Tài liệu Tinh chế và phân tích các đặc tính của lectin từ rong biển betaphycus gelatinus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Thị Đoan Thục TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Nha Trang - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Thị Đoan Thục TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Lê Đình Hùng Nha Trang – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy hướng dẫn và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên. Nha Trang, ngày 25 tháng 09 năm 2019 Chữ ký học viên Lê Thị Đoan Thục LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đình Hùng (Trưởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang), người đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ths. Đinh Thành Trung - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, người đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và công nghệ, khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trường Đại học Nha Trang, Trường Đại học Khánh Hòa đã giảng dạy, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này. Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, trường THPT Lý Tự Trọng – Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa học sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 25 tháng 09 năm 2019 Học viên Lê Thị Đoan Thục 1 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục ............................................................................................................ 1 Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ............................................................. 4 Danh mục các bảng ........................................................................................ 5 Danh mục các hình vẽ, đồ thị .......................................................................... 6 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 7 Chương 1: TỔNG QUAN ........................................................................... 10 1.1 Tổng quan về lectin ................................................................................ 10 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ......................................................................... 10 1.1.2 Phân bố của lectin trong sinh giới ................................................. 11 1.1.2.1 Sự phân bố lectin trong giới thực vật.................................... 11 1.1.2.2 Sự phân bố lectin trong giới động vật ................................. 12 1.1.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật .......................................... 12 1.2. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trên thế giới ......................... 13 1.2.1 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển ........ 13 1.2.1.1 Tính tan và kết tủa ................................................................ 13 1.2.1.2 Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ........................... 13 1.2.1.3 Điểm đẳng điện và hàm lượng axit amin ............................. 15 1.2.1.4 Trọng lượng phân tử ............................................................ 15 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin ............................. 15 1.2.2.1 Ảnh hưởng của pH ............................................................... 15 1.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ....................................................... 16 1.2.2.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại .......................................... 16 1.2.2.4 Hàm lượng carbohydrate ..................................................... 16 1.2.3 Cấu trúc của lectin từ rong đỏ ....................................................... 20 1.2.4 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển .................................... 21 1.2.4.1 Kháng virus chống suy giảm miễn dịch ở người (HIV) ...... 23 1.2.4.2 Kháng virus viêm gan C ...................................................... 23 1.2.4.3 Kháng virus herpes simplex 2 .............................................. 23 2 1.2.4.4 Kháng virus cúm .................................................................. 23 1.2.4.5 Kháng virus coronavirus ...................................................... 24 1.2.4.6 Kháng ung thư ...................................................................... 24 1.2.4.7 Kháng vi khuẩn .................................................................... 24 1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước ............................ 25 1.4 Các phương pháp tinh chế lectin từ rong biển ....................................... 25 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 28 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................... 28 2.2. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu .................................. 29 2.2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................ 29 2.2.2. Hóa chất ....................................................................................... 