i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
-----------------*-------------------
HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG
TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR
CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
HÀ NỘI – 2014
ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
-----------------*-------------------
HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG
TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR
CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012
Chuyên ngành: Vi sinh Y học
Mã số
: 62.72.01.15
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Đặng Đức Anh
2. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai
HÀ NỘI – 2014
iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
NGHIÊN CỨU SINH
Hoàng Vũ Mai Phương
iv
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:
Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.
Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung Ương.
Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện
cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và
lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi
lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp
đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những
kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những
kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ
Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác
tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã
nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức
khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên
của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu.
Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết
lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành
quả ngày hôm nay.
Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013
HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG
v
MỤC LỤC
Trang phụ bìa.................................................................................................... i
Lời cam đoan..................................................................................................... ii
Lời cảm ơn......................................................................................................... iii
Mục lục .............................................................................................................. iv
Chữ viết tắt ........................................................................................................ vii
Danh mục bảng ................................................................................................. viii
Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ......................................................................... ix
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................... 1
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN............................................................................ 4
1.1. Vi rút cúm A ............................................................................................... 4
1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A................................................. 4
1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A.............................................................. 11
1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A ...................... 13
1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A ............................... 15
1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm............................................................. 16
1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A ......................................................................... 17
1.2. Phòng và điều trị cúm A ............................................................................ 18
1.2.1. Văc xin phòng cúm ................................................................................... 18
1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A ....................................................................... 20
1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới ....................................................................... 23
1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút ............ 25
1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine ..................... 25
1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir...................... 26
1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A...... 27
vi
1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc ................................................. 27
1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự
thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm ........................................................... 28
1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của
neuraminidase ..................................................................................................... 32
1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm........................................................... 34
CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 37
2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm ................................................................. 38
2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................... 38
2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm .................................................................................. 42
2.4. Phân tích số liệu.......................................................................................... 51
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ............................................................................... 53
3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 ............................ 53
3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A .......................... 54
3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A ....................................... 60
3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng
thuốc oseltamivir .............................................................................................. 65
3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam,
2001-2012 .......................................................................................................... 69
3.6. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ
nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn
nghiên cứu .......................................................................................................... 72
vii
CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN............................................................................. 86
4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu .......... 86
4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông
qua giá trị ức chế 50% (IC50)............................................................................... 88
4.3. Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc
oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam ..................... 94
4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến
và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian. ...................................................... 98
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 101
KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
viii
CHỮ VIẾT TẮT
ABI
APHL
Applied Biosystems
Association of Public Health Laboratories
(Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng)
ATSH
An Toàn Sinh Học
DNA
Deoxiribonucleic Acid
Global Influenza Surveillance and Response System
GISRS
(Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu)
IC50
Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút)
IQR
Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị)
International Society for Influenza and other Respiratory
ISIRV-AVG
Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về
cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm
nghiên cứu thuốc kháng vi rút)
Kb
Kilobase
NAI
Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase)
NIID
National Institute of Infectious Diseases - Japan
(Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản)
PCR
Polymerase Chain Reaction
pdm
Pandemic
PTN
Phòng Thí Nghiệm
RNA
Ribonucleic Acid
RT-PCR
Reverse transcription-polymerase chain reaction
SOP
Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn)
TCYTTG
Tổ chức Y tế Thế giới
US-CDC
WHO
United States- Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ)
World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1.
Các phân đoạn gen của vi rút cúm A ............................................................
6
3.1.
Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu .........
53
3.2.
Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu
và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn ................................ 56
3.3.
Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và
2009 .............................................................................................................
60
3.4.
Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm
2009 và 2011 ................................................................................................
61
3.5.
Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 ...........................
62
3.6.
Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 ................................
62
3.7.
Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với
oseltamivir................................................................................................64
3.8.
Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm
đột biến ........................................................................................................
70
3.9.
Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu
dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen)..........
71
x
DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Hình
Tên hình
Trang
1.1.
Cấu trúc vi rút cúm .......................................................................................
4
1.2.
Hình ảnh vi rút cúm ......................................................................................
4
1.3.
Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm ...........
10
1.4.
Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm ....................................................
10
1.5.
Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút ...........
12
1.6.
Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine ........................
21
1.7.
Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir ..........................................................
22
1.8.
Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase
trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào .............................................
23
2.1.
Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen ................................................
50
3.1.
Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1.............
66
3.2.
Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm
A/H1N1pdm09 .............................................................................................
67
3.3.
Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1..............
68
3.4.
Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1..............
69
3.5.
Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................
74
3.6.
Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 –
nhóm 2, 2001-2009 .......................................................................................
75
3.7.
Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................
76
3.8.
Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm
2, 2001-2009 ................................................................................................
77
3.9.
Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................79
3.10.
Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................80
3.11.
Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 .................................................
83
xi
3.12.
Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1 ................................84
3.13.
Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2.3.4 ...............................
84
Sơ đồ
2.1.
2.2.
