Tài liệu Tối ưu điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei pq6 của việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *********************** LÊ THỊ THƠM Đề tài: “TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH KHỐI VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 CỦA VIỆT NAM” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *********************** Lê Thị Thơm Đề tài: “TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH KHỐI VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 CỦA VIỆT NAM” Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Đặng Diễm Hồng Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Diễm Hồng, Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành biết ơn sự giúp đỡ to lớn và quý báu đó. Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Công nghệ Tảo đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh số liệu trong luận văn này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình. Hà Nội, ngày tháng Học viên cao học Lê Thị Thơm năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên cao học Lê Thị Thơm Luận văn thạc sĩ sinh học MỤC LỤC MỤC LỤC ……………………………………………………………………… … i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT……………………………………...……..iv DANH MỤC BẢNG………………………………………………………….….....v DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………… .…vi MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………..3 1.1. Giới thiệu về PUFA………………………………………………….………3 1.2. Vai trò và ứng dụng của PUFA……………………………..…………..…..4 1.2.1. Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con ngƣời....................................4 1.2.2. Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản...................................6 1.3. Nguồn cung cấp PUFA...................................................................................7 1.3.1. Nguồn gốc từ thực vật.............................................................................7 1.3.2. Nguồn gốc từ động vật............................................................................8 1.3.3. Nguồn gốc từ vi tảo.................................................................................9 1.4. Các nghiên cứu về PUFA từ vi tảo biển ……………………………….…11 1.4.1. Con đƣờng tổng hợp PUFA trong vi tảo………………………….…11 1.4.2. PUFAs từ các VTB quang tự dƣỡng……………………………...…13 1.4.3. PUFAs từ các vi tảo biển dị dƣỡng………………………….…….…14 1.5. Vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium…………………………………...…15 1.5.1. Giới thiệu chung về tảo di dƣỡng Schizochytrium……………….….15 1.5.1.1. Vị trí phân loại................................................................................15 1.5.1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của Schizochytrium mangrovei.................................................................................................................15 1.5.1.3. Sản xuất DHA và PUFAs từ vi tảo Schizochytrium khác…...…16 1.6. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết PUFA …………………………………………………………………...…..17 1.6.1. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo……………………………....17 1.6.2. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết FFA từ dầu thô………………………………………….……...……..19 1.6.3. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp axit béo tự do………………………………………………………………………………..…19 1.7. Tình hình nghiên cứu PUFA trong nƣớc và trên thế giới……………...21 i Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học 1.7.1. Tình hình nghiên cứu PUFA trên thế giới………….…….…………21 1.7.2. Tình hình nghiên cứu PUFA ở Việt Nam…………………………....22 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……..………25 2.1. Vật liệu ………………………………………………………………....…..25 2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy……...…………………………...…25 2.1.2. Hóa chất và thiết bị…………………………………………………...25 2.2. Phƣơng pháp…………………………………………………………...…...26 2.2.1.Tách chiết lipit........................................................................................26 2.2.2. Tối ƣu các thông số của quá trình tách chiết lipit……….