Tài liệu Tinh chế và phân tích đặc tính liên kết o glycan của lectin từ rong đỏ hydropuntia eucheumatoides

LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đình Hùng Trƣởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi chọn đề tài và tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ths Đinh Thành Trung - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Hóa học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng nhƣ hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô giáo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trƣờng Đại học Nha Trang, Trƣờng Đại học Khánh Hòa đã dạy dỗ, cung cấp nhiều kiến thức bổ ích và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập. Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Tỉnh Khánh Hòa, Trƣờng THPT Chuyên Lê Quý Đôn – Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa học sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019 Học viên Trần Thị Hải Yến LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn, chỉ bảo của Thầy hƣớng dẫn và sự giúp đỡ của cán bộ phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên. Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019 Học viên Trần Thị Hải Yến 1 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 9 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................ 12 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN ........................................................ 12 1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN ............................................................... 14 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu lectin ............................................................. 14 1.2.2. Sự phân bố lectin trong sinh giới .................................................. 16 1.2.3. Vai trò sinh học của lectin ............................................................ 18 1.3. LECTIN TỪ RONG BIỂN ................................................................. 19 1.3.1. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trên thế giới .................. 19 1.3.1.1. Các phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển ......................... 19 1.3.1.2. Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ................................ 21 1.3.1.3. Điểm đẳng điện và hàm lƣợng acid amin của lectin từ rong biển. .................................................................................................... 23 1.3.1.4. Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong biển. .................................................................................................... 24 1.3.1.5. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính của lectin rong biển ............................................................................................................ 25 1.3.1.6. Hàm lƣợng carbohydrate trong lectin từ rong biển.................. 25 1.3.1.7. Trọng lƣợng phân tử của lectin từ rong biển. .......................... 25 1.3.1.8. Cấu trúc của lectin từ rong biển. ............................................. 26 1.3.1.9. Ứng dụng của lectin từ rong biển............................................ 29 1.3.2. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nƣớc .................... 32 2 1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN .............................. 33 1.4.1. Sắc ký trao đổi ion ........................................................................ 33 1.4.2. Sắc ký lọc gel ............................................................................... 33 1.4.3. Sắc ký ái lực ................................................................................. 34 1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEIN DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG.............................................................. 35 1.5.1. Nguyên tắc chung ......................................................................... 35 1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân tử khối của protein ........................... 36 1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONG LECTIN .................................................................................................... 