Tài liệu Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của Enzyme Phytase từ nấm Aspergillus niger

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM Aspergillus niger CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG NGUYỄN CÔNG DANH MSSV: 4084238 LỚP: CNSHTT K 34 CẦN THƠ 5/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG NGUYỄN CÔNG DANH XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Dương Thị Hương Giang đã tận tâm hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo dõi sát tiến trình thí nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô giảng viên Lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến Khóa 34 của Trường Đại học Cần Thơ cùng bạn bè đã góp ý, động viên, hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại Trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô và các anh chị phụ trách các Phòng thí nghiệm, đặc biệt là bạn Nguyễn Văn Tính đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và hỗ trợ chúng tôi sử dụng trang thiết bị thuận lợi và hiệu quả. Tôi gửi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến Cha Mẹ và anh chị em trong gia đình vì đã hỗ trợ rất nhiều về tinh thần cũng như vật chất, giúp tôi có thể an tâm làm thí nghiệm trong thời gian vừa qua. Ngoài ra, chúng tôi xin ghi nhận và trân trọng sự hỗ trợ nhiệt tình của các anh chị làm luận văn Cao Học khóa 18, các bạn sinh viên khóa 34 tiên tiến trong việc hỗ trợ tài liệu, phụ giúp thí nghiệm, trao đổi và tranh luận về tiến trình thí nghiệm cũng như khả năng ứng dụng trong tương lai. Tôi xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 10 tháng 5 năm 2013 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Mục tiêu của nghiên cưú là tinh sạch và khảo sát các đặc điểm của enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger được phân lập bởi Trần Nguyễn Nhật Khoa. Kết quả chỉ ra rằng enzyme phytase ngoại bào từ nấm A. niger có thể được tinh sạch qua các bước tủa bằng ammonium sulfate với 80% bảo hòa, sắc ký trao đổi ion trên gel SPStreamline và sắc ký tương tác kỵ nước trên gel Pheny-Sepharose. Phytase sau khi tinh sạch có hoạt tính gấp 12,56 lần so với phytase trong dung dịch thô với hoạt tính thu hồi 48%. Điện di SDS-PAGE cho thấy rằng phytase được tinh sạch có trọng lượng phân tử vào khoảng 87kDa. Nhiệt độ tối ưa cho hoạt động của enzyme vào khoảng 65°C . Sự ảnh hưởng của ion Ca2+ thể hiệ rõ nhất ở nồng độ 40mM. Từ khóa: Aspergillus niger, tương tác kỵ nước, sắc ký trao đổi ion, SP-Streamline, Phenyl Sepharose, phytase.a Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang TÓM LƯỢC................................................................................................................ i MỤC LỤC ..................................................................................................................ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................... iv DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................vi CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................ 1 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .2 2.1. Aspergillus niger .................................................................................................. 2 2.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................... 2 2.1.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 2 2.1.3. Ứng dụng ................................................................................................... 2 2.2. Acid phytic .......................................................................................................... 3 2.2.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................ 3 2.2.2. Chức năng sinh lý ...................................................................................... 4 2.2.3. Sự phổ biến, phân bố và hàm lượng..............................................................4 2.3. Phytase ................................................................................................................ 5 2.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................ 