Tài liệu Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng lactobacillus plantarum nt1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: TỐI ƯU HOÁ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG Lactobacillus plantarum NT1.5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH SVTH : TRẦN THỊ KIỀU MSSV : 1053012348 KHOÁ: 2010 – 2014 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, cô thầy là người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em có thể hoàn thành tốt đề tài. Chân thành cảm ơn các thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản làm nền tảng để em có thể hoàn thành đề tài. Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi là người đã truyền đạt những kinh nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài. Xin cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh đã giúp đỡ, động viên em trong thời gian qua. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành tốt việc học tập của mình. Chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày tháng năm 2014 TRẦN THỊ KIỀU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ........................................................ 5 1.1.1. Giới thiệu ................................................................................................. 5 1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic ........................................... 7 1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum................................................... 8 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS ................................................................................................... 10 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 10 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước .................................................................. 11 1.3. QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM .................................................................. 12 1.3.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ................................................. 12 1.3.2. Thí nghiệm sàng lọc .............................................................................. 14 1.3.3. Thí nghiệm tối ưu hóa ........................................................................... 16 1.4. PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0............... 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 23 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU .................................................. 24 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU............................................................................ 24 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 24 2.2.2. Môi trường – hóa chất .......................................................................... 24 2.2.3. Dụng cụ ................................................................................................. 24 2.2.4. Trang thiết bị ........................................................................................ 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 25 2.3.1. Hoạt hóa chủng ..................................................................................... 25 2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 ............. 26 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3.4. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5 ............................................................................................................... 27 2.3.5. Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ............................................................ 28 2.3.6. Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman ................................................................ 30 2.3.7. Thí nghiệm khởi đầu............................................................................. 32 2.3.8. Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp leo dốc .............................................................................................................. 32 Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh 2.3.9. hưởng chính. ............................................................................................................. 33 2.3.10. Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5 trên môi trường tối ưu...................................................................................................... 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 34 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 ..................................................................... 35 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT 1.5 ............................................................................................... 36 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5. ............................................................... 38 3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG ....................................... 39 3.4.1. Nguồn nitơ ............................................................................................. 39 3.4.2. Nguồn cacbon ........................................................................................ 41 3.4.3. Nguồn khoáng ....................................................................................... 42 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN ............................................. 44 3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU .................................... 48 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC .......................................................... 50 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN ............................................... 52 3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU .............................................................................. 57 4.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 61 4.2 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 63 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 68 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iii TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit Cs. Cộng sự L. plantarum Lactobacillus plantarum MRS Deman, Rogosa and Sharpe Nm nanomet OD Optical Density P-B Plackett-Burman WHO World Health Organization BSH Bile salt hydrolase SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iv TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Streptococcus ...................................................................................... 6 Hình 1.2 Lactobacillus ........................................................................................ 6 Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013) ............................................................................................................................. 9 Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình. ......................... 13 Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và Behnken, 1960) ................................................................................................. 20 Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 ................................................ 22 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU v TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát .................................................................. 28 Bảng 2.2. Các nguồn cacbon khảo sát ............................................................. 29 Bảng 2.3. Các nguồn khoáng khảo sát ............................................................ 30 Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 và mật độ tế bào (Log(N/mL) .............................. 