………….27 2.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết FFA từ dầu thô ……………….…...27 2.2.3.1. Tối ƣu nồng độ NaOH trong phản ứng thủy phân dầu thô…...27 2.2.3.2. Nghiên cứu làm giàu hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo omega3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA bằng phƣơng pháp tạo phức với urê…….........28 2.2.4. Xác định chỉ số axit của hỗn hợp FFA và hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6………………………………………………………………………...29 2.2.5. Xác định chỉ số peroxyt của hỗn hợp FFA và hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6……………………………………...……………………….30 2.2.6. Phƣơng pháp xác định thành phần axit béo………………………...30 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………….32 3.1. Thành phần và hàm lƣợng axít béo trong sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 nuôi cấy ở bình lên men 30 lít…………………………………………...….32 3.2. Ảnh hƣởng của các tác nhân khác nhau lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối chủng PQ6……………………………………………………………...33 3.2.1. Ảnh hƣởng của một số yếu tố khác nhau đến quá trình tách chiết lipit………………………………..……………………………………………......34 3.2.1.1. Ảnh hƣởng của dung môi tách chiết………………………….....34 3.2.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ……………………………………..…..34 3.2.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian khuấy………………………………...36 3.2.1.4. Ảnh hƣởng của chế độ khuấy…………………….……………...36 3.2.1.5. Ảnh hƣởng của tỉ lệ dung môi và sinh khối…………………….36 3.2.1.6. Ảnh hƣởng của số lần trích ly……………………………...……37 3.2.1.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy sinh khối………………………….37 3.2.1.8. Ảnh hƣởng của độ ẩm sinh khối………………………………...38 3.2.2. Thành phần và hàm lƣợng axít béo có trong lipit tổng số ……...….40 3.3. Tối ƣu điều kiện thủy phân dầu thô tảo bằng phƣơng pháp hóa học….41 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NaOH trong phản ứng xà phòng hóa………………………………………………………….……………....41 3.3.2. Các tính chất của hỗn hợp axit béo tự do…………..…………….....42 ii Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học 3.3.3. Thành phần axit béo của hỗn hợp axit béo tự do thu đƣợc sau phản ứng thủy phân dầu tảo thô……………………………………...……………..…43 3.4. Tối ƣu quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA………………………………………………………………………...…46 3.4.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê lên hiệu suất tạo phức à hiệu suất tách PUFAs…………………………………………………………………..46 3.4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ urê:cồn lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs……………………………………………………………………………………..47 3.4.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs………………………………………………………………………..48 3.5. Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6 thu đƣợc từ dầu thô của chủng PQ6…………………………………………..……………49 3.6. Bƣớc đầu kiểm tra chất lƣợng của dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu đƣợc sau quá trình làm giàu………………………….…...…...….51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………….……………………...55 KẾT LUẬN………………………………………………………………………..55 KIẾN NGHỊ……………………………………………………….………………56 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………….….57 iii Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ TT Từ viết tắt 1 EPA Eicosapentaenoic axít 2 DHA Docosahexaenoic axít 3 DPA Docosapentaenoic axít 4 ALA α-linolenic axít 5 ARA Arachidonic axít 6 AGL Gama linoleic axít 7 DGLA 8 VTB Vi tảo biển 9 NTTS Nuôi trồng thủy sản 10 SKK Sinh khối khô 11 TFA Total fatty acids (axit béo tổng số) 12 FFA Free fatty acids (axit béo tự do) 13 PUFA Dihomo-gamma-linoleic axít Polyunsaturated fatty acid (axit béo không bão hòa đa nối đôi) 14 SFA 15 MUFA Saturated fatty acid (axit béo bão hòa) Monounsaturated fatty acids (axit béo không bão hòa một nối đôi) 16 TAG Triacylglycerol 17 VSV Vi sinh vật 18 PCBs Polychlorinated biphenyls 19 HPLC High-pressure liquid chromatography (sắc khí lỏng cao áp) 20 