Tài liệu Tình hình nhiễm leptospira trên chuột tại tỉnh an giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN VĂN ĐẶNG TÌNH HÌNH NHIỄM LEPTOSPIRA TRÊN CHUỘT TẠI TỈNH AN GIANG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Tên đề tài TÌNH HÌNH NHIỄM LEPTOSPIRA TRÊN CHUỘT TẠI TỈNH AN GIANG Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU NGUYỄN VĂN ĐẶNG MSSV: 3102941 Lớp: CN10Y4A1-K36 ii Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài “Tình hình nhiễm Leptospira trên chuột tại tỉnh An Giang” do sinh viên Nguyễn Văn Đặng thực hiện tại bệnh xá thú y và phòng thí nghiệm vi sinh Bộ Môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ. Từ tháng 07 năm 2014 đến tháng 11 năm 2014. Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2015 Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2015 Duyệt Bộ Môn Duyệt Giảng viên hướng dẫn PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2015 Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CẢM ƠN  Trong suốt thời gian học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại học Cần Thơ, bên cạnh sự cố gắn nổ lực của bản thân là sự dạy bảo, giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, sự giúp đỡ chia sẽ của bạn bè, của những người thân trong gia đình. Nay tôi đã hoàn thành tốt khoá học, bằng tất cả sự chân thành tôi xin cám ơn cha mẹ tôi, người đã chịu bao gian khó để tôi hoàn thành ước mơ của tôi. Xin chân thành biết ơn: Cô Hồ Thị Việt Thu đã hết lòng quan tâm, động viên, chỉ bảo tận tình để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Cô Nguyễn Thị Bé Mười đã dìu dắt giúp đỡ về mọi mặt để tôi thực hiện tốt đề tài. Cô Châu Thị Huyền Trang đã nhiệt tình giúp đỡ, dạy bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian cô làm cố vấn học tập cho tôi. Quý thầy cô Bộ Môn Thú Y - Bộ Môn Chăn Nuôi đã tận tâm truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm lẫn nhận thức xã hội cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại Học Cần Thơ. Xin chân thành cám ơn: Các cô chú, ban lãnh đạo, các cán bộ thú y ở các Huyện Tịnh Biên, Tân Châu, Long Xuyên đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các anh chị, bạn bè đã luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Nguyễn Văn Đặng ii MỤC LỤC TRANG DUYỆT ................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v DANH MỤC BIỂU ĐỒ..................................................................................... v DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... vi DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................. vii TÓM LƯỢC ................................................................................................... viii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................. 1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN ........................................................................ 2 2.1 Tình hình nghiên cứu về Leptospirosis ................................................... 2 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Leptospirosis ........................ 2 2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước về Leptospirosis .......................... 2 2.2 Căn bệnh học ........................................................................................... 3 2.3 Truyền nhiễm học .................................................................................... 8 2.3.1 Loài vật mắc bệnh ............................................................................. 8 2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và vật mang trùng .......................................... 8 2.3.3 Đường lây lan ................................................................................... 9 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh............................................................................. 10 2.4 Triệu chứng và bệnh tích ....................................................................... 11 2.4.1 Triệu chứng ..................................................................................... 