5 2.3.2. Đặc điểm ................................................................................................... 5 2.3.3. Ứng dụng......................................................................................................7 2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên ............................................................. 8 2.5. Phương pháp tinh sạch protein .......................................................................... 9 2.5.1. Phương pháp tủa protein ............................................................................ 9 2.5.2. Phương pháp sắc ký ................................................................................... 9 2.6. Một số nghiên cứu về tinh sạch và khảo sát đặc điểm phytase ...................... 13 2.6.1. Tinh sạch và khảo sát đặc điểm phytase từ nấm ....................................... 13 2.6.2. Tinh sạch phytase và khảo sát đặc điểm từ vi khuẩn ................................ 14 2.6.3. Tinh sạch phytase và khảo sát đặc điểm từ thực vật ................................. 15 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 16 3.1. Phương tiện nghiên cứu .................................................................................... 16 3.1.1. Thời gian và địa điểm .............................................................................. 16 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 3.1.2. Nguyên liệu ............................................................................................. 16 3.1.3. Thiết bị - Dụng cụ .................................................................................... 16 3.1.4. Hóa chất................................................................................................... 16 3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 17 3.2.1. Thu nhận và tinh sạch phytase.................................................................. 17 3.2.2. Thí nghiệm khảo sát một số đặc điểm của phytase tinh sạch .................... 19 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ............................................................. 24 4.1. Thu nhận và tinh sạch phytase ......................................................................... 24 4.1.1. Thu nhận phytase thô ................................................................................ 24 4.1.2. Tinh sạch phytase ...................................................................................... 24 4.1.2.1. Tinh sạch sơ bộ phytase bằng phương pháp tủa ............................... 24 4.1.2.2. Tinh sạch phytase bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion......................... 25 4.1.2.3. Tinh sạch phytase bằng kỹ thuật sắc ký tương tác kỵ nước .............. 27 4.2. Khảo sát một số đặc điểm của phytase tinh sạch ............................................. 31 4.2.1. Ảnh hưởng của ion Ca2+ đến hoạt tính phytase ......................................... 31 4.2.2. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của phytase ............................................... 32 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ .................................................................. 34 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 34 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 35 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT APS: Ammonium persulfate BSA: Bovin Serum albumin DEAE: Diethylaminoethyl EC: Enzyme Classification EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamidegel electrophoresis SP: Sulphopropyl TEMED: N, N, N’, N’ –tetra methyl ethylene diamine TCA: Trichloroacetic acid Tris: Tris-[hydroxymethyl]aminomethane Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Một số đặc điểm của phytase từ các loài khác nhau ........................................ 6 Bảng 2. Tổng kết các bước tinh sạch…………………………………………………27 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc hóa học của acid phytic ..................................................................... 