35 Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian ............................................................. 36 Bảng 3.3. Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát ................................................................... 38 Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát ............................ 40 Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát ....................... 41 Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát ............. 43 Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố ..................................................... 44 Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman ........................................... 45 Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính ........................................................................................................................... 50 Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc ............................................................. 51 Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53 Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53 Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố .............................................. 56 Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian ................................................................ 57 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ .......................................................... 40 Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon.................................................... 42 Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng ........................................... 43 Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) ........................... 47 Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau .................................................................................... 55 Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau .......................................................................................... 56 Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian trên môi trường tối ưu ..................................................................................... 58 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cholesterol trong máu tăng làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ, một phần ba bệnh tim thiếu máu cục bộ là do cholesterol cao. Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính gây ra 2,6 triệu ca tử vong (4,5% của tổng số) và 29,7 triệu người gánh hậu quả. Tổng số cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây bệnh tật ở cả các nước phát triển và đang phát triển như là một yếu tố nguy cơ bệnh tim thiếu máu cục bộ và đột quỵ (WHO, 2013). Việc giảm cholesterol là vấn đề rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim và cs., 2004). Một trong những giải pháp đó là nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa có hoạt tính probiotic và vừa có hoạt tính làm giảm cholesterol là vấn đề thiết thực, được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu. Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus…) có tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005). Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có khả năng giảm cholesterol bằng cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno, 2007). Ngày nay việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa vi khuẩn probiotic như Lactobacilli có tầm quan trọng ngày càng tăng. Những vi khuẩn này có tác dụng kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và mang lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng (Shahravy, 2012). Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 đã được chứng minh có khả năng làm giảm cholesterol thông qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào và khả năng sinh enzym BSH đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH dạ dày, kháng muối mật, kháng khuẩn,… (Dương Nhật Linh, 2013). Vì vậy Lactobacillus plantarum NT1.5 có thể được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic có hoạt tính làm giảm cholesterol. Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học ngày càng tăng. Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật đang được quan tâm. Do đó, nghiên cứu phát triển môi trường nuôi cấy mới để tăng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU cường sản xuất sinh khối có thể dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu quả kinh tế hơn (Shahravy, 2012). Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”. Nội dung thực hiện:  Xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào tương ứng với từng giá trị OD.  Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn.  Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5  Chọn lựa nguồn cacbon, nitơ và các nguồn khoáng.  Xác định các yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình tăng sinh khối của Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng thiết kế Plackett – Burman (P - B).  Xác định giá trị tối ưu của các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp Box-Behnken.  Nuôi cấy thử nghiệm. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1. Giới thiệu Vi khuẩn lactic acid (LAB) là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, là một chế phẩm sinh học an toàn cho con người (David, 2013). Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được sắp xếp: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae Giống I: Lactobacillus Giống II: Pediococcus Họ II: Enterococceae Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococcaceae Giống I: Streptococcus Giống II: Lactococcus Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại vitamin…, bình thường chúng không có cytochrome. Vì vậy, chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu khí, có khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi trên niêm mạc ruột của người và động vật. LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005). Trong đó tế bào của chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus. a b Hình 1.1 Streptococcus a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử b: Streptococcus nhuộm Gram a b Hình 1.2 Lactobacillus a: Lactobacillus dưới KHV điện tử b:Lactobacillus nhuộm Gram SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 6 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bifidobacteria cũng được xem là một chi của lactic acid bacteria do có cùng đặc điểm tiêu biểu và cách thức lên men đường. 1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic Sự phân loại giữa các chi của vi khuẩn lactic dựa trên hình thái, cách thức lên men đường, sự phát triển ở những nhiệt độ khác nhau, cấu trúc của sản phẩm acid lactic, khả năng chịu muối, chịu acid hoặc kiềm (Mascel, 2005). LAB có hai con đường lên men đường chính (Mascel, 2005):  Glycolysis (Embden- Meyerhof- Parnas pathway): sản phẩm cuối cùng là acid lactic hay còn gọi là con đường lên men lactic đồng hình.  