11 2.4.2 Bệnh tích ......................................................................................... 12 2.5 Chẩn đoán .............................................................................................. 13 2.5.1 Dịch tễ học ...................................................................................... 13 2.5.2 Chẩn đoán lâm sàng ........................................................................ 13 2.5.3 Chẩn đoán vi khuẩn học ................................................................. 14 2.5.4 Chẩn đoán huyết thanh học............................................................. 15 2.5.5 Sử dụng phương pháp sinh học phân tử ......................................... 17 2.6 Phòng bệnh ............................................................................................ 18 2.7 Điều trị ................................................................................................... 19 CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20 3.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................ 20 iii 3.2 Nội dung nghiên cứu.............................................................................. 20 3.3 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................ 20 3.3.1 Đối tượng. ....................................................................................... 20 3.3.2 Thiết bị, dụng cụ ............................................................................. 20 3.4 Phương pháp tiến hành .......................................................................... 22 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu. .................................................................... 22 3.4.2 Phương pháp thực hiện phản ứng vi ngưng kết (MAT: Microscopic Agglutination Test) .......................................................................................... 22 3.4.3 Phương pháp thống kê số liệu......................................................... 26 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 27 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột tại An Giang ................................... 27 4.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống ........................................................ 27 4.3 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo địa điểm ................................................... 28 4.4 Tỷ lệ nhiễm các chủng Leptospira trên chuột ....................................... 30 4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết .................. 33 4.6 Tỷ lệ nhiễm ghép các chủng Leptospira trên chuột............................... 33 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 34 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 34 5.2 Đề Nghị ...................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 35 PHỤ CHƯƠNG ............................................................................................... 38 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các serogroup và serovar của L. interrogans ........................................ 4 Bảng 2.2: Đặc điểm lâm sàng phân biệt bệnh do Leptospira với các bệnh khác . 13 Bảng 3.1: Kháng nguyên sử dụng trong phản ứng vi ngưng kết MAT ................ 21 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ....................................................... 27 Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo giống ..................................... 27 Bảng 4.3: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo địa điểm ................................ 28 Bảng 4.4: Tỷ lệ nhiễm các chủng Leptospira trên chuột ...................................... 30 Bảng 4.5: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết ................ 32 Bảng 4.6: Tỷ lệ nhiễm ghép các chủng Leptospira trên chuột ............................. 33 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột cống và chuột đồng ..................... 28 Biều đồ 2. Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo địa điểm ................................................ 29 Biểu đồ 3. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết ............... 32 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Leptospira dưới kính hiển vi điện tử ...................................................... 5 Hình 2.2 Đường lây nhiễm mầm Leptospirosis ...................................................... 9 Hình 2.3 Viêm thận mãn tính ở chó...................................................................... 12 Hình 3.1 Cách lấy máu chuột ............................................................................... 22 Hình 3.2 Sơ đồ chẩn đoán huyết thanh học Leptospirosis ................................... 23 Hình 3.3 Sơ đồ pha loãng huyết thanh.................................................................. 24 Hình 3.4 Các mức độ ngưng kết trong phản ứng vi ngưng kết MAT .................. 25 Hình 3.5 Sơ đồ nâng cao hiệu giá huyết thanh ..................................................... 26 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nguyên chữ Nghĩa tiếng Việt PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp hay phản ứng khuếch đại gen MAT Microscopic Agglutination Test Phản ứng vi ngưng kết ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Xét nghiệm liên kết miễn dịch với enzyme Immuno fluorescence Phản ứng miễn dịch huỳnh quang CF Complement fixation Phản ứng kết hợp bổ thể EMJH Ellinghausen-McCulloughJohnson-Harris Môi trường Ellinghansen-Mc Cullough cải tiến bởi Johnson và Harris WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới IgM Immunoglobulin M IgG Immunoglobulin G IF vii TÓM LƯỢC Để khảo sát tình hình lưu hành xoắn khuẩn Leptospira trên chuột tại tỉnh An Giang từ đó có kế hoạch phòng ngừa thích hợp, trong thời gian từ 07/2014 đến 11/2014 chúng tôi đã thu thập và tiến hành xét nghiệm huyết thanh học bằng phản ứng vi ngưng kết 126 mẫu huyết thanh chuột, trong đó có 54 mẫu chuột cống và 72 mẫu chuột đồng có nguồn gốc tại An Giang. Chuột được xác định là dương tính với Leptospira khi hiệu giá ngưng kết kháng thể ≥ 1/20. Kết quả ghi nhận như sau: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột là 32,5%, trong đó chuột cống nhiễm 40,7%, chuột đồng nhiễm 26,4%. Thành phần các chủng Leptospira nhiễm trên chuột rất đa dạng và phức tạp, trong 24 chủng Leptospira chuẩn dùng chẩn đoán huyết thanh học thì có 21 chủng dương tính với chuột, Tính chung tỷ lệ các chủng nhiễm chính ở chuột cống và chuột đồng: L. icterohaemorrhagiae Verdun 13,25% L. icterohaemorrhagiae copenhagini Wijnberg 10,84% L. canicola canicola Chiffon 9,64% L. gryppotyphosa gryppotyphosa Moskva V 8,43% L. pomona pomona Pomona 6,02% Hiệu giá ngưng kết từ 1/20-1/320, cho thấy chuột là con vật chỉ mang trùng chứ không mắc bệnh. Số lượng chủng nhiễm trên một cá thể phổ biến từ 2-6 chủng. Trong đó nhiễm ghép giữa 2 chủng chiếm tỷ lệ cao nhất (36,59%), nhiễm ghép giữa 6 chủng chiếm tỷ lệ thấp nhất (2,44%). Với kết quả trên chứng tỏ chuột là con vật mang trùng rất lớn và là đối tượng lan truyền mầm bệnh Leptospira rất cần được quan tâm. Đây là yếu tố nguy cơ đối với sức khoẻ vật nuôi và cộng đồng. viii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ An Giang là một tỉnh có diện tích lúa lớn nhất Đồng Bằng Sông Cửu Long, có điều kiện môi trường và hệ sinh thái phù hợp cho chuột phát triển. Chuột là loài gặm nhấm gây hại cho con người, chúng gây thiệt hại mùa màng, ô nhiễm môi trường… Ngoài ra, chuột còn mang nhiều mầm bệnh như Salmonella, Yersinia pestis…và đặc biệt là xoắn khuẩn Leptospira, nguyên nhân gây Leptospirosis. Leptospirosis là bệnh chung của người và gia súc, với triệu chứng chính: sốt cao, vàng da, tiểu ra huyết sắc tố, viêm gan, viêm thận, rối loạn tiêu hoá và rối loạn sinh sản…Trong thiên nhiên loài gặm nhấm là động vật mang trùng quan trọng, cụ thể là các loài chuột như: chuột cống, chuột nhà, chuột đồng… Dịch bệnh thường bùng phát sau cơn lũ, nước có xoắn khuẩn thải ra từ nước tiểu động vật hay từ máu hoặc xác chết các động vật bị mắc bệnh lây lan ra môi trường. Theo các chuyên gia nghiên cứu về Leptospirosis thì bệnh này có tất cả mọi nơi trên thế giới, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các nước vùng nhiệt đới như Việt Nam. Hiện nay, xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh rất đa dạng với hơn 200 serovar, chia thành 24 nhóm huyết thanh khác nhau gây khó khăn trong công tác phòng ngừa và điều trị bệnh. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên và được sự phân công của bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tình hình nhiễm Leptospira trên chuột tại tỉnh An Giang”. Mục tiêu đề tài: Khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chuột tại tỉnh An Giang. 1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Tình hình nghiên cứu về Leptospirosis 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Leptospirosis Năm 1883, bệnh đầu tiên được xem là bệnh nghề nghiệp của công nhân công trình vệ sinh sử lý chất thải. Năm 1886, Adolf Weil là người đầu tiên ghi nhận và mô tả tỉ mỉ triệu chứng trên 4 người mắc bệnh ở Châu Âu với các triệu chứng cấp tính như sốt cao, vàng da, vàng niêm mạc, bệnh tích lách sưng to, viêm thận. Đến năm 1908, Inada và Ito lần đầu tiên xác định nguyên nhân gây bệnh ở Nhật. Nhưng mãi đến năm 1916, Inada và ctv mới phân lập được mầm bệnh trên chuột cống, xác định cách truyền lây và phương pháp điều trị bệnh. Năm 1936, Nikonxki, Dexiatop và Mactrenko đã phân lập được mầm bệnh ở bò và sau đó tìm thấy mầm bệnh ở nhiều động vật khác (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012). Năm 2006, Richard et al đã kiểm tra 55 mẫu huyết thanh chó ở Mỹ có dương tính với Leptospira, trong đó L. grippotyphosa 38,2% (21/55), L. pomona 21,8% (12/55), L. autumnalis 10,9% (6/55), L. bratislava 9,1% (5/55), L. hardjo 3,6 % (2/55) và L. canicola 1,8% (1/55). Năm 2009, Sharon et al đã kiểm tra 106 chuột ở Philippine bằng phản ứng MAT với hiệu giá ngưng kết ≥1/20 được xác định là dương tính. Kết quả kháng thể Leptospira được phát hiện 98/106 (92%) mẫu huyết thanh với 16/17 serovar Leptospira. Các serovar phổ biến: L. Pyrogenes Manilae, L Bataviae Losbanos. Hiệu giá ngưng kết từ 1/ 20- 1/ 5120. Năm 2011, Vinodkumar đã kiểm tra 31 chuột xung quanh phòng thí nghiệm và 34 chuột đồng ở Ấn Độ. Kết quả có 61,29% (19/31) chuột dương tính (chuột cống, chuột nhà) và 8,82% chuột đồng dương tính. Các serovar chủ yếu là: Icterohaemorrhagiae (57,89%), Autumnalis (26,32%), Pyrogens (15,78%). 2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước về Leptospirosis Năm 1934, ở Việt Nam bệnh được Vaucel phát hiện lần đầu tiên. Tiếp đó nhiều ổ dịch xảy ra ở Hà Nội, Hải Phòng, Phú Thọ. Đến năm 1937, tại Tuyên Quang Vaucel đã phân lập được mầm bệnh ( Nguyễn Như Thanh, 1997). Năm 1968, Vũ Đình Hưng và Nguyễn Thị Diện, trâu bò và chó đều mắc bệnh này với tỷ lệ rất cao, với 35,1% ở trâu, ở heo là 22,9% và ở chó là 26,47%, đặc biệt đối với công nhân chăn nuôi tỷ lệ dương tính lên tới 56,0%. 2 Từ tháng 4/1999 đến 12/2002, tại thành phố Hà Nội có 28 ổ dịch trên người (Lê Công Tảo, 2003). Quách Quốc Nam ( 2007), kiểm tra 123 mẫu huyết thanh chuột ở Cần Thơ. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột là 32,52%, trong đó tỷ lệ nhiễm L.canicola 17,14%, L. autumnalis 14,29%, L. icterohaemorrhagiae 12,86%, L. pyrogenes 10,0%, L. Pomona 8,57%. Nguyễn Thị Bé Mười (2008), khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chó tại thành phố Cần Thơ được thực hiện bằng phản ứng vi ngưng kết với 12 chủng kháng nguyên sống Leptospira interrogans. Kết quả cho thấy có 21,33% (64/300) chó bị nhiễm Leptospira. Nguyễn Văn Tiến (2010), kiểm tra huyết thanh chuột quanh khu vực trại chăn nuôi của công ty cổ phần thuỷ sản Sông Hậu bằng phản ứng vi ngưng kết (MAT) với 23 chủng Leptospira. Tỷ lệ chuột dương tính 55,6% ở 22 chủng Leptospira. Các chủng phổ biến L. icterohaemorrhagiae tonkini LT9668, L.icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae Verdun, L. Hustbridge. Hoàng Kim Loan và ctv (2004-2013) khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên động vật gặm nhấm ở miền nam Việt Nam . Sử dụng phương pháp xét nghiệm huyết thanh học MAT với hiệu giá ≥ 1/20 được xác định là dương tính trên động vật gặm nhấm. Kết quả cho thấy có 72 mẫu huyết thanh được xác định là dương tính trên 1009 mẫu huyết thanh động vật gặm nhấm, chiếm tỉ lệ nhiễm là 7,14%. Các serovar nổi trội là bataviae (37,5%), hurstbridge(20,8%), patoc (12,5%), javanica (11,11%). 