4 Hình 2. Hoạt động thủy phân acid phytic của phytase .................................................. 5 Hình 3. Sơ đồ quy trình nuôi cấy và trích ly phytase thô từ sinh khối A. niger ........... 17 Hình 4. Sơ đồ quy trình tinh sạch phytase .................................................................. 19 Hình 5. Bảng điện di SDS-PAGE sau tủa phân đoạn ammonium sulfate…………….22 Hình 6. Sắc ký đồ trên cột SP-Streamline…………………………………………….23 Hình 7. Bảng điện di SDS-PAGE sau sắc ký trao đổi ion…………………………….23 Hình 8. Sắc ký đồ trên cột Phenyl Sepharose................................................................24 Hình 9. Bảng điện di SDS-PAGE sau sắc ký tương tác kỵ nước……………………..26 Hình 10. Sơ đồ quy trình tinh sạch phytase…………………………………………...29 Hình 11. Ảnh hưởng của ion Ca2+ lên hoạt tính phytase……………………………...30 Hình 12. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase……………………………...31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Phytate (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chính phospho trong thực vật. Chúng chiếm 1-3% trong hạt của các loại ngũ cốc và cây họ đậu và 60-80% trong tổng số phospho của thực vật (Nelson, 1967). Phospho trong thức ăn của các loài động vật như gia súc, gia cầm kể cả con người đều tồn tại dưới dạng phytate hay phytic acid. Trong dạ dày của các loài động vật này và con người thiếu enzyme phytase có thể tiêu hóa được phytate nên hợp chất này thường không được hấp thụ mà bị thải ra ngoài qua con đường bài tiết qua phân gây ô nhiễm môi trường (Mullaney et al., 2000). Do đó, người chăn nuôi cần bổ sung một lượng lớn phospho vô cơ hoặc enzyme phytase thủy phân phytate cung cấp phospho hấp thu tốt trong đường tiêu hóa. Sử dụng phytase trong thức ăn gia súc sẽ giúp giảm lượng phospho vô cơ cung cấp trong thức ăn, đồng thời cũng làm giảm bài tiết phospho ra ngoài môi trường. Sản xuất enzyme phytase đang ngày càng được chú trọng trong công nghiệp chăn nuôi, cho nên việc tìm kiếm nguồn enzyme dồi dào là cần thiết. Phytase được sinh tổng hợp ở thực vật cũng như ở vi sinh vật, đặc biệt là trong nấm. Phytase được sản xuất từ các nguồn như vi khuẩn (Bacillus sp., Enterbacteria sp.), hay từ nấm sợi (Aspergillus sp., Penicillin sp., Mucor sp.). Trong đó nấm mốc A. niger là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Dựa trên các nghiên cứu trước đây về điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng A. niger sinh tổng hợp phytase cao, A. niger đã được phân lập ở phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme-Viện CNSH (Trần Nguyễn Nhật Khoa, 2012). Để tiếp nối, đề tài “Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger” được thực hiện nhằm mục đích ly trích enzyme phytase từ dòng nấm này và trải qua các bước tinh sạch, cùng với việc khảo sát một số đặc điểm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme phytase, để có thể ứng dụng hữu hiệu hơn trong thực tiễn chăn nuôi gia súc gia cầm và thủy sản. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Aspergillus niger A. niger là một loài nấm mốc phổ biến nhất của chi Aspergillus. A. niger phân bố phổ biến trong môi trường đất, thực vật và không khí (Samson et al., 2001). 2.1.1. Vị trí phân loại Ngành : Eumycota Ngành phụ : Deuteromycotina Lớp : Hypomycetes Bộ : Euhypomycetidae Họ : Phialoconidiae Giống : Aspergillus Loài : Aspergillus niger A. niger thuộc giống phụ Circumdati, nhóm Nigri. Nhóm Nigri bao gồm 15 loài liên quan có bào tử màu đen, bao gồm cả A. tubingensis, A. foetidus, A. carbonarius, và A. awamori (Samson et al., 2004). 2.1.2. Đặc điểm hình thái Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại: - Khuẩn ty dinh dưỡng (vegetative mycelium): là các khuẩn ty phát triển sâu vào cơ chất và hấp thụ các chất dinh dưỡng chứa trong cơ chất để phát triển. - Khuẩn ty sinh sản (reproduction mycelium): khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt. Chúng hướng vào không khí để lấy oxy. Khi già chúng có khả năng tạo bào tử đính có màu đen. 2.1.3. Ứng dụng A. niger được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp. Nhiều chủng A. niger được sử dụng trong sản xuất acid citric (E330) và acid gluconic (E574) và đã được Tổ chức Y tế Thế giới chấp nhận được sử dụng trong thức ăn hàng ngày. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Nhiều enzyme hữu ích được sản xuất công nghiệp từ A. niger. Ví dụ, glucoamylase được sử dụng trong sản xuất xi-rô ngô fructose cao và pectinase được sử dụng làm trong rượu táo và rượu vang. Alpha-galactosidase, một loại enzyme phân hủy các loại đường phức tạp, là thành phần của các loại thuốc có tác dụng làm giảm đầy hơi. Trong khoảng thời gian gần đây, các nghiên cứu về đặc điểm và ứng dụng của phytase từ A. niger được tiến hành ngày càng nhiều chứng tỏ khả năng ứng dụng của loại phytase tách chiết từ loại nấm này. Papagianni et al. (2001) đã khảo sát điều kiện nuôi cấy A. niger để thu nhận phytase hoạt tính cao. Sariyska et al. (2005) và Greiner et al. (2009) cũng đã tinh sạch và đặc điểm hóa phytase từ A. niger hoang và A. niger 11T53A9. Phytase của A. niger - PhyB hoạt động xúc tác tối ưu ở pH trung bình 2,5. Tuy nhiên pH ở dạ dày của động vật lại nằm trong khoảng cao hơn 3,0-3,5. Weaver et al. (2007) đã nghiên cứu và cho ra dòng đột biến A. niger E272K với pH tối ưu từ 2,53,2. Ngoài các ứng dụng kể trên chủng A. niger còn được nuôi cấy để tách các enzyme glucose oxidase (GO) và Alpha-galactosidase (AGS). Glucose oxidase được sử dụng như chất cảm biến sinh học glucose (Staiano et al., 2005). Alphagalactosidase có thể được sản xuất bởi A. niger ứng dụng trong thủy phân liên kết alpha 1-6 của melibiose , raffinose và stachyose . Prolyl endoprotease ở A. niger (AN-PEP) là một prolyl endoprotease có nguồn gốc từ vi sinh vật, có khả năng phân giải gluten, đã được nghiên cứu để ứng dụng trong việc điều trị bệnh celiac (Mitea et al., 2008), một loại dị ứng thường gặp ở những người bị dị ứng với chất gluten trong lúa mì và những ngũ cốc khác. Nghiên cứu này đã được bắt đầu vào 2008 trên nhũng người mắc bệnh celiac để xác định hiệu quả của phytase trong điều trị bệnh (Mulder, 2009). 2.2. Giới thiệu chung về phytic acid và muối phytate 2.2.1. Acid phytic 2.2.1.1. Cấu trúc hóa học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Hình 1. Cấu trúc hóa học của acid phytic (Afinah et al. 2010) Các cấu trúc hóa học của acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen phosphate (IUPAC-IUB, 1977) với gốc phosphate vị trí 2 là vị trí trục, các gốc phosphate ở vị trí khác là vị trí xích đạo (Johnson và Tate, 1969). Cấu trúc này được mô tả như trong hình 1. 2.2.12. Chức năng sinh lý Acid phytic có tác dụng trong việc dự trữ năng lượng, dự trữ phospho, dự trữ cation và cũng là nguồn dự trữ chính myo-inositol (một tiền chất của thành tế bào). Ngoài ra acid phytic có vai trò như là một chất chống oxy hóa tự nhiên trong hạt và tham gia vào việc chống ung thư ở động vật. Các loài động vật khi ăn các loại hạt có chứa nhiều acid phytic sẽ có thể chống lại các quá trình hình thành và phát triển của các tế bào ung thu trong cơ thể. 2.2.1.3. Sự phổ biến, phân bố và hàm lượng Dạng tồn tại chủ yếu của acid phytic là muối của các cation hóa trị một, hai, ba và hỗn hợp của các ion này trong hạt ngũ cốc và cây họ đậu, chúng tích tụ trong các hạt tinh bột mì (Reddy et al., 1989). Ferguson và Bollard (1976) cho thấy 99% phytate trong lá mầm và 1% trong phôi của các hạt đậu khô. Hàm lượng phytate cao nhất được tìm thấy trong ngô (0,83-2,22%) và trong đậu que (5,92-9,15%) (Reddy et al., 1989). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 2.3. Phytase 2.3.1. Giới thiệu chung Phytase là một enzyme phổ biến trong tự nhiên được tìm thấy ở động vật, thực vật, tảo và trong một loạt các vi sinh vật (nấm mốc, nấm men và vi khuẩn). Phytase xúc tác sự thủy phân của acid phytic tạo phosphate vô cơ và myoinositol ít gốc phosphate, và trong một số trường hợp tạo myo-inositol tự do (hình 2). Danh pháp của phytase theo Hiệp hội Sinh hoá quốc tế phân biệt hai loại: 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26). Phân loại này dựa trên nhóm phosphate đầu tiên được thủy phân bởi phytase. 