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam iv Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo omega-3 và omega-6 có trong một số loại dầu thực vật 8 Bảng 1.2 Hàm lượng DHA và EPA của một số loại cá 9 Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi tảo 11 Bảng 1.4 Sinh khối, lipit và hàm lượng DHA trong thraustochytrids khác nhau 17 Bảng 3.1 Thành phần axit béo của SKK chủng PQ6 33 Bảng 3.2 Thành phần axit béo của lipit tách chiết được từ sinh khối chủng PQ6 40 Bảng 3.3 Một số tính chất của dầu tảo sau phản ứng thủy phân bằng phương pháp hóa học 43 Bảng 3.4 Thành phần axit béo của hỗn hợp FFA thu nhận được sau phản ứng thủy phân dầu tảo thô 44 Bảng 3.5 Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6 thu được sau quá trình làm giàu Bảng 3.6 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu được sau quá trình làm giàu v Lê Thị Thơm - K16 50 51 Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Quá trình tổng hợp PUFA (-3 và -6) trong cơ thể Hình 1.2 Sơ đồ tách chiết PUFA từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con người 10 Con đường tổng hợp PUFA trong vi tảo Thraustochytrids và Coccolithophores 12 Ảnh tế bào tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 và nuôi cấy trong các hệ thống lên men 30 lít 25 Ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến hiệu suất tách chiết lipit từ SKK chủng PQ6 35 Hình 3.2 Quy trình tách lipit của chủng PQ6 đạt hiệu suất 70% SKK 39 Hình 3.3 Ảnh minh họa quá trình tách lipit từ SKK chủng PQ6 đạt hiệu suất 70% SKK 39 Sắc ký đồ thành phần axit béo của lipit tách chiết từ SKK chủng PQ6 40 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH lên hiệu suất thủy phân dầu tảo thô 42 Sắc ký đồ axít béo có trong hỗn hợp FFA sau phản ứng thủy phân dầu tảo thô thu được từ sinh khối chủng PQ6 44 Quá trình thích hợp cho thủy phân dầu tảo thô trong điều kiện phòng thí nghiệm 45 Ảnh minh họa quá trình thủy phân dầu tảo thô ở qui mô trong phòng thí nghiệm 46 Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các tỷ lệ FFA: urea khác nhau 47 Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các tỷ lệ urea: cồn khác nhau 48 Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các nhiệt độ kết tinh 49 Hình 1.3 Hình 2.1 Hình 3.1 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 vi Lê Thị Thơm - K16 5 Luận văn thạc sĩ sinh học khác nhau Sắc ký đồ của hỗn hợp axit béo omega -3 và omega -6 thu được sau quá trình làm giàu 50 Hình 3.13 Quá trình tối ưu làm giàu hỗn hợp axít béo từ FFA 53 Hình 3.14 Ảnh minh họa quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 từ FFA 54 Hình 3.12 vii Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển mạnh mẽ về kinh tế, đời sống con người ngày càng được cải thiện và nâng cao. Con người luôn tìm kiếm nguồn dinh dưỡng ―sạch‖ để cung cấp cho cơ thể. Protein, glucid, lipit, vitamin và khoáng chất là những nhóm chất dinh dưỡng cần thiết đối với con người. Những thập niên gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra tầm quan trọng của axit béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 như axit eicosapentaenoic (EPA); axít docosahexaenoic (DHA); docosapentaenoic (DPA) và omega-6 (axít arachidonic (ARA) đối với sức khỏe con người. Cơ thể người và động vật bậc cao thiếu các enzym cần thiết để tổng hợp được cả 2 loại axit béo nêu trên, nên phải bổ sung vào cơ thể bằng đường thực phẩm. Vì vậy, một vấn đề đặt ra cần tìm các nguồn giàu 2 loại axit béo này, tách chiết, tinh sạch và bổ sung vào nguồn thực phẩm cung cấp cho con người. Việt Nam có chiều dài bờ biển hơn 3000 km, và đang sở hữu một khu hệ động thực vật biển rất đa dạng và giàu các hợp chất tự nhiên có thể sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp, y dược trong đó có vi tảo. Nhiều loài vi tảo biển (VTB) có chứa hàm lượng protein, lipit, carbohydrates rất cao, đặc biệt trong sinh khối tảo còn có chứa một số chất có đặc tính sinh học như EPA, DHA, DPA. Ngoài ra vi tảo cũng rất giàu các