36 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 39 2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ................. 39 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU . 40 2.2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................ 40 2.2.2. Hóa chất ....................................................................................... 40 2.2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 41 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 42 2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O) : ......................................................... 42 2.3.2. Phân tích hoạt tính lectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O). ............... 43 2.3.3. Xác định hàm lƣợng protein. ........................................................ 44 2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm:............................................ 46 2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides ...................................................................................... 47 2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết ............................. 48 3 2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết .............................................. 48 2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết ......................................................... 48 2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin từ dịch chiết. ............................................................................................................... 49 2.3.7. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAESepharose ............................................................................................... 50 2.3.8. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 . ....................................................................................................... 51 2.3.9. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lƣợng phân tử lectin bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................... 52 2.3.10. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng các đặc tính lý, hóa đến lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides ................................................................ 56 2.3.10.1. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu ............................................................................. 57 2.3.10.2. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu ........................................................................................ 57 2.3.10.3. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu ........................................................ 58 2.3.10.4. Phƣơng pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ................................................................................................... 58 2.3.11. Điều chế porcine stomach mucin đƣợc xử lý enzyme trypsin ..... 60 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 61 3.1. PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH NGƢNG KẾT HỒNG CẦU THỎ, CỪU, GÀ VÀ CÁC NHÓM MÁU NGƢỜI A, B, O VỚI DỊCH CHIẾT TỪ RONG ĐỎ H. eucheumatoides ................................................................. 61 3.2. PHÂN TÍCH CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG H. eucheumatoides ......................................................................................... 61 4 3.2.1. Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi chiết ............................................. 61 3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến quá trình chiết ..................... 63 3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết ...................................................... 64 3.3. TINH CHẾ LECTIN .......................................................................... 65 3.3.1. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin ................... 65 3.3.2. Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose ......... 67 3.3.3. Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200 ................. 68 3.3.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử lectin bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................... 69 3.3.5. Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides ...................................................................................... 71 3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ H. eucheumatoides ................................................................. 72 3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................... 72 3.4.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ................................................................... 74 3.4.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................... 75 3.4.4. Phân tích khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................................................... 76 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 88 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 88 4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 89 5 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HC Hồng cầu HTR Hoạt tính riêng HTTS Hoạt tính tổng số NKHC Ngƣng kết hồng cầu OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối photphat 6 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự phân bố của lectin trong sinh giới........................................... 17 Bảng 1.2. Một số phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển. ......................... 19 Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ........................ 41 Bảng 2.2. Các loại đƣờng đơn và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate của lectin .................................................................... 59 Bảng 3.1. Phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong đỏ H. eucheumatoides với các dạng hồng cầu khác nhau............................. 61 Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch lectin từ 300 gam rong thô H. eucheumatoides . 71 Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoide........................................ 75 Bảng 3.4. Nồng độ đƣờng và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoides .................... 79 Bảng 3.5. Khả năng ức chế đƣờng và glycoprotein của lectin từ rong đỏ và rong lục. ....................................................................................................... 85 7 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc bậc 1 của các lectin từ rong đỏ EDA-1 và EDA-2 từ rong Eucheuma denticulatum; ESA-2 từ rong Eucheuma serra; KSA-1 và KSA-2 từ rong Kappaphycus striatum, KAA-1 và KAA-2 từ rong Kappaphycus alvarezii , SfL-1 và SfL-2 từ rong Solieria filiformis . .................................. 27 Hình 1.2. Cấu trúc Man9GlcNAc2................................................................. 28 Hình 1.3. Cấu trúc lõi của Man3GlcNAc2 ..................................................... 28 Hình 1.4. Cấu trúc của lectin từ rong đỏ, carrageenophytes. ......................... 29 Hình 1.5. Biểu đồ thể hiện ứng dụng y sinh của lectin từ rong biển. ............. 30 Hình 2.1. Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides ................................ 39 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi chiết:nguyên liệu đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin. ....................................... 62 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của quá trình chiết lectin. ............................................. 63 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin. ............................................................ 64 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng kết tủa lectin....................................................................................................... 65 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa giá trị A280nm và hoạt tính ngƣng kết hồng cầu theo thứ tự các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose ................................................................................. 67 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn A280nm và hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 ............................ 68 Hình 3.7. Kết quả điện di lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides .................... 69 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................................... 