3-phytase là enzyme điển hình ở vi sinh vật và 6phytase là ở thực vật. Hình 2. Hoạt động thủy phân acid phytic của phytase (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S014102299700210X) 2.3.2. Đặc điểm Đặc điểm cấu trúc Đa số các phytase cho đến nay có cấu trúc đơn phân (monomeric). Đây là trường hợp với phytase nấm (Wyss et al., 1998; Ullah và Gibson, 1987; Dvorakova và Kopecky, 1997), với phytase E. coli và K. terrigena (Greiner et al., 1993; Greiner et al., 1997), và với phytase B. subtilis (natto) (Shimizu, 1992). Tuy nhiên, một số phytase ở thực vật và ở động vật lại có cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị. Đặc hiệu cơ chất Phytase hiển thị đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenyl phosphate, 1,6-bisphosphate fructose, 6-phosphate glucose, α-và βglycerophosphate và 3-photphoglyxerate không có cấu trúc tương tự như acid phytic, cũng thường được thủy phân bởi phytase. Chỉ có một vài phytase được miêu tả là đặc Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT hiệu cho acid phytic: các phytase Bacillus (Powar và Jagannathan, 1982; Shimizu, 1992) và phytase kiềm phân lập từ phấn hoa lily (Barrientos và Muthy, 1994). pH và nhiệt độ tối ưu (Bảng 1). Hầu hết các phytase vi sinh vật có pH tối ưu giữa 4,5 và 5,6. Phytase A. fumigatus có khoảng pH tối ưu rộng; ít nhất 80% hoạt động tối đa tại các giá trị pH giữa 4,0 và 7,3. Một số phytase vi khuẩn, đặc biệt từ Bacillus, có pH tối ưu 6,5-7,5. pH tối ưu của phytase ở hạt giống cây trồng trong khoảng 4,0-7,5. Hai phytase kiềm từ thực vật có pH tối ưu 8,0 đã được mô tả trong hạt họ đậu (Scott, 1991) và phấn hoa lily (Hara et al., 1985) Bảng 1. Một số đặc điểm của phytase từ các loài khác nhau Loài Nhiệt độ tối pH tối ưu pI ưu (oC) Trọng lượng phân tử (kDa) A. niger (Natuphos) 55 5,5 4,78 66 A. nigerNRRL3135 55 2,5 và 5,5 - - A. niger SK-57 50 2,5 và 5,5 - 60 A. niger 113 60 2,0 và 5,0 4,63 64 A. terreus 9A1 49 5,5 5,08 61 A. terreus CBS 45 5,3 5,5 82 A. fumigatus 60 4,0 – 7,3 7,28 72 E. nidulans 45 6,5 5,27 66 M. thermophila 55 5,5 4,95 63 T. thermophilus 45 - 5.23 128 7,01 47 - 43 E. coli B. subtilis - 2,5 - 7,0 55 7.0 (Nguồn: Xiong et al., 2004 ) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Dãy nhiệt độ tối ưu của phytase trải dài từ 40 oC đến 70 oC. Trong đó, phytase của Bacillus sp. DS11 có nhiệt độ tối ưu khá cao (70 oC). Ngoài ra ion Ca2+ có tác dụng bảo vệ phytase chống lại sự biến tính nhiệt (Kim et al., 1998). 2.3.3. Ứng dụng Phytase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như chăn nuôi, thủy sản, chế biến thực phẩm, sản xuất myo-inositol phosphate, công nghiệp giấy và bột giấy. Ngoài ra enzyme này còn có ứng dụng trong nông nghiệp, làm gia tăng độ phì của đất trồng. Ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi Các loài vi sinh vật trong dạ cỏ của động vật nhai lại có tác dụng sản sinh phytase để thủy phân phytate mà động vật nhai lại ăn vào, các phospho vô cơ tạo ra từ sự thủy phân này được cả vi sinh vật và động vật nhai lại sử dụng. Đa số các loại vi sinh vật này thuộc nấm và các vi sinh vật kỵ khí. Động vật có dạ dày đơn như lợn, gia cầm, cá không có enzym phytase nên không thể chuyển hóa acid phytic. Vì vậy, phospho vô cơ được thêm vào thức ăn của chúng để đáp ứng yêu cầu phospho. Điều này làm tăng chi phí và gây ô nhiễm phospho vô cơ. Việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi làm giảm lượng phospho trong phân và giảm ô nhiễm môi trường. Một số kết quả nghiên cứu cho rằng nếu phytase được sử dụng trong các nguồn cung cấp thức ăn cho tất cả động nuôi có vật dạ dày đơn ở Mỹ sẽ giải phóng lượng phospho trị giá 168 triệu đô la Mỹ và sẽ giảm 8,23x104 tấn phospho thải ra môi trường mỗi năm. Việc sử dụng phytase bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được phê duyệt ở 22 quốc gia. FDA (Cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ) đã phê duyệt phytase GRAS (thường được coi là an toàn) (Wodzinski và Ullah, 1996). Phytase được bổ sung vào khẩu phần thức ăn của lợn có chứa ngô và đậu tương sẽ chuyển đổi khoảng một phần ba lượng phospho từ dạng không hấp thu sang dạng hấp thu được (Cromwell et al, 1993). Các thí nghiệm bổ sung