vitamin A, B, C, chất khoáng đa và vi lượng cũng như các chất có hoạt tính sinh học như các chất chống oxy hóa, kháng u, chống ung thư, chất kháng viêm, kháng sinh…. Chính vì vậy, việc nuôi cấy các loài VTB được các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam quan tâm đầu tư từ nhiều năm gần đây. VTB được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai thác các chất có hoạt tính; để xử lý môi trường; làm phân bón; nhiên liệu sinh học và được ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) trên các đối tượng truyền thống như Nannochloropsis, Isochrysis, Chaetoceros... Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang tự dưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất các sản phẩm đi từ sinh khối tảo có giá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa trên quy mô lớn. Để khắc phục những nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác và ứng dụng các loài VTB dị dưỡng trong đó có chi Schizochytrium đang thu hút nhiều sự quan tâm 1 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu cả trong và ngoài nước nhưng vẫn còn rất mới mẻ và hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con người. Loài VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 đóng vai trò là những sinh vật phân huỷ, mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái biển. Loại vi tảo này có khả năng tích lũy hàm lượng lipit cao, có thể lên tới 70% sinh khối khô (SKK) và các axít béo không bão hòa đa nối đôi nhóm omega-3 (-3 PUFA) như EPA (C20: 5-3), DHA (C22: 6-3) chiếm 30-50% so với axit béo tổng số (Total fatty acids - TFA). Vai trò của các -3 PUFA nêu trên đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh, và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm. Hiện nay, loài VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 được coi là một trong các ứng cử viên tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -3 PUFA truyền thống từ dầu cá. Để có thể tách chiết được dầu sinh học giàu omega-3 và omega-6 từ VTB có 3 giai đoạn cần phải tiến hành nghiên cứu như: tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo; tách chiết axit béo tự do (Free fatty acids -FFA) từ dầu thô; tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA sao cho có hiệu xuất cao, đơn giản và dễ thực hiện và có giá thành thấp trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam”. Trong nghiên cứu này chúng tôi bước đầu tìm ra các điều kiện thích hợp (hệ dung môi, thời gian, chế độ khuấy, nhiệt độ phản ứng, nồng độ và tỉ lệ của các chất tham gia phản ứng…) cho từng giai đoạn của quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6. Các kết quả nghiên cứu của đề tài nêu trên là một phần trong hướng nghiên cứu của đề tài: ―Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng” của Bộ Công Thương thuộc Đề án Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến cho đến năm 2020 cho Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong tự nhiên, vi tảo là thành phần cơ bản của chuỗi thức ăn của thuỷ vực. Với hàm lượng protein, cacbonhydrate, lipit, PUFAs và các sắc tố (carotenoit, astaxanthin)… tương đối cao trong cơ thể nên vi tảo từ lâu đã trở thành nguồn thức ăn quan trọng cho con người và động vật nuôi. Vài ba thập kỷ trở lại đây, công nghệ sinh học vi tảo với những bước tiến bộ đáng kể, đang dần mở ra nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới. Mặc dù đang trong giai đoạn đầu nhưng nó được coi là ngành công nghiệp mang lại hàng tỉ đô la hàng năm. Những ứng dụng của công nghệ sinh học vi tảo có thể đơn giản bắt đầu từ việc sử dụng sinh khối tảo cho đến việc khai thác các chất có hoạt tính sinh học như chất chống oxi hoá, kháng vi rút, chất chống viêm, các chất kháng sinh và chất chống ung thư…. Hiện nay, khi nhu cầu cuộc sống cũng như những đòi hỏi cao hơn về giá trị dinh dưỡng thì con người không chỉ sử dụng các loại dầu ăn thông dụng mà còn cả các loại dầu có giá trị cao như dầu salad, dầu cá hồi… để phục vụ cho món ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm chức năng, dược phẩm. Dầu sinh học giàu PUFAs nhóm omega-3 và omega-6 được sản xuất từ một số loài vi tảo đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu và dần có một vị trí đáng kể, không ngừng được mở rộng và phát triển mạnh mẽ trong thị trường thực phẩm chức năng, dược phẩm trên thế giới cũng như ở Việt Nam. 1.1. Giới thiệu về PUFA Công thức tổng quát của axit béo: CH3 - (CH2)n - COOH Số nguyên tử carbon trong axít béo thường là chẵn (14-22C). Các axít béo thường gặp có số carbon từ 16-18. PUFAs là các axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết đôi. Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl. Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl. Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính từ đầu methyl người ta có thể sử dụng ký hiệu ―n‖ hoặc ―ω‖. Các liên kết đôi trong PUFA cũng có thể được tính từ gốc 3 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học carboxyl và được ký hiệu ―Δ‖. Những nhóm ω-3, ω-6 hay ω-9 PUFA có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 3, 6 hay 9. Có hai nhóm axít béo không thay thế quan trọng là omega-3 và omega-6 [50]. Các axít béo omega-3 quan trọng nhất là: +/ Axít α-linolenic (ALA); +/ Axít eicosapentaenoic (EPA); +/ Axít docosahexaenoic (DHA); +/ Axít docosapentaenoic (DPA). Các axít béo chính trong họ omega-6 là: +/ Axít linoleic (AL); +/ Axít gama linoleic (AGL); +/ Axít eicosadienoic; +/ A xít dihomo-gamma-linoleic (DGLA); +/ Axít arachidonic (ARA); +/ Axít docosapentaenoic (DPA) 1.2. Vai trò và ứng dụng của PUFA Hiện nay, PUFAs như ALA (18: 3ω-3), EPA (20: 5ω-3) và DHA (22: 6ω-3) đang được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất bởi chúng có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe con người và động vật. 1.2.1. Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con người PUFAs là thành phần quan trọng của sinh vật nhân chuẩn bậc cao. Các PUFA này có ba vai trò sinh học chủ yếu. Đầu tiên phải kể tới việc tham gia vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipit, vận chuyển và hướng tới các mô. Ví dụ, các hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợp triacylglycerol (TAG) ở gan bởi các -3 PUFA. Bên cạnh đó, các PUFA còn tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào. Sự có mặt của chúng trong thành phần phospholipit góp phần tạo nên tính linh động của màng. Điều này góp phần quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt động của các protein màng. Màng phospholipit cũng là nguồn các phân tử thông tin thứ hai như diacylglycerol, phosphatidic, inositol–1, 4, 5- trisphosphate, ceramide và axít ARA - những phân tử chịu trách nhiệm cho các hoạt động tín hiệu của màng 4 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học tới vùng nguyên sinh chất và nhân để điều chỉnh các phản ứng đáp lại tương ứng; và các phân tử tín hiệu ngoại bào như yếu tố hoạt hoá tiểu cầu [15]. PUFA tiếp tục chuyển hóa trong cơ thể bằng cách bổ sung các nguyên tử cacbon và giảm độ bão hòa (chiết xuất hydro). Động vật có vú chỉ có khả năng loại bỏ hydro từ các nguyên tử carbon có chứa liên kết đôi và nhóm carboxyl (hình 1). Quá trình oxy hóa các axit béo có thể diễn ra trong ty thể hoặc peroxisome [66]. Axit béo -6 EnZyme Axit béo -3 α-Linolenic C18:3 Linoleic C18:2 ∆6-desaturase γ-Linolenic C18:3 Octadecatetraenoic 18:4 elongase Eicosatetraenoic C20:4 Dihomo-γ-linolenic C20:3 ∆5-desaturase Arachidonic C20:4 Eicosapentaenoic C20:5 elongase Adrenic C22:4 Docosapentaenoic C22:5 elongase Tetracosatetraenoic C24:4 Tetracosapentaenoic C24:5 ∆6-desaturase Tetracosahexaenoic C24:6 Tetracosapentaenoic C24:5 β-oxidation Docosapentaenoic C22:5 Docosahexaenoic C22:6 Hình 1.1. Quá trình tổng hợp PUFA (-3 và -6) trong cơ thể [66] PUFAs có nhiều vai trò và lợi ích đặc biệt quan trọng cho cơ thể, trong đó nhiều lợi ích đã được chứng minh và được công nhận. Một số các lợi ích đó như sau: Cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch; giảm