2.2 Căn bệnh học Đặc điểm của Leptospira Phân loại học Về phân loại khoa học, Leptospira được xếp vào: giới Bacteria, ngành Spirochaetes, lớp Spirochaetes, bộ Spirochaetales, họ Leptospiraceae, giống Leptospira. - Loài: gồm Leptospira interrogans gây bệnh cho người, gia súc và Leptospira biflexa là những dòng hoại sinh, không gây bệnh, sống tự do trong nước. Cả L. interrogans và L. biflexa được chia thành nhiều serovar. Hơn 60 serovar của L. biflexa đã được ghi nhận (Johnson et al., 1984). Còn L. interrogans thì có hơn 200 serovar đã được công nhận. Các serovar có tính kháng nguyên tương đồng được nhóm lại thành serogroup (Kmety et al., 1993). 3 Bảng 2.1: Các serogroup và serovar của L. interrogans Table 1 Serogroup Serovar(s) Icterohaemorrhagiae........................... Icterohaemorrhagiae,copenhageni,lai, zimbabwe Hebdomadis ........................................ hebdomadis, jules, kremastos Autumnalis .......................................... autumnalis, fortbragg, bim, weerasinghe Pyrogenes ............................................ pyrogenes Bataviae............................................... bataviae Grippotyphosa ..................................... grippotyphosa, canalzonae, ratnapura Canicola .............................................. canicola Australis .............................................. australis, bratislava, lora Pomona ............................................... pomona Javanica .............................................. javanica Sejroe................................................... sejroe, saxkoebing, hardjo Panama ............................................... panama, mangus Cynopteri ............................................. cynopteri Djasiman ............................................. djasiman Sarmin ................................................. sarmin Mini ..................................................... mini, georgia Tarassovi ............................................. tarassovi Ballum ................................................. ballum, aroborea Celledoni ............................................. celledoni Louisiana ............................................. louisiana, lanka Ranarum .............................................. ranarum Manhao ............................................... manhao Shermani ............................................. shermani Hurstbridge ......................................... hurstbridge (Levett, 2001) Hình thái vi khuẩn và tính chất bắt màu Leptospira có dạng hình xoắn khuẩn, đường kính khoảng 0,1µm-0,3µm, dài 6-20µm biên độ xoắn khuẩn khoảng 0,1- 0,15µm, chiều dài lượn sóng khoảng 0,5µm (Faine et al., 1999). Hai đầu xoắn hoặc hình móc câu. Leptospira có khả năng di động do cấu tạo ở mỗi đầu có một nội roi (sợi trục, endoflagelle), được đính vào giữa màng ngoài và màng trong của vi khuẩn (Cullen et al., 4 2004). Leptospira di động mạnh do co rút, quay theo ba hướng dọc, ngang và xoay tròn. Sự di chuyển toàn thân cùng với hình dạng đặc biệt và sự mềm dẻo làm cho Leptospira dễ dàng chui qua màng lọc có đường kính 0,1-0,14 µm nên chúng có khả năng làm tạp nhiễm các chất cần được thanh trùng bằng phương pháp lọc và thâm nhập vào hầu hết các mô trong cơ thể ký chủ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Hình 2.1 Leptospira dưới kính hiển vi điện tử Figure 1 (http://benh.vn/truyen-Nhiem/Benh-do-xoan-khuan-Leptospira/35/4081/12-11-2013.htm) Leptospira sinh sản theo cách trực phân, bắt màu gram âm nhưng khó nhuộm màu, thuốc nhuộm màu anilin thông thường không thể nhuộm được, phải được nhuộm bằng những phương pháp đặc biệt như Romanovski hoặc phương pháp nhuộm bạc