73 8 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ......................................................................... 74 Hình 3.10. Các dạng cấu trúc lõi mở rộng của O-glycan. ........................... 77 Hình 3.11. Các dạng cấu trúc N-glycan. . ..................................................... 78 Hình 3.12. Cấu trúc của một số đƣờng đơn. ................................................. 82 Hình 3.13. Cấu trúc của Fetuin và Asialofetuin. ........................................... 82 Hình 3.14. Cấu trúc của yeast mannan, porcine thyroglobulin và porcine stomach mucin.. ........................................................................................... 84 9 MỞ ĐẦU Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein có nguồn gốc không miễn dịch và có mặt khắp nơi trong tự nhiên từ vi khuẩn đến động vật. Lectin có khả năng liên kết với các monosaccharide, oligosaccharide và glycoprotein đặc hiệu trên bề mặt tế bào hồng cầu và ngƣng kết hồng cầu, mà không làm thay đổi tính chất của carbohydrate. Khả năng sử dụng lectin phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính liên kết carbohydrate của chúng. Hàm lƣợng lectin thay đổi phụ thuộc vào các nguồn sinh vật khác nhau. Hiện tại, một số lƣợng lớn lectin từ các nguồn sinh vật khác nhau đã đƣợc tinh chế. Thêm vào đó, lectin tái tổ hợp cũng đã đƣợc sản xuất đối với một số mẫu sinh vật có sinh khối nhỏ [1]. Do khả năng có thể phân biệt sự khác nhau trong các cấu trúc carbohydrate, lectin không chỉ đƣợc dùng cũng nhƣ thuốc thử hóa sinh trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm glycomic, mà còn đang hứa hẹn sử dụng trong các liệu pháp chữa bệnh kháng virus và ung thƣ và cây trồng chuyển đổi gen [2]. Nguồn lợi sinh vật biển bao gồm vi tảo, rong biển, động vật không xƣơng sống, cá, vi khuẩn, nấm và virus đã cung cấp một số lƣợng lớn các phân tử hoạt tính sinh học tự nhiên đặc hiệu nhƣ thuốc kháng vi khuẩn, kháng virus HIV, kháng virus cúm, kháng ung thƣ và thuốc chữa bệnh Alzheimer [3, 4]. Trong số đó, lectin là một trong số nhóm hợp chất nổi bật nhất cho sử dụng làm thuốc chữa bệnh, bởi vì chúng có thể nhận biết các cấu trúc carbohydrate khác nhau trong proteoglycan, glycoprotein và glycolipid, kết quả là chúng có thể điều chỉnh các tế bào thông qua sự hình thành glyco liên hợp và ngăn chặn sự tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh với vật chủ qua liên kết với các cấu trúc oligosaccharide trên bề mặt của tác nhân gây bệnh [5]. Lectin từ rong biển đã cho thấy sự đa dạng trong hoạt tính sinh học nhƣ lectin từ rong đỏ Eucheuma serra đã cho thấy hoạt tính phân bào trong cả hai lympho bào ngƣời và chuột [6], hoạt tính kháng các chất gây ung thƣ [7], hoạt tính kháng virus HIV [8] và hoạt tính kháng virus cúm [9], lectin KAA-2 từ rong Kappaphycus alvarezii đã có hoạt tính ức chế mạnh sự lây nhiễm của các dòng virus cúm (H1N1 và H3N2) với nồng độ nanomol [10, 11], và lectin 10 BCA từ rong lục Boodlea coacta cũng đã cho thấy hoạt tính mạnh kháng lại virus HIV và virus cúm H1N1 [12]. Vì vậy rong biển hứa hẹn sẽ là nguồn lectin giá trị cho sử dụng trong y sinh để làm thuốc kháng ung thƣ và virus trong tƣơng lai. Việt Nam với chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km, ở đó có một hệ thực vật rong biển đa dạng với khoảng 1000 mẫu đƣợc dự đoán, trong đó 639 mẫu đã xác định. Đó là nguồn sinh vật biển phong phú để nghiên cứu và khai thác sử dụng lectin trong hóa sinh, y sinh hoặc trong thực phẩm chức năng để phòng ngừa bệnh trong tƣơng lai. Tuy nhiên, các nghiên cứu về lectin từ rong biển ở nƣớc ta chƣa đƣợc công bố nhiều, ngoại trừ một vài công bố về lectin rong biển [13, 14, 15, 16, 17, 18]. Rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides là một trong số loài rong đƣợc dùng để sản xuất agar trên thế giới và Việt Nam, ở nƣớc ta rong này đƣợc thu hoạch tự nhiên ở Nha Trang và Ninh Thuận, và cho đến hiện tại chƣa có bất kì công bố nào về lectin từ loài rong này. Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tinh chế và phân tích đặc tính liên kết O-glycan của lectin từ rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides” với mục đích không chỉ bổ sung thêm về số liệu lectin từ nguồn rong biển Việt Nam, mà còn hƣớng đến sử dụng lectin trong y học. Mục tiêu nghiên cứu: Phân tích các đặc tính của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides hƣớng đến đánh giá khả năng khai thác và sử dụng chúng trong hóa sinh, y sinh và dƣợc liệu phòng trị bệnh. Nội dung nghiên cứu: + Tinh chế lectin từ rong đỏ H.s eucheumatoides bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. + Phân tích tính chất của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, bao gồm: * Phân tích đặc tính liên kết O-glycan bằng phƣơng pháp ức chế sự ngƣng kết hồng cầu. 11 * Xác định khối lƣợng phân tử lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE. * Phân tích khả năng bền nhiệt, ảnh hƣởng của pH, cation hóa trị 2 và EDTA đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. 12 1CHƢƠNG 1. T NG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN Rong biển có vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái biển và đời sống của con ngƣời. Ngoài giá trị về môi trƣờng, sinh thái nhƣ tham gia vào các chu trình dinh dƣỡng của thủy vực, là nơi sống, trú ẩn, kiếm ăn của nhiều loài sinh vật biển nhất là thời kỳ cây non, rong biển còn có giá trị lớn đối với đời sống con ngƣời nhƣ cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến (chiết xuất keo agar, alginat, carrageenan, fucoidan…), làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh…. Rong biển là món quà thiên nhiên quý giá rất giàu chất dinh dƣỡng. Trong các phƣơng pháp dƣỡng sinh của nhiều dân tộc trên thế giới, rong biển đƣợc coi là thức ăn tạo sự dẻo dai, khỏe mạnh về thể chất và tinh thần cho con ngƣời. Rong biển khô rất giàu chất bột, chất xơ, đạm và chất khoáng. Phân tích giá trị thành phần dinh dƣỡng của rong biển cho thấy hàm lƣợng vitamin A trong rong biển cao gấp 2 - 3 lần so với cà rốt, hàm lƣợng canxi cao gấp 3 lần so với sữa bò, vitamin B2 cao gấp 4 lần trong trứng. Theo nhiều nghiên cứu tại Nhật Bản, trong rong biển chứa hàm lƣợng iốt khá cao. Trong đó, hàm lƣợng iốt cao nhất đƣợc tìm thấy trong rong nâu, tiếp sau rong đỏ và rong lục, khoảng 100 - 300 ppm trong rong biển khô. Ngoài ra, trong rong biển chứa một lƣợng chất khoáng rất phong phú, có tác dụng điều tiết máu lƣu thông, tiêu độc, loại bỏ các cặn bã có trong cơ thể; thêm vào đó, nó còn là chất không thể thiếu của tuyến giáp, nơi tiết ra hooc-môn sinh trƣởng, giúp cơ thể phát triển [19]. Từ thế kỷ thứ 18, rong biển đã đƣợc sử dụng phổ biến tại Nhật Bản, về sau có các quốc gia châu Á nhƣ Trung Quốc, Hàn Quốc, Malaysia, Philippin. Do đó, ngành rong biển ở các quốc gia này rất phát triển. Trong những năm gần đây, do có sự giao lƣu văn hóa giữa các nƣớc, ngƣời Việt cũng bắt đầu quan tâm đến rong biển. Việt Nam là một trong những nƣớc có tiềm năng để 13 phát triển ngành rong biển, với bờ biển dài 3.260 km và diện tích mặt nƣớc khoảng một triệu km2, đặc biệt là khu vực miền Trung có bờ biển đá và dải biến thiên nhiệt độ hẹp. Tại Việt Nam đã xác định đƣợc 800 loài rong biển thuộc 4 ngành, trong đó, ngành rong đỏ chiếm hơn 400 loại, ngành rong lục chiếm 180 loại, ngành rong nâu hơn 140 loại và ngành rong lam gần 100 loại; và trong số hơn 800 loài thì ở vùng biển nƣớc ta có 90 loài mang lại giá trị kinh tế; hiện nay có 7 loài rong kinh tế (rong nho, rong câu chỉ vàng, rong câu thắt, rong câu cƣớc, rong sụn, rong bắp sú, rong sụn gai) đang đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam. Ngày nay, xuất phát từ nhu cầu nâng cao chất lƣợng cuộc sống, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nguồn rong biển thành các sản phẩm có giá trị nhƣ: phlorotannin từ rong nâu Sargassum có khả năng chống gốc tự do mạnh gấp 5 lần so với catechin trong trà xanh [20]; hợp chất carrageenan trong rong biển đƣợc tách chiết và sử dụng làm chất phụ gia trong công nghệ thực phẩm, dùng làm phụ gia chế biến và bảo quản thực phẩm [21], đƣợc bổ sung vào bia rƣợu làm tăng độ trong, dùng trong sản xuất bánh pudding, kem, phomat, ngoài ra, carrageenan có khả năng liên kết với protein qua gốc amin nên nó đƣợc sử dụng trong công nghiệp sữa với vai trò làm cho các sản phẩm sữa có độ ổn định khá cao, tạo nhũ tƣơng, chống tách lỏng mà không cần dùng đến tinh bột và lòng trắng trứng [22]. Trong Y học, rong biển cũng đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn dƣợc liệu quý. Các hợp chất đƣợc tách chiết từ rong biển đã có những tác dụng trong phòng ngừa