Tên sơ đồ
Trang
Quá trình phân lập vi rút cúm ................................................................ 43
Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm ..........
45
Biểu đồ
Tên biểu đồ
Trang
3.1.
Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 .................
55
3.2.
Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên
cứu ...............................................................................................................
57
3.3.
Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong
nghiên cứu ................................................................................................58
3.4.
Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên
cứu ...............................................................................................................
58
3.5.
Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên
cứu ...............................................................................................................
59
4.1.
Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 ........................................
86
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn
đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở
Việt Nam. Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi
khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ
dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ
dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998,
dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Bệnh
cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá
trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa
Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên
21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc
biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao.
Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là
tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu
hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch
cúm. Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải
có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành. Ngoài ra, đáp ứng miễn
dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin
sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split
vaccine)…). Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine,
oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút
cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút
có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ
quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể
ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả
năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm
kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh
nhân và xã hội [28, 81, 90, 121].
Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn
cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan
2
truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như
mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN)
trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan.... Các nghiên cứu tập
trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ
hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng
thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các
nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1
lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến
2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009)
[27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với
amantadine.
Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên
chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại
học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37].
Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp
nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm
2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ
hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có
nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian
của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc.
Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành,
tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một
nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại
thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên
cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt
Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu:
-
Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi
rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam.
-
Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với
oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50).
3
-
Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy
cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu
vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.
4
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN
1.1. Vi rút cúm A
1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A
Cấu tạo chung
Vi
rút
cúm
thuộc
họ
Orthomyxoviridae gồm 3 típ A, B
và C, trong đó típ A và B thường
gây thành dịch, típ C gây bệnh
nhẹ và không lan thành dịch. Hệ
gen của vi rút cúm A là Axit
Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia
8 phân đoạn mã hoá cho 11
protein.
Hình 1.1. Cấu trúc vi rút cúm
Nguồn: http://viralzone.expasy.org/
Về
mặt
cấu
trúc,
nucleocapsid được bao bọc bởi
màng protein nền (M1), phía ngoài
màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là
lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng
sinh chất của tế bào chủ. Protein M2
đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài,
tạo thành các kênh ion, làm cho pH
trong endosome thay đổi, có vai trò
quan trọng trong việc hình thành hạt
Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm
vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại
Nguồn: www.nature.com
glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).
Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1
và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid
bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là
neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân
gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp
5
ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2
(polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein).
Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại
trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA
và các protein không cấu trúc NS (non structure).
Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A
Hệ gen của vi rút cúm A
Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút
cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần (Bảng 1). Đoạn RNA 1, 3, 4, 5
và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA. Mỗi phân
đoạn 2, 7 và 8 mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1NS2. Tại hai đầu mỗi phân đoạn gen có trình tự nucleotide bảo tồn gồm 13
nucleotide ở đầu 5' (5'-AGUAGAAACAAGG) và 12 nucleotide ở đầu 3'
(3'UCGUUUUCGUCC), trừ phân đoạn gen 1, 2, 3 và 7 nucleotide thứ 4 C thay
cho U [47]. Trình tự nucleotide này đặc trưng riêng cho vi rút cúm mà không tồn
tại ở các vi rút các, có ý nghĩa lớn trong việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử
phân tích trình tự gen của vi rút.
Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút
Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã
hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và
khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Protein HA được tổng hợp ở dạng
tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0. Dưới điều kiện pH axit và các enzyme
phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2,
kết với nhau qua cầu nối di-sulphua [19]. Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác
định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm
nhiễm.
6
Bảng 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A
Đoạn
RNA
Chiều dài
đoạn gen
(Nucleotide)
Protein
được mã
hóa
Chiều dài protein
được mã hóa
(Axit amin)
Chức năng
1
2341
PB2
759
Polymerase khởi đầu phiên mã
PB1
757
Kéo dài phiên mã, hoạt hóa
enzyme nội bào
PB1-F2
87
Thúc đẩy quá trình chết của tế
bào chủ
2
2341
3
2233
PA
716
Kéo dài phiên mã
4
1778
HA
550
Ngưng kết hồng cầu, bám gắn
xâm nhập vào tế bào chủ
5
1565
NP
498
Bám gắn với RNA, điều khiển
quá trình nhân lên của vi rút.
6
1413
NA
454
Giải phóng vi rút khỏi tế bảo
chủ
M1
252
Protein nền: Thành phần chính
của vi rút.
