Tài liệu Tổng hợp các dẫn xuất cabamat của thuốc chống hiv 3tc

k TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC ====== HOÀNG THỊ HẢI ANH TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CACBAMAT CỦA THUỐC CHỐNG HIV- 3TC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Hóa dược, Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với tất cả sự kính trọng và biết ơn chân thành, sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đặng Thị Tuyết Anh đã định hướng và hướng dẫn em tận tình trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến và các Thầy Cô làm việc tại phòng Hóa Dược, Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ để em được nghiên cứu, học tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các Thầy Cô trong Khoa Hóa học đã hết lòng quan tâm, dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường và hoàn thiện khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tạo điều kiện động viên, khích lệ giúp em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp cuả mình. Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2016 Sinh viên Hoàng Thị Hải Anh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT [α]D Độ quay cực Specific Optical Rotation 1 Phổ Phổ cộng cộng hưởng hưởng từ từ hạthạt nhân nhân proton proton H – NMR 13 C – NMR 2D – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two – Dimentional NMR DMF Dimethylfomamide EI – MS Phổ khối lượng va chạm elctron ESI – MS Phổ khối lượng phun mù điện tử Electron Spray ionizasion Mass Spectra EtOAc Ethylacetat HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity HMQC Heteronuclear Mutiple Quantum Coherence IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy TCL Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography UV Phổ tử ngoại Rf Hệ số di chuyển MeOH Rượu Metylic DMF Dimethyl formamide GC-MS Gas Chromatography Mass Spectometry LC-MS Liquid Chromatograph PBMCs Peripheral blood mononuclear cells DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Tổng hợp lamivudin từ aldehyde glyco .......................................... 8 Sơ đồ 1.2: Tổng hợp lamivudin từ từ L-glucozo .............................................. 8 Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các hợp chất este và cacbamat của 3TC ....................... 10 Sơ đồ 3.2 : Tổng hợp dẫn xuất 18 ................................................................... 30 Sơ đồ 3.3 : Tổng hợp dẫn xuất 19 ................................................................... 31 Sơ đồ 3.4 : Tổng hợp dẫn xuất 20 ................................................................... 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU Hình 1.1: Một số chất thuộc nhóm NRT .......................................................... 2 Hình 1.2: Mô hình phân tử lamivudin trong không gian ................................. 5 Hình 1.3: Nhóm các chất ức chế enzym phiên mã ngược. ............................... 6 Hình 1.4: Các thuốc ức chế HIV protease ........................................................ 7 Hình 3.2: phổ 1H-NMR của dẫn xuất 19 ........................................................ 32 Hình 3.3: phổ 1H-NMR của dẫn xuất 20 ........................................................ 34 Bảng 2.1: Các thiết bị chính sử dụng trong phòng thí nghiệm ...................... 22 Bảng 2.2: Các dụng cụ chính sử dụng trong phòng thí nghiệm ..................... 23 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề............................................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 5 1.1.Tổng quan về lamivudin .......................................................................... 5 1.1.1. Công thức cấu tạo ............................................................................. 5 1.1.2. Mô hình phân tử trong không gian ................................................... 5 1.1.3. Công thức phân tử: C8H9N3SO3 ........................................................ 5 1.2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................. 