Con đường 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: sản phẩm của quá trình lên men này ngoài acid lactic còn có ethanol, acetate và CO2 hay còn gọi là quá trình lên men dị hình. Dựa vào khả năng lên men đường người ta chia LAB thành LAB đồng hình và LAB dị hình. 1.1.2.1 Lên men đồng hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình gần như chuyển hóa hoàn toàn đường chúng sử dụng thành acid lactic. Trong điều kiện thừa glucose và oxy hạn chế lên men đồng hình 1 mol glucose theo con đường chuyển hóa EMB (Embden – Meyerhoff – Parnas) tạo 2 mol pyruvate. Sự cân bằng oxi hóa khử trong tế bào được duy trì thông qua các quá trình oxi hóa của NADH, song song đó là sự khử pyruvat thành acid lactic. Các phản ứng diễn ra trong phần nền tế bào chất. Các enzym đặc trưng trong quá trình này là aldolase và triozophosphateisomerase. Glucose không phải là đường duy nhất có thể được sử dụng. Với hệ thống enzym thích hợp, các loại đường khác có thể được chuyển đổi thành glucose hoặc một trong những chất trung gian trong quá trình như glucose6-phosphate (hoặc trong trường hợp đường pentose, ribulose-5-phosphate). Khả năng sử dụng các loại đường khác nhau ở vi khuẩn lactic thay đổi theo loài. Đại diện cho SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 7 TỔNG QUAN TÀI LIỆU kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và Lactobacillus nhóm I. (Desantis và cs., 1989) 1.1.2.2 Lên men dị hình Lên men dị hình sử dụng con đường pentose phosphate, cách gọi khác là con đường phosphoketolase pentose. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6- phosphogloconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử CO2. Kết quả là pentose -5- phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hóa thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất trung gian là acetyl – CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối cùng (bao gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với sản phẩm từ quá trình dị hóa một phân tử glucose. Hai enzyme đặc trưng trong quá trình này là transketolase xúc tác chuyển hóa nhóm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuyển hóa nhóm 3C. Quá trình này xảy ra trong cytosol. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc oenococcus, Weissella và Lactobacillus nhóm III. (Desantis và cs., 1989) 1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum 1.1.3.1. Phân loại Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plntarum được phân loại: Giới (Kingdom): bacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Lactobacillales Họ (Family): Lactobacillaceae Giống (Genus): Lactobacillus Loài: L. Plantarum 1.1.3.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobaciillus plantarum Lactobacillus plantarum là một trong hơn 50 loài Lactobacillus. Lactobacillus plantarum là vi khuẩn gram dương, catalase âm (Bujalence, 2006), hình trực không SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 8 TỔNG QUAN TÀI LIỆU sinh bào tử được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người và động vật. Vi khuẩn này lần đầu tiên được tìm thấy trong nước bọt của con người. (Waugh và cs., 2009) Lactobacillus plantarum là một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi cao, nó có thể tồn tại ở phạm vi nhiệt độ rộng lớn (từ 1-600C) (Natural New, 2010), kị khí tùy nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarum được xếp vào nhóm vi khuẩn lên men dị hình, có thể sống trong nhiều môi trường như thịt, cá, sữa, các quá trình lên men thực vật, thực vật và trong nhiều loại pho mát. (Kohajdová, 2012). L. plantarum có nhiều điểm khác biệt so với các loài lactobacillus khác ở những điểm sau: - Có bộ gen tương đối lớn nên có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau (Kleerebezem và cs., 2003) - Có thể lên men nhiều loại đường. -Thích nghi cao với điều kiện acid, chịu pH thấp (Daeschel và Nes 1995). - Có thể chuyển hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs., 2001), phân giải muối tanat nhờ hoạt động của enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004). Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013) 1.1.3.3. Lợi ích của vi khuẩn L. plantarum Lactobacillus plantarum có nhiều trong nước bọt và đường tiêu hóa của con người. Nó thường được sử dụng trong các quá trình lên men thực phẩm và làm probiotic. Các chế phẩm sinh học sử dụng L. plantarum ngày càng được công nhận trên thị trường. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 9 TỔNG QUAN TÀI LIỆU L. plantarum có thể nâng cao tính toàn vẹn ruột, hoạt động trao đổi chất của các tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen và cs., 2009). Giảm thiểu một số triệu chứng rối loạn tiêu hóa khi điều trị bằng kháng sinh (Lonnermark và cs., 2009). Theo nghiên cứu của nhóm Karlsson và cộng sự (2009) được tiến hành ở Thụy Điển cho thấy uống trực tiếp L. plantarum có thể tăng tính đa dạng của hệ vi sinh vật ở ruột kết. Bảo vệ tế bào biểu mô khỏi sự gây hại của E. coli bằng cách thay đổi hình thái tế bào chủ, giảm hình thành tổn thương, tăng sức đề kháng và khả năng thẩm thấu đơn lớp phân tử (Qin và cs., 2009). 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS Các nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã và đang được triển khai rộng rãi trên toàn thế giới, trong đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Lactobacillus. Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn lactic còn quá khiêm tốn và có rất ít công trình nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus. Phần lớn các nghiên cứu về Lactobacillus ở trong nước chỉ là nghiên cứu cơ bản về nhóm vi khuẩn này như ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống có hoạt tính tốt để làm probiotic. 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới Năm 2012, Hu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nông nghiệp có giá thành thấp như bột đậu nành, bột ngô, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh dưỡng, từ đó làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mô lớn. Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa các yếu tố dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, muối khoáng và các yếu tố tăng trưởng (vitamin B, axit amin) khi dùng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng sinh khối vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus PEN. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 10 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Năm 2006, Altaf và cộng sự đã tối ưu hóa môi trường thu acid lactic cho chủng Lactobacillus amylophilus GV6 bằng cách sử dụng các nguồn cacbon, nitơ rẻ tiền như: bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho pepton, glucose trong môi trường MRS bằng phương pháp Plackett-Burman và đáp ứng bề mặt (RSM). Kết quả cho thấy Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% và năng suất 96% (g acid lactic/ g tinh bột được sử dụng). Farooq và cộng sự (2012) đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của quá trình sản xuất đường mía) làm nguồn cacbon trong môi trường tối ưu thu sinh khối của vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii. Năm 1995, Oh và cộng sự đã công bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton, cao nấm men, glucose, nhiệt độ nuôi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei YIT 9018. Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.casei YIT 9018 như sau: trypton, 3,04%; cao nấm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhiệt độ nuôi cấy là 35oC. Năm 2006, Zhong đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus casei LC2W bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng cường sản xuất exopolysaccharid. Kết quả tối ưu các điều kiện nuôi cấy để sản xuất exopolysaccharid: nhiệt độ nuôi cấy là 32,5°C và thời gian nuôi là 26 giờ. 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước Năm 1996, Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự đã công bố nghiên cứu về môi trường nuôi vi khuẩn lactic tốt nhất. Môi trường đó là sữa gầy hoàn nguyên với thời gian lên men tốt nhất là 18-20 giờ, bổ sung giống 2-3%. Trong công bố nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2003 đã sử dụng hai chủng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic. Tìm ra được ba môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bifidobacteria bifidum là môi trường thyoglycolat, môi trường nước chiết gan, môi trường nước chiết thịt bò ở điều kiện nuôi cấy kỵ khí. Môi trường thích hợp cho L. acidophilus là môi SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 11