các bệnh. Chẳng hạn: theo Nghiên cứu đăng trên Thƣ viện y khoa quốc gia Mỹ cho thấy Fucoidan từ rong nâu giúp tăng miễn dịch, góp phần làm chậm sự phát triển của khối u thực tràng và ung thƣ vú; ngoài ra, chúng góp phần hỗ trợ chống viêm, giảm đau khớp, hỗ trợ giảm tác dụng phụ của hóa, xạ trị. 14 Bên cạnh những hiệu quả về kinh tế, rong biển còn góp phần giảm khí thải nhà kính, làm sạch môi trƣờng, hấp thụ kim loại nặng tại các vùng biển ô nhiễm, nuôi trồng thủy sản [19]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN 1.2.1. Lịch s nghi n cứu ectin Vào những năm cuối thế kỉ 19 con ngƣời đã bắt đầu có những bằng chứng đầu tiên về một loại protein có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu, dạng protein này đƣợc tìm thấy nhiều trong các loại hạt, và tại thời điểm này các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của dạng protein này. Đến năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích đƣợc nguyên lý gây độc của các hạt Aprus precatorius. Năm 1887, Dixson đã xác định đƣợc một dịch lỏng có độc tố, đƣợc tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein, vì những protein này đƣợc tìm thấy trong các mẫu chiết từ thực vật nên chúng đã đƣợc đề cập dƣới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật (phytoagglutinin). Peter Hermann Stillmark là ngƣời đầu tiên mô tả đầy đủ về lectin trong luận án tiến sĩ vào năm 1888 ở Đại học Dorpat (một trong những trƣờng đại học lâu đời nhất dƣới thời nƣớc Nga Sa Hoàng, nay là Tartu, Estonia,). Stillmrak đã phân lập và tách chiết đƣợc ricin, một chất hemagglutinin cực độc từ hạt của cây thầu dầu (Ricinus communis) [23]. Sau đó H. Hellin, cũng ở Đại học Tartu cho thấy sự hiện diện của một hemagglutinin độc, gọi là abrin ở mẫu chiết của cây đậu Abrus precatorius. Ricin và abrin đƣợc sử dụng để làm mô hình kháng nguyên cho các nghiên cứu miễn dịch. Mặc dù các mẫu ông nghiên cứu khá thô so với các tiêu chí hiện nay (ricin và abrin mỗi loại đều chứa một chất ngƣng kết yếu nhƣng có độc tính mạnh và một chất độc yếu nhƣng có tính ngƣng kết mạnh, tất cả đều đặc hiệu với galactose) nhƣng đó là nền tảng để xây dựng nguyên lý cơ bản về miễn dịch học vào những năm 1890. Cũng chính Ehrlich phát hiện ra rằng chuột đƣợc miễn dịch với ricin hoặc abrin ở liều dƣới ngƣỡng gây chết đã giúp cho chuột có khả năng kháng lại ricin và abrin. Kết quả này cung cấp bằng chứng rõ ràng cho tính đặc hiệu của các đáp ứng miễn dịch. Ehrlich 15 cũng chứng tỏ đƣợc rằng tính miễn dịch đối với các độc tố đƣợc truyền từ mẹ sang con bằng đƣờng máu trong quá trình mang thai và trong quá trình cho con bú sau khi sinh. Bằng cách nghiên cứu hiệu ứng ức chế của huyết thanh kháng ricin, ông đã chứng minh đƣợc rằng có một mối quan hệ định lƣợng giữa lƣợng kháng huyết thanh và lƣợng kháng nguyên mà nó có thể trung hoà và dựa trên cơ sở này để thực hiện việc định lƣợng đầu tiên đối với kháng thể trong cơ thể sống. Những nghiên cứu này đã chứng minh tính đặc hiệu của đáp ứng miễn dịch, hiện tƣợng ghi nhớ miễn dịch và sự truyền miễn dịch thể dịch từ mẹ sang con. Những kết quả ban đầu của Stillmark cũng đã nói lên một phần tính đặc hiệu của hiện tƣợng ngƣng kết bởi ricin đối với hồng cầu của các động vật khác nhau. Sự quan sát này đƣợc củng cố và mở rộng thêm bởi Karl Landsteiner ở đại học Vienna, ngƣời khám phá ra các nhóm máu ngƣời A, B và O vào năm 1900. Gần một thập kỷ sau ông đã công bố các hoạt tính ngƣng kết của các chất chiết từ các hạt khác nhau thì khác nhau khi thử nghiệm trên hồng cầu của các động vật khác nhau [24]. Vì tính đặc hiệu này, Landsteiner kết luận rằng hoạt tính ngƣng kết có nguồn gốc thực vật này “về cơ bản giống nhƣ kháng nguyên”. Vì vậy ông đã sử dụng những protein này để minh họa cho khái niệm tính đặc hiệu trong chƣơng mở đầu của cuốn sách kinh điển “Tính đặc hiệu của các phản ứng huyết thanh” năm 1936. Năm 1919, James B. Summer ở đại học Cornell (Ithaca, New York), là ngƣời đầu tiên tinh sạch lectin từ đậu rựa (Canavalia ensiformis) và sau đó đặt tên là concanavalin A. Vào những năm 1940, Boyd và Karl cũng đã mô tả về tính đặc hiệu của lectin ở đậu lima (Phaseolus limensis) và đậu tằm (Vicia cracca) với loại đƣờng khác nhau và đƣa ra bằng chứng về tính đặc hiệu với hồng cầu các nhóm máu A, B và O của lectin và khẳng