29 2.2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 29 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 30 2.3.1 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % ........................................ 30 2.3.2 Phân tích hoạt tính lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu 30 2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry ................ 31 2.3.4 Bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................ 32 2.3.5 Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinus ....................................................................................................... 34 2.3.5.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết ......................... 34 2.3.5.2 Khảo sát nồng độ dung môi chiết ........................................ 35 2.3.5.3 Khảo sát thời gian chiết ....................................................... 36 2.3.6 Khảo sát nồng độ tác nhân tủa thích hợp để thu tủa protein-lectin 37 2.3.7 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAFSepharose ..................................................................................................... 37 2.3.8 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S–200 ... 38 2.3.9 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE ................................................................. 38 2.3.10 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính lý, hóa của lectin từ rong biển B. gelatinus ................................................................................... 41 2.3.10.1 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu ....................................................................................... 41 3 2.3.10.2 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của pH đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu ....................................................................................... 41 2.3.10.3 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu ..................................................... 42 2.3.10.4 Phương pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ........................................................................................................... 42 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 45 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết từ rong đỏ Betaphycus gelatinus ..................................................................................... 45 3.2 Các điều kiện để chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinus .................. 45 3.2.1 Tỷ lệ dung môi chiết ..................................................................... 45 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình chiết .................... 47 3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết ...................................................... 48 3.3 Tinh chế lectin ........................................................................................ 49 3.3.1 Khảo sát nồng độ ethanol để kết tủa lectin ................................... 49 3.3.2 Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose ........ 50 3.3.3 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 ............... 51 3.3.4 Phân tích độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE ................................................................. 52 3.3.5 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong Betaphycus gelatinus ....................................................................................................... 53 3.4 Kết quả xác định đặc tính lý, hóa của lectin từ rong B. gelatinus .......... 54 3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin ............. 54 3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin ..................... 55 3.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC của lectin ........................................................................................................... 56 3.4.4 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin .................................... 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 63 PHỤ LỤC 4 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ CP DC DCT HC HTR HTTS NKHC A MAC Chế phẩm Dịch chiết Dịch chiết thô Hồng cầu Hoạt tính riêng Hoạt tính tổng số Ngưng kết hồng cầu Độ hấp thụ nồng độ nhỏ nhất gây ngưng kết hồng cầu Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS SDS-PAGE APS EDTA PBS TEMED Dung dịch đệm phosphate chứa muối natri clorua Tiếng Anh Absorption minimum agglutination concentration Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis Ammonium persulfate Ethylene diamine tetraacetic acid Phosphate buffer saline N,N,N',N'-Tetramethyl ethylenediamin 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh của lectin từ rong biển ........................... 16 Bảng 1.2 Cấu trúc của một số lectin từ rong biển .......................................... 21 Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển ...................................... 