Fontana - Tribondeau (Nguyễn Như Thanh, 2001). - Phương pháp Romanovski: Leptospira sau khi nhuộm có màu tím. - Phương pháp nhuộm bạc Fontana – Tribondeau: Leptospira sau khi nhuộm có màu đen. Đặc tính nuôi cấy Leptospira phát triển tốt trong môi trường đặc hiệu hiếu khí bắt buộc (có chứa vitamin B2, B12, axit béo mạch dài, muối amonium), nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 28-300C. Thời gian của một thế hệ từ 3-15 giờ, do đó cho thời gian nuôi cấy và phân lập đôi khi rất lâu, từ 2 đến 30 ngày. Độ pH tối ưu cho sinh trưởng là từ 7,2 đến 7,6 (Faine et al., 1999). Việc nuôi cấy Leptospira thường gặp rất nhiều khó khăn. Leptospira là xoắn khuẩn duy nhất có thể mọc trên môi trường nhân tạo, phát triển tốt ở môi trường lỏng hoặc bán lỏng (1–2% agar), nhưng chất dinh dưỡng cho chúng đòi hỏi phải có acid béo chuỗi dài, các acid béo này cung cấp năng lượng và là 5 nguồn carbon cho chúng tăng trưởng vì Leptospira không thể tổng hợp mới các acid béo. Các acid béo, vitamin B1 và B12 cũng cần được bổ sung cùng với các chất khác như Fe2+, Ca2+... để Leptospira phát triển. Ngoài ra những môi trường này còn phải được bổ sung thêm 5–10% huyết thanh thỏ, cừu, dê, bò... (Trần Thanh Phong, 1998). Ngoài ra còn có thể cấy Leptospira vào màng niệu đệm phôi thai gà 10 ngày tuổi, sau khi cấy 7 ngày phôi gà chết, bệnh tích của phôi không điển hình (Nguyễn Như Thanh, 2001). Hiện nay, người ta dùng nhiều môi trường giàu dưỡng chất tổng hợp để nuôi cấy, phân lập và giữ giống Leptospira như môi trường Terskich, Korthoff, Tween- Albumine hay EMJH - môi trường Ellinghansen Mc Cullough cải tiến bởi Johnson và Harris (Trần Thanh Phong, 1998). Như vậy, có rất nhiều công thức pha chế môi trường nuôi cấy Leptospira đã được mô tả. Tuy nhiên, sử dụng phổ biến nhất hiện nay là EMJH với thành phần chính là acid oleic, albumin huyết thanh bò và polysorbate (Tween 80) (Levett, 2001). Leptospira thường được nuôi trong môi trường lỏng có từ 5–10% huyết thanh thỏ tươi. Xoắn khuẩn mọc chậm, sau 6–10 ngày mới phát triển, có khi đến 3 tháng (Nguyễn Như Thanh, 1997). Một vài chủng Leptospira cần bổ sung pyruvate hoặc huyết thanh thỏ vào môi trường khi nuôi cấy. Khi phân lập Leptospira từ mẫu bệnh phẩm, có thể bổ sung kháng sinh vào môi trường như 5–fluorouracil, gentamincin, nalidixic acid hoặc rifampicin (Faine et al., 1999). Sức đề kháng Nói chung các Leptospira có sức đề kháng yếu, chết nhanh trong môi trường acid. Leptospira có thể sống tự do ở trong đất, trong nước ngọt và trong môi trường mặn nhưng có ánh sáng mặt trời thì chết nhanh. Với nhiệt độ: ở 560C xoắn khuẩn bị tiêu diệt trong 30 phút, ở 600C xoắn khuẩn chết ngay, ở nhiệt độ 200C xoắn khuẩn chết trong 4 giờ (Blood et al., 1975). Nhưng ở nhiệt độ thấp, vi khuẩn có khả năng tồn tại trong một thời gian dài có khi tới hàng năm (Frankel et al., 1970). Ở nhiệt độ -300C xoắn khuẩn không chết, ở nhiệt độ 40C Leptospira có trong gan chuột lang có thể sống được 26 ngày mà không giảm độc lực (Nguyễn Như Thanh, 2001). Với ánh sáng: dưới ánh sáng chiếu trực tiếp, xoắn khuẩn chết trong vòng 30 phút đến 2 giờ, với tia tử ngoại phải sau 4 giờ xoắn khuẩn mới bị tiêu diệt hoàn toàn (Blood et al., 1975). Với pH: Leptospira nhạy cảm với pH acid, ở pH < 6,9 vi khuẩn không sống được, nên ở trong dạ dày chỉ sau 10 phút là vi khuẩn chết, pH ≥ 7 vi khuẩn tồn 6 tại vài tuần. Do vậy, trong nước tiểu trâu bò Leptospira sống lâu hơn trong nước tiểu chó. Tuy nhiên trong nước tiểu kiềm không được pha loãng thì Leptospira sống được vài giờ (Nguyễn Lương, 1997). Sữa nguyên không pha loãng cũng có hại cho L. Pomona, nếu sữa được pha loãng với tỷ lệ 1/20 thì xoắn khuẩn có thể sống được 2 tháng. Trong nước mặn, xoắn khuẩn sống không quá 1 ngày (Pedro et al., 1987). Leptospira không thể sống lâu trong nước biển, nước ô nhiễm nặng. Các dòng suối và sông chảy chậm có pH trung tính hay hơi kiềm, Leptospira có thể sống hàng tháng. Trong đất ẩm, L.australis sống ít nhất 2 tuần (Smith et al, 1995). Với các chất kháng sinh: các xoắn khuẩn mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh như penicillin, amoxicillin, ampicillin... Với hoá chất và thuốc sát trùng: Leptospira bị tiêu diệt nhanh chóng bởi: cồn 20%, dung dịch phenol 0,5%, axit clohydric 2%, crezyl 5%... Theo Nguyễn Bá Hiên (2007), các thuốc sát trùng thông thường diệt Leptospira nhanh chóng như: acid phenic 0,5% diệt xoắn khuẩn trong 20 phút, formol 0,25% hoặc NaOH 0,5% trong 10 phút, Leptospira rất mẫn cảm với nước muối: dung dịch muối 2,8% giết chết Leptospira trong 15 phút, trong phòng thí nghiệm thường dùng cồn 70°, cloramin để sát trùng. Cấu trúc kháng nguyên Cấu trúc kháng nguyên được chia thành hai phần chính: - Kháng nguyên P: thuộc phần vỏ có bản chất là protein chịu nhiệt, cấu trúc là lipopolysacharide. Kháng nguyên này có vai trò quan trọng trong phản ứng vi ngưng kết (MAT: Microscopic Agglutination Test), giúp phân biệt Leptospira hoại sinh hay gây bệnh và giúp xác định được các chủng huyết thanh và các nhóm huyết thanh Leptospira. - Kháng nguyên S: còn gọi là kháng nguyên thân, thuộc tế bào chất, thành phần cấu tạo cũng là lipopolysaccharide, có tính chuyên biệt cho nhóm huyết thanh với các vị trí quyết định kháng nguyên (epitop) đặc hiệu của chủng huyết thanh, dùng để nhận biết các loài Leptospira. Chủng huyết thanh Leptospira được xác định dựa trên kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên P. Do sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên, người ta chia Leptospira thành nhiều nhóm huyết thanh (serogroupe). Mỗi nhóm huyết thanh có nhiều chủng huyết thanh hay còn gọi là serovar (Johnson and Feine, 1984). 7 2.3 Truyền nhiễm học 2.3.1 Loài vật mắc bệnh Trong tự nhiên, tất cả các loài động vật có vú đều có thể mắc bệnh do Leptospira gây ra, bao gồm động vật cảnh, động vật nuôi, động vật hoang dã và người. Các loài cá và động vật giáp xác, bò sát và lưỡng thê ít mẫn cảm với bệnh. Loài chim cũng không mắc bệnh, trừ một số trường hợp con non bị bệnh. Côn trùng chỉ mang mầm bệnh khi hút máu động vật bệnh và có thể làm lây lan bệnh. Leptospira gây bệnh cho bò, chó nhiều nhất, sau đó đến ngựa, cừu, dê, heo, người. Các thú hoang như chuột, chồn, báo.. cũng là nguồn bệnh quan trọng. Loài chuột có thể nhiễm một số chủng Leptospira, chúng không mắc bệnh, không biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhưng có thể truyền mầm bệnh cho các loài vật khác. Ở người, bệnh mang tính chất nghề nghiệp rõ: công nhân làm vệ sinh cống rãnh, công nhân chăn nuôi, cán bộ địa chất, lâm nghiệp. Trong phòng thí nghiệm, chuột lang thường được dùng để gây bệnh bằng cách tiêm vào xoang bụng hoặc dưới da (ngoài ra có thể dùng thỏ, chuột bạch) (Nguyễn Bá Hiên và ctv.,2013). 2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và vật mang trùng Chất chứa mầm bệnh Khi mới nhiễm trong một đến hai tuần, Leptospira có trong máu. Những tuần lễ sau Leptospira sống chủ yếu trong: quản thận, bể thận, ống thận, ống dẫn tiểu, bàng quang, nước tiểu, gan, lách, hạch lâm ba, tuỷ xương... Ở gia súc và thú hoang, nhất là những loài gặm nhấm, thường có hiện tượng mang mầm bệnh. Gia súc sẽ có hiện tượng mang trùng sau khi lành bệnh. Gia súc bị bệnh thể ẩn thì thời gian mang khuẩn và mức độ bài khuẩn tuỳ loài mang khuẩn và chủng xoắn khuẩn. Ví dụ: Chuột mang trùng và bài trùng suốt đời, ngựa một năm, bò 120 ngày. Ở thời điểm bài xuất nhiều, trong 1ml nước tiểu cơ thể chứa 1 triệu Leptospira. Khi ra ngoài gặp nước ao, hồ, đồng ruộng mầm bệnh trở thành nguồn tồn trữ trong thiên nhiên. Vật mang trùng Loài gặm nhấm nói chung và chuột đồng, chuột cống nói riêng là loài động vật được quan tâm nhiều nhất, do có số lượng đông nhất, sinh sản nhanh nhất và bài thải nhiều loại mầm bệnh nguy hiểm nhất như bệnh dịch hạch, bệnh thương hàn, Leptospirosis... 