phytase vào thức ăn của lợn và gà cũng cho kết quả tương tự (Cromwell et al., 1995; Yi et al., 1996; O'Quinn et al., 1997). Ở Hà Lan, phytase của A. niger đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, làm giảm 30 - 40% ô nhiễm phospho (Jongbloed et al., 1992). Phytase bổ sung vào thức ăn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT chăn nuôi phải có một số đặc điểm nhất định. Đặc biệt, các enzyme cần phải chịu được nhiệt độ cao. Ứng dụng trong thực phẩm Phytate có trong ngũ cốc, rau đậu và protein đậu nành với hàm lượng cao, do đó những người ăn chay, người dân ở các nước kém phát triển ăn bánh mì không qua lên men, những người tiêu thụ nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ đậu nành sẽ bị tích tụ một lượng phytate với hàm lượng cao trong cơ thể (Simell et al, 1989). Phytate không tiêu hoá được trong ruột non ảnh hưởng tiêu cực đến sự hấp thu của kẽm, canxi, magiê và sắt. Nó cũng làm giảm khả năng tiêu hóa của protein và ức chế các enzyme trong hệ tiêu hóa. Anno et al. (1985) đã loại phytate từ sữa đậu nành bằng cách sử dụng phytase từ lúa mì. Bổ sung phytase của A. niger vào bột có chứa cám lúa mì để tăng hấp thu sắt ở người (Sandberg et al., 1996). Sản xuất Myo-Inositol phosphate Inositol phosphate và phospholipid có vai trò quan trọng trong truyền tín hiệu ở màng và huy động calci dự trữ nội bào (Billington, 1993). Hơn nữa, inositol triphosphate đã được đề xuất để ngăn ngừa hoặc giảm nhẹ một số bệnh viêm nhiễm như viêm khớp và các bệnh đường hô hấp như hen suyễn (Siren et al., 1992). Việc sử dụng inositol triphosphates là thuốc giảm đau cũng đã được đề nghị (Siren, 1995). Các ester của inositol triphosphate có tác dụng chống nhiễm trùng retrovirut trong đó có HIV (Siren, 1998). Ứng dụng trong công nghiệp giấy và bột giấy Việc loại bỏ các acid phytic thực vật là giai đoạn quan trọng trong ngành công nghiệp bột giấy và giấy. Các phytase chịu nhiệt có thể làm giảm acid phytic trong chế biến bột giấy và giấy. Sự phân giải acid phytic bởi enzyme sẽ không gây ung thư và giảm độc tính trong sản phẩm. Vì vậy, việc khai thác phytase trong công nghiệp bột giấy và giấy là biện pháp thân thiện môi trường hỗ trợ cho việc phát triển công nghệ sạch (Liu et al., 1998). 2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên 2.4.1. Phytase từ vi sinh vật Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Vi sinh vật là nguồn cung cấp phytase chủ yếu trong tự nhiên. Đa số các phytase từ vi khuẩn là những phytase nội bào. Ngược lại, các loại phytase ngoại bào được tìm thấy trong sợi nấm, đặc biệt chi Aspergillus có 28 loài có khả năng sản xuất phytase ngoại bào. Loài Aspergillus niger được xem là nguồn sản xuất phytase tốt nhất (Gargova et al., 1997). Phytase cũng được tìm thấy ở các vi khuẩn như Pseudomonas sp. (Richardson và Hadobas, 1997), Bacillus subtilis (Powar và Jaganathan, 1982), Bacillus sp. DS11 (Kim et al., 1998), Klebsiella sp. (Tambe et al., 1994; Greiner et al., 1997), E. coli (Greiner et al., 1993) and Enterobacter (Yoon et al., 1996). Trong đó chỉ có phytase những loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Enterobacteria là những phytase ngoại bào. Ngoài ra, nấm men cũng là nguồn sản sinh phytase. S. Cerevisiae (Nakamura et al., 2000) and Schwanniomyces castellii (Lambrechts et al., 1992) có khả năng sản xuất cả phytase ngoại bào và nội bào. 2.4.2. Phytase từ thực vật Phytase có vai trò quan trọng trong quá trình nảy mầm của thực vật , chúng phân giải phytate cung cấp phosphate, chất khoáng, và đường myo-inositol giúp cây phát triển và tăng trưởng. Chúng tồn tại hầu hết ở hạt và phấn hoa ở thực vật bậc cao như ngũ cốc, cây họ đậu, hạt cây có dầu (Reddy et al., 1989). Hoạt tính phytase cao nhất được tìm thấy ở lúa mạch đen, lúa mạch và lúa mì. 2.4.3. Phytase từ mô động vật Các báo cáo về phytase có nguồn gốc từ động vật được tiến hành vào năm 1908, phytase được tìm thấy trong gan và máu bò con (McCollum và Hart, 1908). Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu về phytase trong máu của động vật có vú không thành công và phytase chỉ được tìm thấy trong máu của động vật có xương sống thấp hơn như chim, bò sát và cá (Rapoport et al., 1941). Ngoài ra phytase còn được phát hiện trong niêm mạc ruột non của chuột, thỏ, chuột lang, bò con và người (Bitar và Reinhold, 1971; Cooper và Gowing, 1983; Iqbal et al., 1994). 2.5. Phương pháp tinh sạch protein 2.5.1. Phương pháp tủa protein 2.5.1.1. Phương pháp tủa bằng muối Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Có nhiều loại muối có thể được dùng để tủa protein như muối (NH4)2SO4, NaCl… vì các muối này vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp áo nước của phân tử protein. Các protein có thể được kết tủa ở các nồng độ muối khác nhau, do đó dung dịch muối được dùng để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp chứa chúng. Thuận lợi của phương pháp tủa bằng muối là ít làm ảnh hưởng đến sự biến tính của phytase. Tuy nhiên, dịch trích enzyme sau khi tủa cần được thẩm tích loại muối. 2.5.1.2. Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Những chất có hằng số điện môi lớn như nước, dimethylsulfoxide,… có khả năng ổn định sự tương tác giữa các chất này với các phân tử protein tạo điều kiện cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ như aceton, ethanol… sẽ ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol có nhiều thuận lợi và được áp dụng nhiều hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. 2.5.2. Phương pháp sắc ký (Dương Thị Hương Giang, 2010) Phương pháp sắc ký là kỹ thuật phân tách một chất trong dung dịch bao gồm nhiều chất tương tự nhau bằng cách cho hỗn hợp di chuyển qua hệ thống pha tĩnh (giá thể trên cột sắc ký) với chất mang là pha động (dung môi). Sự phân tách xảy ra do các chất trong hỗn hợp tương tác với pha tĩnh ở các mức độ khác nhau. Chất cần phân tách phải tương tác thuận nghịch với pha tĩnh để có thể dễ dàng rửa giải ra khỏi cột sắc ký. 2.5.2.1. Sắc ký trao đổi ion Nguyên tắc: Sắc ký trao đổi ion dựa trên sự khác biệt về điện tích của các phân tử để phân tách chúng thành các thành phần riêng biệt. Protein mang điện tích âm hay dương trên bề mặt tùy vào pH của môi trường (nếu pH < pI thì protein tích diện dương Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT và ngược lại nếu pH > pI thì protein sẽ tích điện âm). Vì vậy có thể chọn loại gel thích hợp cho từng loại protein dựa vào pI và độ bền pH của chúng. Tương tác thuận nghịch giữa protein mang điện tích âm hay dương với các nhóm trao đổi ion mang điện tích trái dấu được cố định trên bề mặt các hạt gel (giá thể). Có 2 loại gel trao đổi ion:  Gel trao đổi ion dương: có các nhóm trao đổi ion mang điện tích âm, tương tác ion với các protein mang điện tích dương  Gel trao đổi ion âm: có các nhóm trao đổi ion mang điện tích dương, tương tác ion với các protein mang điện tích âm. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tương tác giữa protein và giá thể trên cột sắc ký trao đổi ion như mạng lưới điện tích của giá thể, lực ion của dung dịch, sự phân bố điện tích trên bề mặt protein, pH môi trường… Các protein được đẩy ra khỏi cột bằng gradient nồng độ muối tăng dần hay gradient pH tùy thuộc vào độ bền của protein trong dung dịch. Các yếu tố cần chú ý khi tiến hành sắc ký trao đổi ion Dung dịch đệm pH Việc chọn giá trị pH thích hợp rất quan trọng trong việc giữ các protein trong dung dịch lại trên cột. Các protein không bám được sẽ ra trước trong dung dịch đệm. Các giá thể trao đổi ion phải bền trong những điều kiện biến đổi pH của môi trường. Các ion cạnh tranh Các ion này sẽ cạnh tranh với protein trong việc gắn với các nhóm trao đổi ion trên giá thể. Ở một nồng độ thấp thích hợp có sự cạnh tranh ion thì protein có thể tương tác với các nhóm tích điện trái dấu trên cột trao đổi ion và bám vào cột. Ở nồng độ cao hơn các protein sẽ bị các ion cạnh tranh bám vào cột làm chúng không thể bám vào, việc này dẫn đến các protein sẽ bị rửa giải ra khỏi cột, protein nào không bám vào cột được hoặc bám vào cột yếu hơn sẽ bị rửa giải ra trước. Hầu hết các protein có thể được rửa giải khỏi cột ở nồng độ muối thấp hơn 1M. Tiến hành Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học