22 Bảng 1.4 Các phương pháp tinh chế lectin ..................................................... 26 Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm .......................... 29 Bảng 2.2 Các loại đường monosaccarit và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ........................................ 42 Bảng 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong đỏ B. gelatinus với các dạng hồng cầu khác nhau ............................... 45 Bảng 3.2 Kết quả tinh sạch lectin từ rong Betaphycus gelatinus từ 400 gam rong thô ........................................................................................... 53 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong Betaphycus gelatinus ................................................ 57 Bảng 3.4 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt tính NKHC của lectin từ rong Betaphycus gelatinus...................... 58 6 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 2.1 Rong B. gelatinus ............................................................................ 28 Hình 2.2 Qui trình nghiên cứu tổng quát dự kiến .......................................... 33 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết thích hợp................................................................................................... 34 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi chiết thích hợp ........ 35 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết thích hợp ....................... 36 Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HTTS và HTR của lectin46 Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến HTTS và HTR của lectin ..... 47 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HTTS và HTR của lectin ........ 48 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ % ethanol đến HTTS, HTR và hiệu suất thu hồi của lectin. ................................................................................ 49 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa giá trị A 280 nm và hoạt tính NKHC theo thứ tự các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose ................................................................ 50 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (  = 280nm) và hoạt tính NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200. ... 51 Hình 3.7 Điện di lectin từ rong đỏ B.gelatinus. Dùng gel polyacrylamide 12,5 % (SDS –PAGE). Các dãi protein được nhuộm với Coomassie Brilliant blue R-250. ..................................................................... 52 Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong B. gelatinus ........................................................................................ 54 Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong B. gelatinus ....................................................................................... 55 Hình 3.10 Lectin từ rong đỏ B. gelatinus liên kết với các gốc đường mannose được thể hiện trong hình chữ nhật. ................................................ 60 7 MỞ ĐẦU Lectin, agglutinin hoặc hemagglutinin là những protein hoặc glycoprotein và có nguồn gốc không miễn dịch. Lectin được phân bố rộng rãi trong tự nhiên từ vi khuẩn, virus, đến động vật, thực vật bậc cao và bậc thấp. Không giống như kháng thể, lectin cho thấy sự đa dạng trong cấu trúc phân tử và đặc tính liên kết carbohydrate của chúng, những đặc tính này phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận lectin. Nguồn lợi sinh vật biển bao gồm vi tảo, rong biển, động vật không xương sống, cá, vi khuẩn, nấm và virus đã cung cấp một số lượng lớn các phân tử hoạt tính sinh học tự nhiên đặc hiệu như thuốc kháng vi khuẩn, kháng virus HIV, kháng virus cúm, kháng ung thư và thuốc chữa bệnh Alzheimer [1]. Trong số đó, lectin là một trong số nhóm hợp chất nổi bật nhất với nhiều đặc tính quan trọng đang được quan tâm đặc biệt cho sử dụng trong y-sinh (kháng virus, chống viêm, chống khối u, kháng ung thư kết tràng, kháng virus viêm gan C, HIV..) và trong dược phẩm. Gần đây, một số lectin liên kết N-glycan dạng high-mannose từ rong biển đã hứa hẹn trở thành thuốc kháng các dòng virus, vi khuẩn và ung thư tiềm năng, như các lectin từ loài Eucheuma serra (ESA-2) [2], [3], Kappaphycus alvarezii (KAA-2) [4], [5], Kappaphycus striatum, Eucheuma denticulatum [6], [7] và Solieria filiformis (SFL) [8]. Tất cả chúng đã cho thấy hoạt tính mạnh kháng virus HIV, virus cúm, một số dòng tế bào ung thư như ung thư ruột kết Colo201, Colon26, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, ung thư tuyến và ung thư biểu mô và vi khuẩn vibrio, thông qua sự tương tác đặc hiệu giữa lectin với các chuỗi đường dạng high-mannose trên bề mặt tế bào ung thư hoặc trên lớp vỏ của virus [8], [9], [10], [11], [12]. Vì vậy, lectin liên kết với N-glycan dạng high-mannose từ rong biển hứa hẹn thành mục tiêu quan tâm cho sử dụng trong y sinh. Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km, có một hệ thực vật tảo đa dạng với khoảng 1.000 mẫu được đánh giá và 639 mẫu đã được xác định, bao gồm 269 mẫu rong đỏ, 143 mẫu rong nâu, 151 mẫu rong lục và 76 mẫu rong xanh-lam.