5 1.2.1. Trên thế giới...................................................................................... 5 1.2.1.1. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã ngược nucleozit ................................................................................................... 6 1.2.1.2. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã ngược không phải nucleozit ........................................................................................... 6 1.2.1.3. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế HIV protease........................... 7 1.2.1.4. Các phương pháp tổng hợp lamivudin ....................................... 7 1.3. Hoạt tính kháng HIV của một số dẫn xuất lamivudin (3TC) ................. 9 1.4. Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu trong tổng hợp hữu cơ .... 10 1.4.1. Phương pháp sắc kí bản mỏng ........................................................ 10 1.4.2. Chiết ................................................................................................ 11 1.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp .................................................... 12 1.4.4. Sắc kí cột ......................................................................................... 12 1.4.5. Phương pháp nhồi cột huyền phù ................................................... 12 1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ .................................................................... 13 1.4.6.2. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí .......................................... 13 1.4.6.3. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột ............ 14 1.4.6.4. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột sắc kí ...................................................................................................... 14 1.4.6.5. Cách nạp silicagel vào cột ........................................................ 14 1.4.6.5.1. Nạp silicagel ở dạng sệt ........................................................ 14 1.4.6.5.2. Nạp silicagel dạng khô.......................................................... 15 1.5. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ..... 17 1.5.1.Điểm nóng chảy (Mp) ...................................................................... 17 1.5.2. Độ quay cực ([α]D) .......................................................................... 17 1.5.4. Phổ khối lượng (Mass spectrocopy, MS) ....................................... 19 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 21 2.1. Mục tiêu của khóa luận ......................................................................... 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị ................................ 21 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 21 2.2.2. Hóa chất và dung môi ..................................................................... 21 a. Thiết bị: .............................................................................................. 22 b. Dụng cụ .............................................................................................. 23 c. Hóa chất ............................................................................................ 24 2.2.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng ......................................................................................... 24 2.2.4. Định lượng phản ứng ...................................................................... 24 2.2.5. Thiết bị xác định cấu trúc. .............................................................. 25 2.3. Tổng hợp các dẫn xuất cacbamat của lamivudin(3TC) ........................ 26 2.3.1. Tổng hợp chất 18 ............................................................................ 26 2.3.2. Tổng hợp chất 19 ............................................................................ 27 2.3.3. Tổng hợp chất 20. ........................................................................... 28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 29 3.1.Quy trình tổng hợp ................................................................................. 