định sự hiện diện của các phân tử đƣờng khác nhau trên bề mặt hồng cầu. 16 Khả năng phân biệt hồng cầu giữa các nhóm máu khác nhau của các agglutinin từ thực vật đã đƣa đến đề xuất cho chúng một cái tên là lectin, từ tiếng Latin legere, có nghĩa là chọn lọc [25]. Thuật ngữ này đƣợc tổng quát hóa để bao gồm tất cả các agglutinin đặc hiệu với các phân tử đƣờng không có nguồn gốc miễn dịch, bất kể chúng có nguồn gốc từ đâu hoặc đặc hiệu với các nhóm máu nhƣ thế nào. Lectin thực vật đƣợc nghiên cứu rộng rãi theo hƣớng điều tra và thăm dò tính đặc hiệu cho đến những năm đầu của thập kỷ 70. Ở thời điểm đó ngƣời ta đã nghiên cứu rất nhiều lectin, chủ yếu tập trung ở họ đậu. Các lectin động vật ít thu hút sự chú ý và chỉ có một số nghiên cứu về lectin ở chạch, sên và cua móng ngựa là đƣợc nghiên cứu kỹ. Lectin quan trọng nhất ở động vật đƣợc khám phá chính là thụ thể asialoglycoprotein trong gan động vật có vú, mà nó đặc hiệu với galactose [26]. Thụ thể này tham gia vào quá trình nhận diện và loại bỏ các glycoprotein lão hóa trong máu, qua đó kiểm soát chu trình sống của các glycoprotein trong máu. Cấu trúc của lectin đƣợc bắt đầu nghiên cứu vào những năm của thập kỷ 70 nhƣng phát triển chậm cho đến khi kỹ thuật tái tổ hợp ra đời. Ngày nay ngƣời ta có thể tiến hành giải trình tự của lectin rồi giải đoán cấu trúc bậc ba của nó dựa trên tính tƣơng đồng của các lectin cùng họ. Tuy nhiên nhiều lectin đã đƣợc giải cấu trúc bậc ba mà không cần thông qua trình tự bậc một nhờ vào kỹ thuật chụp ảnh tinh thể tia X. Hiện nay đã có tới hơn 200 lectin đƣợc giải đoán cấu trúc [27]. 1.2.2. Sự phân bố ectin trong sinh giới Lectin đƣợc tìm thấy ở hầu hết các sinh vật ở mọi cấp bậc phân loại, từ virus đến vi khuẩn, từ thực vật đến động vật. 17 Bảng 1.1. Sự phân bố của lectin trong sinh giới Phân bố Lectin Tài iệu tham khảo Động vật Lớp Cá xƣơng (Osteichthye), lớp [28] Lƣỡng cƣ (Amphibia), lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia), huyết tƣơng cá chình (Anguilla rastiata), trứng cá vƣợc (Perca piuviatitis), trong cơ thể ngƣời. Ngành ruột khoang ở vùng biển [29] Khánh Hòa. Thực vật Dâu tằm (Moraceae), Mít, Sakê chi [30] Artocarpus (Artocarpus incia). Rong (Algae) [31] Họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ [32] (Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae). Lectin từ các loại hạt (họ đậu, họ đại [32] kích), quả và củ (họ cà, họ hành), rễ (họ bầu bí, họ đậu), ở chồi và lá (họ xƣơng rồng và họ lan) Virus Virus cúm [33] Vi khuẩn Actinomyces naeslundii, [34] Escherichia coli 18 1.2.3. Vai trò sinh học của ectin Vai trò nổi bật nhất của lectin ở các sinh vật chính là chức năng nhận diện các gốc đƣờng. Vai trò này thể hiện trong chức năng của lectin trong miễn dịch tự nhiên, trong quá trình loại bỏ các glycoprotein trong máu ở gan của động vật có xƣơng sống (sialoglycoprotein). Có nhiều bằng chứng cho thấy lectin đóng vai trò nhƣ các protein hỗ trợ (chaperone) trong việc điều phối sự vận chuyển glycoprotein nội bào. Ở động vật: lectin có nhiều chức năng sinh học quan trọng nhƣ: quyết định độ bám dính của tế bào, tham gia vào quá trình tổng hợp glycoprotein, điều chỉnh lƣợng protein trong máu. Lectin có thể liên kết đƣợc với các glycoprotein nội và ngoại bào. Một số lectin liên kết đặc hiệu với đƣờng galactose cũng đƣợc tìm thấy trên bề mặt tế bào gan của động vật có vú. Những lectin này đóng vai trò nhƣ những thụ thể bề mặt tế bào và có khả năng loại bỏ một số glycoprotein nhất định trong hệ tuần hoàn. Thêm vào đó, lectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch của động vật. Ở thực vật: có hai giả thuyết về vai trò của lectin. Một giả thuyết cho rằng giúp thực vật chống lại vi khuẩn gây bệnh và động vật gây hại cho nó. Giả thuyết này đƣợc đƣa ra dựa trên quan sát của Rehovot cho thấy lectin ức chế quá trình tạo bào tử nấm. Ngoài ra, một quan sát của Lierner về sự chết của ấu trùng bọ cánh cứng khi ăn thức ăn có lectin đậu đen [35]. Giả thuyết thứ hai là sự kết hợp đặc hiệu của một giống đậu nào đó với một số vi khuẩn cố định đạm nhất định. Thành phần đƣờng của các polysaccharide hoặc lipopolysaccharide trên màng tế bào các loài vi khuẩn là khác nhau, và khả năng liên kết của lectin của các họ đậu khác nhau với các gốc đƣờng này cũng có sự khác biệt [36].