cinamic (LAQ 824 (3), LBH 589 (4), PXD101(5)), dẫn chất phenyl... Hầu hết các chất trong nhóm đều thể hiện khả năng ức chế mạnh HDAC với IC50 từ nM đến |aM. Đặc điểm chung của nhóm này là chức acid hydroxamic dễ tạo phức với ion của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh [23, 29]. 3.1.2. Benzamid Cơ chế tác dụng ức chế HDAC của các benzamid còn chưa được biết rõ, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu cho rằng nhóm o-aminoanilin (hoặc ớ-hydroxy có vai trò tạo phức với Zn^\ Một số chất thuộc nhóm này như MS275(8), CI994, MGCD103 (10) cũng đã và đang được thử nghiệm lâm sàng trên nhiều loại ung thư khác nhau. Đặc biệt
- Xem thêm -