29 3.1.1. Tổng hợp chất 18 ............................................................................ 30 3.1.2. Tổng hợp chất 19 ............................................................................ 31 3.1.3. Tổng hợp dẫn xuất 20 ..................................................................... 33 KẾT LUẬN .................................................................................................... 35 DANH MỤC VÀ TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................. 36 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề Theo báo cáo của cơ quan điều phối về HIV/AIDS của Lên hợp quốc (ANAIDS) và Tổ chức y tế Thế giới (WHO), bệnh HIV/AIDS xuất hiện vào những năm cuối của thập kỷ 70 và đầu thập kỷ 80 ở Châu Phi. Tại Châu Á, dịch HIV/AIDS xuất hiện muộn và những năm cuối của thập kỷ 80, vùng Đông Âu và Trung Á phát hiện dịch vào những năm đầu của thập kỷ 90. Dịch HIV/AIDS xuất hiện ở khu vực Đông Nam Á khá muộn, trường hợp nhiễm HIV đầu tiện ở khu vực này được phát hiện tại Thái Lan vào năm 1985, đến cuối những năm 90 là Campuchia, Myanma. Theo báo cáo toàn cầu của WHO và công tác phòng chống HIV/AIDS, cho đến thời điểm hiện tại có 35 triệu người nhiễm HIV, 1.5 triệu người chết do AIDS và 119 quốc gia báo cáo kết quả có khoảng 95 triệu người đã xét nghiệm HIV. Tại Việt Nam, trong năm 2015 cả nước xét nghiệm phát hiện mới 10.195 trường hợp nhiễm HIV, số bệnh nhân chuyển sang giai đoạn AIDS 6.130, số bệnh nhân tử vong 2.130 trường hợp. Trong năm 2015 các tỉnh triển khai rà soát lại người nhiễm HIV, có thêm 5524 trường hợp HIV, 10.144 bệnh nhân AIDS và 13.254 người tử vong trong nhiều năm trước nay được báo cáo bổ sung. Tính đến cuối năm 2015, toàn quốc có 227.154 người nhiễm HIV đang còn sống với HIV được báo cáo, 85.194 người nhiễm HIV đang giai đoạn AIDS và đã có trên 86.716 người nhiễm HIV đã tử vong. Trong số 227.154 người được báo hiện nay đang còn sống, nhưng có 24.717 người nhiễm HIV không xác định được trên thực tế, những người này có thể trùng với những người quản l được nhưng thông tin cá nhân không chính xác nên không loại trừ được, hoặc sợ k thị họ cung cấp thông tin không đúng cho nhân viên y tế, do đó số quản l được theo d i được ở các tỉnh chỉ có 202.437. Theo ước tính, cả nước hiện có khoảng 254.000 người nhiễm HIV trong cộng 1 đồng, m i năm có khoảng 12.000-14.000 trường hợp mới nhiễm HIV. Như vậy ước tính hiện nay có khoảng 80% người nhiễm HIV biết được tình trạng HIV của họ. Trong số những người được báo cáo xét nghiệm mới phát hiện nhiễm HIV trong năm 2015, nữ chiếm 34,1%, nam chiếm 65,9%, lây truyền qua đường tình dục chiếm 50,8%, lây truyền qua đường máu chiếm 36,1%, mẹ truyền sang con chiếm 2,8%, không r chiếm 10,4%. Tất cả các số liệu trên cho thấy HIV/AIDS có tác động mạnh như thế nào đến sức khỏe mà sinh mạng của con người không chỉ ở Việt Nam mà còn trên phạm vi toàn thế giới. Ngày nay, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra một số nhóm chất có hoạt tính chống HIV/AIDS tiêu biểu như: zidovudin (AZT), stavudin (d4T), didanosin (ddI), Lamivudin(3TC). O O 5 HN 2 O O 5' HO N1 3' HN 6 HO O O N N HO 1' 4' 2' Stavudin (1) NH2 N3 Zidovidin (2) O O N S Lamivudin (3) Hình 1.1: Một số chất thuộc nhóm NRT Lamivudin(3TC) là hợp chất nucleozit được dùng rất hiệu quả để chữa bệnh HIV và bệnh viêm gan B. Lamivudin là 1 thuốc tổng hợp kháng retrovirus, thuộc nhóm dideoxynucleosid ức chế enzym phiên mã ngược của virus. Ðể có tác dụng lamivudin phải được enzym tế bào phosphoryl hóa và biến đổi thành một chất chuyển hóa có hoạt tính, chất chuyển hóa 5 triphosphat. Chất chuyển hóa này có cấu trúc tương tự deoxycytidin triphosphat là cơ chất tự nhiên cho enzym phiên mã ngược. Thuốc có hoạt tính cạnh tranh với deoxycytidin triphosphat tự nhiên để hợp nhất vào DNA của virus bởi enzym phiên mã ngược, gây kết thúc sớm tổng hợp DNA của virus. Lamivudin có độc tính rất thấp đối với tế bào. Lamivudin có hoạt tính 2 kìm virus HIV typ 1 và 2 (HIV - 1, HIV - 2), và cũng có tác dụng ức chế virus viêm gan B ở người bệnh mạn tính. Tuy được dung