nguy cơ loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); Có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thể dẩn đến đau tim và đột quỵ); Giảm chất béo trung tính và mức độ lipoprotein còn lại; làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch; Cải thiện chức năng nội mô; Hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm. PUFAs là 5 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào não, đặc biệt đối với trẻ nhỏ từ 0-2 tuổi [59]. Cơ thể trẻ không thể tổng hợp DHA đủ nhanh để đáp ứng cho sự phát triển nhanh của não và võng mạc. Cho nên, chúng phải thu nhận những hợp chất này từ chế độ ăn [21]. Do đó, khẩu phần dinh dưỡng có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo đầy đủ PUFA cho trẻ nhỏ. Tuy nhiên, trong khẩu phần ăn, nếu tỷ lệ nhóm axit béo ω-6 quá cao so với nhóm axit béo ω-3 (lên đến 10:1) thì không có lợi cho sức khỏe. Axit béo omega-3 cũng đã được điều tra tính hiệu quả trong rất nhiều các nghiên cứu về sức khỏe con người bao gồm các loại ung thư khác nhau bao gồm: đại tràng, vú, và tuyến tiền liệt. Nhiều kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy việc sử dụng các axit béo omega-3 để cải thiện tình trạng bệnh tiểu đường hoặc để điều trị về rối loạn nhận thức ở trẻ em. Axit béo này cũng có ảnh hưởng quan trọng theo hướng tích cực đến hoạt động hệ thống thần kinh trung ương, cần thiết cho sự phát triển chức năng não bộ và thị giác ở trẻ nhỏ, não bộ không thể duy trì hoạt động nếu như không có những axit béo quan trọng này [59]. Mức độ thu nhận DHA hàng ngày được khuyến cáo là 120 mg/ngày đối với nam giới và 100 mg/ngày đối với phụ nữ và người cao tuổi. Tuy nhiên ở các nước phương Tây, hàm lượng axit béo omega - 3 trong khẩu phần ăn vẫn không đầy đủ. Để ngăn ngừa các loại bệnh khác nhau mà chủ yếu là các bệnh tim mạch và các rối loạn tâm thần thì hàm lượng axit béo omega - 3 thích hợp trong khẩu phần ăn là hết sức cần thiết. Một phương pháp để đảm bảo hàm lượng axit béo omega - 3 trong khẩu phần ăn là làm tăng hàm lượng các axit béo này trong các sản phẩm thức ăn như thịt, bơ, sữa, pho mát, trứng… [12]. Để bảo đảm khẩu phần thức ăn hợp lý, có ảnh hưởng tốt cho sức khỏe con người thì cần thiết phải tăng hàm lượng ω-3 PUFA và giảm ω-6 PUFA. Quỹ tài trợ Dinh dưỡng của Anh đã đưa ra khuyến cáo tỷ lệ giữa ω-6 và ω-3 PUFA nên nằm giữa 5:1 và 3:1 [13]. 1.2.2. Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản Để có thể được sử dụng trong NTTS, các loài vi tảo phải đáp ứng nhiều điều kiện như dễ dàng nuôi cấy, không độc, có kích thước vừa với miệng của đối tượng nuôi, dễ tiêu hóa và có hàm lượng dinh dưỡng cao. Hàm lượng protein là một yếu tố chính để xác định giá trị dinh dưỡng của vi tảo. Song bên cạnh đó, PUFAs như axit 6 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học EPA, ARA, và DHA cũng là thành phần rất quan trọng bởi nó cần thiết cho sự phát triển và biến thái của ấu trùng [8, 10]. Tuy nhiên, cần chú ý là tỷ lệ giữa DHA, EPA và ARA có thể còn quan trọng hơn rất nhiều so với hàm lượng của chúng. Hàm lượng vitamin có trong vi tảo cũng có một vai trò quan trọng. Để cung cấp đủ dinh dưỡng một cách cân bằng và cải thiện được sự phát triển của động vật nuôi, rất nhiều công bố khoa học đã khuyên cáo nên sử dụng hỗn hợp các loài. Điều này sẽ mang tới một thành phần dinh dưỡng thức ăn cho kết quả tốt hơn so với chế độ ăn chỉ có một loài [41]. Trong một số nghiên cứu về làm giàu luân trùng Brachionus plicatilis và được sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng Artemia salina trong trại sản xuất giống thủy sản ở Ai Cập đã cho thấy khi sử dụng tảo Tetraselmis chuii có các PUFAs với hàm lượng ARA đạt 5,5% ; EPA - 4,8% và DHA - 5,0% so với TFA đã làm tăng tốc độ sinh trưởng và khả năng sống sót, nâng cao giá trị dinh dưỡng của luân trùng. Do đó đã làm tăng khả năng sống sót và giúp cho ấu trùng nuôi phát triển tốt nhất [44]. 