8 * Giới thiệu chung về sự phân bố của chuột Trong bộ gặm nhấm (Rodentia), thì họ chuột (Muridae) có số lượng loài nhiều nhất (trên thế giới họ nhà chuột có khoảng 1500 loài trong tổng số khoảng 6000 loài gặm nhấm). Trong họ chuột thì giống Tarius nhiều nhất khoảng 600 loài và nhiều loài gây hại cho sản xuất nông nghiệp, họ chuột phân bố khắp thế giới từ vùng núi cao đến các vùng đồng bằng, từ vùng đầm lầy đến các vùng sa mạc. Ở đâu có cuộc sống con người thì ở đó có loài chuột sinh sống. Mỗi loài chuột đều có vùng phân bố nhất định thích hợp với điều kiện sống của chúng. Căn cứ vào nơi cư trú điển hình mà chúng ta phân chia thành chuột nhà, chuột đồng, chuột cống, chuột rừng, chuột sa mạc...Ở Việt Nam, theo Đào văn Tiến (1991) đã thống kê họ chuột (Muridae), có khoảng 43 loài, sự phân bố và phá hoại của mỗi loài tuỳ từng vùng và có nhiều sai khác. 2.3.3 Đường lây lan Hình 2.2 Đường lây nhiễm mầm bệnh Leptospira Figure 2 (http://www.impe.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240) Từ các nguồn nhiễm khuẩn, xoắn khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể người và vật nuôi qua da ẩm ướt, vết thương trên da, niêm mạc đường hô hấp, đường tiêu hóa. Chỉ cần một lượng rất nhỏ, Leptospira sau khi xâm nhập vào cơ thể sẽ gây được bệnh ở động vật mẫn cảm (Faine et al., 1999). Leptospira xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua niêm mạc đường tiêu hóa, niêm mạc mắt và qua vùng da bị thương (Blood et al., 1975). Leptospira cũng có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua vật chủ trung gian như các loài hút máu (ve, mòng, đỉa...) hút máu thú bệnh truyền cho thú khỏe. Leptospira xâm nhập vào thú khỏe thông qua đường giao phối, nếu con đực (hoặc cái) nhiễm Leptospira sẽ truyền trực tiếp mầm bệnh qua giao phối trực 9 tiếp hoặc thụ tinh nhân tạo. Thú mẹ bị bệnh có thể truyền cho con qua nhau thai, sữa mẹ, làm thú sơ sinh mắc bệnh (Hanson et al., 1986). Ở người bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi, bệnh có tính chất nghề nghiệp do phải tiếp xúc thường xuyên như làm đồng án, nạo vét cầu cống, vệ sinh chuồng súc vật...Tuy nhiên, cũng có những trường hợp dân thành phố cũng mắc bệnh do du lịch sinh thái về các vùng nông thôn, tắm sông, suối, ao hồ, cắm trại. Ở nước ta, bệnh hay gặp ở những người làm việc trong rừng như bộ đội, công nhân địa chất, lâm nghiệp, công nhân chăn nuôi và nông dân. Những người làm việc thường xuyên tiếp xúc với nguồn bệnh như: cán bộ thú y, công nhân Nông - Lâm trường, công nhân giết mổ, chế biến thực phẩm...cũng rất dễ bị xoắn khuẩn Leptospira xâm nhập và gây bệnh qua các vết xước ở những nơi tiếp xúc - được gọi là bệnh nghề nghiệp (Lê Trung, 1997). Chuột là ổ chứa mầm bệnh Leptospira và thải ra môi trường bên ngoài bằng nước tiểu làm ô nhiễm nguồn thức ăn, nước uống. Thú, động vật hoang dã và người bị nhiễm bệnh do tiếp xúc với môi trường có nhiễm xoắn khuẩn Leptospira. Động vật và người mắc bệnh lại tiếp tục đào thải mầm bệnh ra môi trường xung quanh làm lây bệnh cho các loài động vật mẫn cảm khác... Vòng truyền lây được tàng trữ và khép kín, trong đó vật nguy hiểm nhất là chuột loài mang trùng. 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh Leptospira xâm nhập khi đạt được số lượng nhất định trong máu và tổ chức, các bệnh tích và triệu chứng của bệnh bắt đầu xuất hiện do tác động của độc tố, tính độc của vỏ tế bào. Leptospira làm phá vỡ các vi mao mạch dẫn đến thiếu máu cục bộ ở các khí quan, gây ra các hiện tượng bệnh lý ở thận, gan, màng não, lách. Thú mắc bệnh nặng có hiện tượng xuất huyết và vàng da (Adler et al., 2010). Leptospira xâm nhập vào cơ thể chỉ sau 12 giờ đã phát hiện có xoắn khuẩn trong gan, xoắn khuẩn tập trung ở đây cho đến lúc có triệu chứng sốt. Trong một số trường hợp còn thấy Leptospira ở tuyến thượng thận, cơ tim... Khi cơ thể thú bị sốt, Leptospira có nhiều trong máu có thể kéo dài tới một tuần. Cơ thể bắt đầu sản sinh kháng thể và có thể tìm thấy được sau 5-10 ngày (Hanson et al., 1986). Hàm lượng kháng thể trong máu cao nhất xác định được sau 3 tuần từ khi thú sốt (Srivastava et al., 1989). Xoắn khuẩn Leptospira tiết độc tố làm phá hủy hồng cầu, gây thiếu máu trầm trọng dẫn đến vàng da, nước tiểu có huyết sắc tố. Độc tố phá vỡ thành mao mạch của mô liên kết dưới da gây nên hiện tượng xuất huyết, thẩm lậu dịch cùng với triệu chứng phù nề, vàng da. Số lượng xoắn khuẩn Leptospira trong 10