nạp tốt, nhưng không dùng lamivudin đơn độc, vì dễ sinh kháng thuốc. Sự kháng này do đột biến về enzym phiên mã ngược, làm giảm tính nhạy cảm hơn 100 lần và làm mất tác dụng kháng virus trên người bệnh. Liệu pháp phối hợp lamivudin và zidovudin ở người bệnh chưa được điều trị trước đây, làm giảm khoảng 10 lần mật độ virus trong huyết tương, tác dụng kéo dài hơn 1 năm, mặc dù có sự đột biến của enzym phiên mã ngược. Nếu sử dụng một lượng lớn lumivudin đưa vào trong tế bào gây ngộ độc tế bào, không thể đào thải ra bên ngoài gây tác dụng phụ nguy hiểm. Người ta đang hướng tới tìm ra các dẫn xuất mới làm giảm độc tính của thuốc, giải phóng thuốc qua quá trình trao đổi chất, cho phép đưa lượng lớn các thuốc vào trong màng tế bào và được giải phóng dần dần nhờ quá trình trao đổi chất. Xuất phát từ thực tiễn trên, tội chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp là: “Tổng hợp các dẫn xuất cabamat của thuốc chống HIV-3TC” 2. Mục đích nghiên cứu. Nghiên cứu tổng hợp thành công và xác định cấu trúc của một số dẫn xuất của cacbamat của thuốc chống HIV-3TC có mạch nhánh là các hydrocacbon no hoặc không no có khối lượng phân tử lớn. Từ đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tổng hợp các hợp chất hữu cơ nói chung và nâng cao hoạt tính sinh học cho các dẫn chất của 3TC nói riêng, góp phần vào sự phát triển của y học thế giới cũng như y học Việt Nam về lĩnh vực trống HIV hiện đại. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu. - Nghiên cứu các tài liệu tham khảo liên quan đến đề tài (các đề tài, bài báo cáo khoa học, các công trình khoa học đã làm thành công về đề tài). 3 - Nghiên cứu các hướng tổng hợp, các cơ chế và dự đoán các hướng sản phẩm của các phản ứng. - Tổng hợp một số dẫn xuất của 3TC có mạch nhánh là các hiđrocacbon no hoặc không no có khối lượng phân tử lớn. - Tiến hành đo phổ và giải phổ để kiểm tra cấu trúc của sản phẩm tổng hợp. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về lamivudin 1.1.1. Công thức cấu tạo NH2 N HO O O N S Lamivudin (L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine) 1.1.2. Mô hình phân tử trong không gian Hình 1.2: Mô hình phân tử lamivudin trong không gian 1.1.3. Công thức phân tử: C8H9N3SO3 1.2. Tình hình nghiên cứu 1.2.1. Trên thế giới Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thuốc chống HIV/AIDS và đạt được những thành tựu nhất định bước đầu tìm ra một số nhóm chất chống HIV/AIDS. 5 1.2.1.1. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã ngược nucleozit 2’,3’-Dihydroxynucleozit (NRT) là nhóm chất quan trọng nhất của các chất chống HIV/AIDS, gồm có zidovudin (AZT), stavudin (d4T), didanosin (ddI), lamivudin (3TC)... [5- 8,12,14,]. Các nucleozit này được phosphat hoá nhờ enzym kinase tạo thành 5’-triphosphat và được gắn vào mạch ADN của virus nhờ enzym phiên mã ngược của HIV. Do C-3’ của các chất này vắng mặt nhóm OH nên không thể kéo dài mạch ADN của virut, ngăn chặn quá trình mã hoá ngược ARN thành ADN, vì thế virus ngưng phát triển [53]. O O 5 HN 2 5' O N1 O HO NH 2 HN O O 6 HO N HO 1' 4' 2' 3' N S N3 Zidovidin (2) Stavudin (1) O O N Lamivudin (3) Hình 1.1: Một số chất thuộc nhóm NRT 1.2.1.2. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế enzym phiên mã ngược không phải nucleozit Nhóm các chất không phải là nucleozit (NNRT) có khả năng ức chế enzym phiên mã ngược bao gồm nelviparin, efavirenz, delavidin… Nhóm chất này hoạt động theo cơ chế khác với các nucleozit ở trên. O N N N H N F3 C Cl N O Nelvirapin (4) S O H O N H N N O Efavirenz (5) N H N N O Delavirdin (6) Hình 1.3: Nhóm các chất ức chế enzym phiên mã ngược. 