1.3. Nguồn cung cấp PUFA 1.3.1. Nguồn gốc từ thực vật Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa các axít béo không bão hòa có mạch cácbon ≤18. Trong đó các loại dầu thực vật như dầu lanh, dầu đậu nành, dầu cải… chứa PUFA ω-3 chủ yếu là axít ALA (18:3 ω-3) và các loại dầu khác như dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu là các PUFA ω-6 (18:2 ω-6) như trong nghiên cứu của Tsamouris và cộng sự (2002) [75] được thể hiện ở bảng 1.1. Ngoài ra còn một số nghiên cứu khác trên hạt tía tô cho thấy dầu hạt tía tô có chứa các PUFAs với tỷ lệ cao bao gồm chủ yếu là ω-3 α-linolenic (C18: 3), ω-6 linoleic (C18: 2) và ω-9 oleic (C18: 1) axit [60]. Hàm lượng lipit tổng số đạt 33,2542,58% SKK, trong đó, axit ω-3 α-linolenic chiếm 52,58-61,98% và axit ω-6 linoleic chiếm 10,54-15,87%. Tỷ lệ axit béo ω-6/ω-3 là thấp 0,2-0,26 trong hạt tía tô của Trung Quốc đã được công bố [24]. 7 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học Bảng 1.1. Hàm lƣợng các axít béo omega-3 và omega-6 có trong một số loại dầu thực vật [75] TT Dầu thực vật Hàm lƣợng axít béo omega-3 và omega-6 (% so với TFA có trong dầu thực vật) Linoleic (C18:2 ω -6) Linolenic (C18:3 ω-3) 1 Dầu Hồ Đào 55 -70 2 -8 2 Dầu đậu tƣơng 53 -55 4 -7 3 Dầu hƣớng dƣơng 63 -68 <1 4 Dầu ngô 50 -58 <1 5 Dầu cải 18 -22 9 -10 6 Dầu bông 53 -55 <1 7 Dầu lanh 15 -17 50 -53 8 Dầu lạc 32 -33 - 9 Dầu vừng 44 -46 <1 10 Dầu ôliu 9 -11 <1 1.3.2. Nguồn gốc từ động vật Các axit béo phổ biến trong thực phẩm có từ 12 đến 22 nguyên tử cacbon nguyên tử trong khi các sinh vật biển như cá có từ 14 đến 22 nguyên tử cacbon. Các axit béo phổ biến nhất ở động vật, thực vật và vi sinh vật (VSV) là axit palmitic (16:00), axit stearic (18:00), axit oleic (18:1 ω-9) và palmitoleic (16:1). Axit arachidonic (20:4 ω-6) là một thành phần chính của màng phospholipit động vật. Axit EPA (20:5 ω-3) và axit DHA (22:6 ω-3) là thành phần chủ yếu trong tảo biển và cá biển [66]. Một số các axit béo omega-3 cần thiết cho sức khỏe con người có nguồn gốc từ các loại cá biển như công bố của Patterson năm 2008 trên các đối tượng cá ngừ, cá hồi, cá thu, cá mòi và cá trích ở biển sâu có hàm lượng EPA và DHA cao trong dầu cá được thể hiện trong bảng 1.2 [59]. 8 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học Bảng 1.2. Hàm lƣợng DHA và EPA của một số loại cá [59] Loại cá EPA + DHA (mg/100g) Cá nuôi 1400 Cá trích 1700-1800 Cá thu 340-1570 Cá hồi 680-1830 Cá mòi 980-1700 Cá ngừ 240-1280 Trong năm 2010, cá hồi được sản xuất tại Na Uy khoảng 1 triệu tấn, chiếm 68% tổng sản lượng cá hồi Đại Tây Dương trên toàn thế giới. Theo Siri Tømmerås (2011) [70] cho thấy cá hồi Đại Tây Dương có tổng hàm lượng chất béo 6,05%, hàm lượng EPA và DHA là 0,19 g và 0,36 g/100 g cá phi lê, tỷ lệ ω-6/ω-3 là 0,07, hàm lượng axit oleic (18:1 ω-9), acid linoleic (LA, 18:02 ω-6) và α-linoleic acid (ALA, 18:03 ω-3) là 15,86%; 1,38 % và 0,85%, tương ứng. Trong 10 năm trở lại đây, nhu cầu PUFAs ω-3 ngày càng tăng do sự gia tăng sử dụng chúng trong NTTS, làm thực phẩm chức năng và dược phẩm. Do vậy, những nguồn nguyên liệu chính không đáp ứng đủ cho việc mở rộng kinh doanh sản xuất. Để đáp ứng nhu cầu cao và hạn chế những nhược điểm của dầu cá, việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới cho sản xuất PUFA hiện nay đang được quan tâm nghiên cứu và phát triển [81] trong đó khai thác những nguồn PUFA từ VSV [23] để bảo đảm bảo các nguồn PUFA ω-3 sản xuất đã được chấp nhận rộng rãi. 1.3.3. Nguồn gốc từ vi tảo Cá và dầu cá là nguồn chủ yếu cung cấp PUFAs nhưng những vấn đề về an toàn đang được đặt ra bởi khả năng tích lũy các PCBs hoặc dioxin, kim loại nặng .... Hơn thế nữa ứng dụng của dầu cá ở dạng thực phẩm bổ sung bị giới hạn bởi những vấn đề liên quan tới mùi vị khó chịu, tính kém ổn định về mặt oxi hóa. Đối với những ứng dụng nhất định, dầu cá lại không phù hợp vì sự hiện diện của hỗn hợp nhiều loại axit béo. Vì PUFAs được tìm thấy trong cá ăn vi tảo ở đại dương nên theo một cách logic vi tảo được coi là nguồn tiềm năng để sản xuất PUFAs. 9 Lê Thị Thơm - K16