M2
97
Kênh ion, cởi áo và lắp ráp
thành phần vi rút
NS1
230
Protein đối kháng interferon,
điều khiển dấu ấn của vi rút
trên tế bào chủ
NS2
121
Chuyển RNA vi rút từ nhân ra
tế bào chất (trong tế bào chủ)
7
8
1027
890
7
Trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của người, HA gắn vào thụ thể α2,6 axit
sialic; đối với gia cầm, HA gắn vào thụ thể α2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có
mang cả hai loại thụ thể α2,3 axit sialic và α2,6 axit sialic. Ngoài ra, HA gắn vào
thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu người nhóm máu O, hồng cầu chuột lang, hồng
cầu ngỗng, hoặc gà tây gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu [118]. Năm vị trí
quyết định kháng nguyên khác cũng đã được xác định trên protein HA1, tương tác
với kháng thể của vật chủ. Các thay đổi có liên quan đến thay đổi đặc tính kháng
nguyên xảy ra chủ yếu trên phần HA1, do vậy, HA1 được sử dụng để tìm hiểu đặc
tính kháng nguyên và tiến hóa của vi rút.
Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme,
neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được
phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho
quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề
mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ. Việc loại
bỏ phần axit sialic khỏi phần HA mới được tổng hợp còn có tác dụng tránh sự tự
ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo
vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm. Neuraminidase cũng
đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Sự hoạt động của
neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết
của tế bào chủ. Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm
trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn
tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động
của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm
nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122].
Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt
heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút. Sử dụng HA để xác định
phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại
hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi
8
[105]. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1
đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9).
Dựa vào sự khác nhau về axit amin tại vùng đầu phía ngoài, neuraminidase của vi
rút cúm được chia làm 2 nhóm riêng biệt [109]:
Nhóm 1 gồm N1, N4, N5 và N8
Nhóm 2 gồm N2, N3, N6, N7 và N9.
Sự thay đổi axit amin tại vị trí 147-152 đã tạo nên vùng khác biệt về hình khối nằm
ngay cạnh vị trí hoạt động của N1 mà không xảy ra trên N2. Vùng khác biệt này có
thể được coi là vùng đích của thuốc kháng vi rút trong tương lai.
Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải
phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác
quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể
HA. Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị
trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1
tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V,
Q136K, R292K và N294S.
Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 được coi là gen có tính bảo tồn cao,
mã hóa cho hai protein M1 và M2. Protein M1 được mã hóa từ nucleotide vị tí 26
đến 784, protein M2 được tổng hợp qua quá trình ghép nối từ nucleotide vị trí 2651 và từ 740-1007 [19, 65]. Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp
vỏ của vi rút, làm cầu nối giữa các thành phần bên trong và các protein bề mặt của
vi rút, có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút,
tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi. M2 là một protein xuyên màng, phần ngoài tương
tác với hệ miễn dịch của vật chủ [54] và phần xuyên màng hoạt động như một kênh
ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, phá vỡ mối liên kết
protein-protein trên protein nền M1 với RNP, giải phóng các RNP của vi rút vào
trong nội bào của tế bào cảm nhiễm [3] [22, 56, 57].
9
Amantadine gắn vào kênh ion xuyên màng, ngăn chăn sự “cởi áo” này. Tuy
nhiên, những thay đổi axit amin tại vị trí bám gắn 26, 27, 30, 31 và 34 trên kênh ion
với amantadine đã tạo ra sự kháng thuốc của vi rút (vị trí gắn kết V27A Valin
chuyển sang Alanin, A30T Alanin sang Threonin, S31N Serin sang Asparagin và
G34E Glycin sang Axit Glutamic), trong đó vị trí 31 chuyển từ Serin sang
Asparagin là vị trí có tần suất xuất hiện nhiều [47, 52].
Hiện tượng kháng
amantadine xảy ra phổ biến trên gen M của vi rút cúm A/H3N2, ít gặp ở các chủng
cúm A/H1N1, tuy nhiên khi chủng cúm A/H1N1pdm09 xuất hiện thì hầu hết gen
M, do hiện tượng trao đổi và tích hợp gen, mang gen M của chủng vi rút cúm lợn Á
Âu có đột biến kháng thuốc amantadine tại vị trí 31 (S31N) [18, 53].
Các polymerase PB1, PB2 và PA: Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm có các
phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase. Phức
hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm vụ khởi đầu và kích
hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút [15] (hình 1.3 và hình 1.4). Trong quá
trình hoạt động của vi rút cúm, đột biến xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa PB2 có
liên quan đến khả năng thích nghi của vi rút [56, 99], đặc biệt với vi rút cúm gia
cầm H5N1. Đột biến E627K (Glutamin chuyển thành Lysin) trên PB2 của vi rút
cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút trên vật chủ
mới - người (vi rút tồn tại và nhân lên trên gia cầm tại nhiết độ tối ưu là 37oC, khi
mang gen đột biến, vi rút có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào
đường hô hấp trên của người – với nhiệt độ tối ưu là 33oC) [99]. Đột biến này đã
được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62,
63]. Một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 (87 axit amin) có chức năng thúc đẩy
quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi
rút cúm B và C [65, 122].
Nucleoprotein (NP): NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi
rút cúm có tính bảo tồn cao đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, tạo
thành hạt vi rút mới [43]. Chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng
hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. Ngoài ra, NP tương tác
- Xem thêm -