6 1.2.1.3. Thuốc chống HIV/AIDS ức chế HIV protease Các thuốc ức chế HIV protease là các chất có nguồn gốc peptit có chứa hydroxyetylen isoster và hydroxyetylenlamin isoster. Những isoster này gắn vào HIV protease tạo thành trạng thái chuyển tiếp gần giống với trạng thái chuyển tiếp của sự thuỷ phân mạch peptit của HIV protein, nhưng thiếu nhóm OH nên quá trình cắt mạch peptit bị ngừng lại và ngăn chặn sự phát triển của virus. Một số ví dụ về nhóm thuốc này là saquinavir, nefinavir, indinavir, lopinavir [5]. O NH2 H OH O N N H N O OH H H H N O H N H N O H S O N H Nelfinavir (9 ) Saquinavir ( 7) O O HO OH N N H N N N H HO N Idinavir (8 ) Hình 1.4: Các thuốc ức chế HIV protease 1.2.1.4. Các phương pháp tổng hợp lamivudin Lamivudin được tổng hợp đầu tiên bởi Belleau và cộng sự trong nghiên cứu của mình tại Đại học McGill (Montreal, Quebec, Canada)vào năm 1989. Một số phương pháp tổng hợp lamivudin:  Phương pháp thứ nhất: 7 Năm 1991, Choi và cộng sự đã tìm ra phương pháp tổng hợp lamivudin với hiệu suất 98% (sơ đồ 1.1 ) OTBDF O H O RO OTBDF O HSCH2CO2H DiBAL-H,AC2O 64% Toulene-780C 84% O AcO S 10 S 12 11 80% TMS-cytosine DMC, stannic chloride NH2 NH2 N N OH O Bu4NF OTBDF O O 98% O S S 13 Lamivudin 3 Sơ đồ 1.1: Tổng hợp lamivudin từ aldehyde glyco  Phương pháp thứ hai: Vào năm 1992, Jeong và cộng sự đã thành công trong việc giải thích quá trình tổng hợp lamivudin từ L-glucozo.(Sơ đồ 1.2) NH2 HO O HO HO HO O OH N 2 steps Sucessive steps S O TBDPSO N OH O S L- Glucose 14 15 Lamivudin 3 Sơ đồ 1.2: Tổng hợp lamivudin từ từ L-glucozo 8 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Hiện tại, trong nước hầu như chưa có công trình nào nghiên cứu tổng hợp lamivudin và các dẫn xuất của nó. Các nhà nghiên cứu chủ yếu nghiên cứu vê hoạt tinh sinh học của lamivudin và dẫn xuất trong việc chống HIV và viên gan B cho từng đối tượng hay các công trình nghiên cứu định lượng lamivudin như đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lamivudin zidovudin và nevirapin trong chế phẩm viên nén bằng MEKC”. Lamivudin có hoạt tính sinh học cao nhưng sử dụng lâu dễ gây độc tế bào nên cần nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp ra các dẫn xuất mới của lamivudin làm giảm thiểu tính kháng thuốc là vô cùng cần thiết. 1.3. Hoạt tính kháng HIV của một số dẫn xuất lamivudin (3TC) Hiện nay, phần lớn các tiền thuốc (este và cacbamat) được thiết kế cho các mục đích khác nhau như: làm giảm độc tính của thuốc, giải phóng thuốc qua quá trình trao đổi chất, cho phép đưa lượng lớn các thuốc vào trong màng tế bào và được giải phóng dần dần nhờ quá trình trao đổi chất. Để đạt được mục đích đó, hiện nay việc gắn các chất có mạch dài ưa dầu vào liên kết 5’-O của nucleozit như đưa nhóm este hoặc cacbonat có chứa mạch nhánh là một trong những con đường hiệu quả được các nhà hóa học rất quan tâm. Mặc dù có công trình nghiên cứu thấy rằng các dẫn xuất 5’-O-cacbamoyl-2’,3’dideoxynucleozit không có hoạt tính chống virut vì liên kết cacbamat bền với thủy phân enzym. Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện nay đã thông báo một số axit amin liên kết với AZT thông qua liên kết cacbamat có hoạt tính chống HIV-1 trên dòng tế bào PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) lây nhiễm và hoạt tính chống HIV. Hoạt tính của nó đã được giả thiết rằng không liên quan đến việc nhả AZT trong tế bào. Gần đây, các dẫn xuất 5’-O-cacbamate-2’,3’-dideoxythiacytidin được Anastasi nghiên cứu tổng hợp (sơ đồ 1.3). Hoạt tính của các dẫn xuất này 9 được nghiên cứu trên dòng tế bào lây nhiễm HIV MT4 hoặc PBMCs. Kết quả cho thấy một số hợp chất có hoạt tính cao hơn và ít độc hơn so với 3TC [11]. HN NH2 HO HN N N O O Boc N Boc2O, CH2Cl2 O O HO N N Y O Y X O X O N 17 NH2 N n(H2C) n(H2C) S 16 3 O O O S S R O O N 17a-17g S a. X= -NH-, Y= -NH-Boc, n=3, R=-Boc b. X= -NH-, Y= -NH-Boc, n=4, R=-Boc c. X= -NH-, Y= -OH, n=3, R=-Boc d. X= -NH-, Y= -OH, n=4, R=-Boc e. X= -NH-, Y= -OH, n=6, R=-Boc f. X= -NH-, Y= -CH3, n=3, R=-Boc g. X= -NH-, Y= -CH3, n=2, R=-Boc Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các hợp chất este và cacbamat của 3TC Lamivudin là hợp chất nucleozit được dùng rất hiệu quả để chữa bệnh HIV và bệnh viêm gan B. Tuy nhiên, khi sử dụng lâu dài sẽ gây nhiều hiệu ứng phụ vì chất này có độc tính cao. Việc nghiên cứu các dẫn xuất của nó như đã đề cập ở trên là hướng nghiên cứu rất có nghĩa khoa học và thực tiễn, cho phép tạo ra các tiền chất ít độc và có thể đưa vào cơ thể một lượng lớn thuốc nhờ quá trình trao đổi chất, các tiền chất này sẽ được giải phóng dần lamivudin. 1.4. Tổng quan về các phƣơng pháp nghiên cứu trong tổng hợp hữu cơ 1.4.1. Phương pháp sắc kí bản mỏng Sắc kí bản mỏng được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thường sản phẩm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang khác nhau... Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng. Phương pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel 60F254, aluminum oxide được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. 10 Dùng mao quản chấm một vết nhỏ dung dịch nguyên liệu đầu, một vệt là sản phản phản ứng khoảng 1cm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một hệ dung môi thích hợp n-hexan/EtOAc được đặt trong bình triển khai. Dung môi được chuyển lên bản sắc kí gặp phải mẫu thử và dung dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các chất với Rf khác nhau dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi. Hợp chất có tính phân cực sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí. Đối với những chất có UV ta kiểm tra UV có thể nhận được các vết khác nhau. Dựa vào các vết trên bản mỏng cùng với giá thị Rf tương ứng ta có thể nhận biết được phản ứng đã xảy ra hay chưa, nguyên liệu đầu còn hay hết. Dựa vào tính chất đó chúng ta có thể tìm được dung môi hoặc h n hợp dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (Rf khác nhau) tìm được hệ dung môi cần để tinh chế các chất. Có thể sử dụng một h n hợp hai dung môi. Trong hai dung môi đó một dung môi có khả năng hòa tan tốt chất kết tinh còn dung môi kia thì ngược lại hoặc ít tan. H n hợp hai dung môi này phải hòa tan vào nhau tạo thành một dung dịch đồng nhất trong suốt. Thông thường một chất dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hóa học gần gũi. Ví dụ các este dễ hòa tan trong cồn hoặc trong etylaxetat. Các hidrocacbon dễ tan trong benzen, ete, dầu, n-hexan. Thường dung môi có nhiệt độ sôi từ 600C - 800C là thích hợp. 1.4.2. Chiết Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước). Như vậy ta có quá trình chiết lỏng. 11 Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lượng nhỏ các tạp chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác. Ưu điểm của quá trình là thực hiện nhanh. Các thiết bị chiết đơn giản chỉ là phễu chiết thường người ta không cần thiết bị gì thêm.Chọn được dung môi (dung môi chiết CH2Cl2) và điều kiện chiết thích hợp với chất thử người ta có thể tách được bất kì cấu tử nào ra khỏi h n hợp bất kì. Trường hợp chất chiết có màu ta có thể sử dụng phần chiết vào mục đích phân tích định lượng theo các phương pháp đo quang. 1.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp Dùng máy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu được chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất. 1.4.4. Sắc kí cột Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra. Nhưng trong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là sắc kí cột. Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột có thể là những ống hình trụ dài 30 – 100cm, đường kính từ 1 – 8cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính. 1.4.5. Phương pháp nhồi cột huyền phù Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn. Đổ lượng Al2O3 qua phễu, theo một ống đổ vào đáy cột. Rót từ từ đều đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phẳng không có ch r ng, ch dày, ch mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa 12 thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi nhận được một chiều cao nhất định. 1.4.6. Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí 1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion. 1.4.6.2. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:  Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp.  Chuẩn bị 4÷6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên m i tấm với lượng tương đương nhau.  M i bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví dụ n–hexan/EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí.  Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng. Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực. Chú ý:  Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau. 13