Đó là nguồn sinh vật 8 biển phong phú để nghiên cứu và khai thác sử dụng lectin trong hóa sinh, y sinh hoặc trong thực phẩm chức năng để phòng ngừa bệnh trong tương lai.Tuy nhiên, các nghiên cứu về lectin từ rong biển ở nước ta chưa được công bố nhiều, ngoại trừ một vài công bố về lectin rong biển của TS. Lê Đình Hùng và cộng sự [6], [7], [13], [14], [15], [16]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy rong biển Việt Nam sẽ là nguồn nguyên liệu hứa hẹn để nghiên cứu và sản xuất lectin phục vụ cho hóa sinh và y sinh hoặc làm dược liệu là rất cần thiết. Rong đỏ Betaphycus gelatinus (rong hồng vân) là loại rong khá phổ biển có dọc bờ biển miền Trung, là nguyên liệu để chiết xuất carrageenan dùng làm thực phẩm. Tuy nhiên cho đến nay chưa có bất kỳ công bố nào về lectin từ loài rong này trên thế giới cũng như trong nước. Dựa trên các kết quả sàng lọc đặc tính liên kết carbohydrate của dịch chiết từ loài rong này cho thấy, rong đỏ B. gelatinus hứa hẹn là nguồn lectin liên kết high-mannose mới để sử dụng trong hóa sinh và y học. Với những lí do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tinh chế và phân tích các đặc tính của lectin từ rong biển Betaphycus gelatinus”. Mục tiêu của đề tài: Dựa trên kết quả phân tích các đặc tính và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển B. gelatinus hướng đến khai thác và sử dụng làm dược liệu phòng trị bệnh. Nội dung nghiên cứu: + Tinh chế lectin từ rong đỏ B. gelatinusbằng phương pháp kết tủa kết hợp các phương pháp sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. + Phân tích tính chất của lectin từ rong đỏ B. gelatinus, bao gồm: * Phân tích hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin với hồng cầu tự nhiên và hồng cầu được xử lý enzyme. * Phân tích đặc tính liên kết của lectin với các monosaccharide và các glycoprotein. * Xác định độ tinh sạch và khối lượng phân tử của lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. 9 * Phân tích độ bền nhiệt, ảnh hưởng của pH, cation hóa trị 2 và EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ Betaphycus gelatinus. 10 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LECTIN 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Cho đến những năm cuối của thế kỷ 19, có nhiều bằng chứng cho thấy sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu trong tự nhiên. Những protein như vậy được gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật (phytoagglutinin) vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật. Mô tả đầu tiên về hemagglutinin xuất phát từ Peter Hermann Stillmark khi thực hiện luận án tiến sĩ vào năm 1888 tại trường đại học Dorpat (hiện nay là ĐH Tartu, Estonia), một trong những trường đại học lâu đời nhất ở Nga. Chất hemagglutinin được Stillmark chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin. Sau đó H. Hellin, cũng ở Đại Học Tartu cho thấy sự hiện diện của một hemagglutinin độc, gọi là abrin ở mẫu chiết của cây đậu Abrus precatorius. Một thời gian sau, Paul Erlich (Frankfurt) đã sử dụng ricin và abrin làm mô hình kháng nguyên cho các nghiên cứu miễn dịch (tất cả đều đặc hiệu với galactose), từ đó xây dựng một số nguyên lý cơ bản về miễn dịch học vào những năm 1890. Những kết quả ban đầu của Stillmark cũng đã nói lên một phần tính đặc hiệu của hiện tượng ngưng kết của ricin đối với hồng cầu của các động vật khác nhau. Sự quan sát này được củng cố và mở rộng thêm vào năm 1900, khi Karl Landsteiner ở đại học Vienna, khám phá ra các nhóm máu người A, B và O. Gần một thập kỷ sau, ông công bố hoạt tính ngưng kết của các dịch chiết từ các hạt khác nhau thì khác nhau khi thử nghiệm trên hồng cầu của các động vật khác nhau. Vì tính đặc hiệu này, Landsteiner kết luận rằng hoạt tính của chất ngưng kết có nguồn gốc thực vật này “về cơ bản giống như kháng nguyên”. Vì vậy ông đã sử dụng những protein này để minh họa cho khái niệm tính đặc hiệu trong chương mở đầu của cuốn sách kinh điển “Tính đặc hiệu của các phản ứng huyết thanh”. Khả năng phân biệt hồng cầu của các nhóm máu khác nhau của các agglutinin thực vật đã được đề xuất cho chúng một cái tên là lectin, từ tiếng Latin “legere”, có nghĩa là chọn lọc. Thuật ngữ này được tổng quát hóa để 11 bao gồm tất cả các agglutinin đặc hiệu với các phân tử đường, bất kể chúng có nguồn gốc từ đâu hoặc đặc hiệu với các nhóm máu như thế nào. Lectin là các protein hoặc glycoprotein có khả năng liên kết thuận nghịch với carbohydrate nhưng không làm thay đổi cấu trúc cộng hóa trị của carbohydrate [17]. Liên kết giữa lectin với carbohydrate bao gồm các liên kết như liên kết hydro, tương tác kỵ nước và Van der Waal [18]. Lectin có khả năng ngưng kết các dạng hồng cầu người và động vật khác nhau [19]. Vì vậy, đặc tính ngưng kết hồng cầu của lectin là yếu tố cơ bản để phân biệt lectin với các protein khác. Trong tự nhiên, lectin có mặt trong nhiều loại các sinh vật như động vật, thực vật bậc cao, tảo, nấm, động vật nguyên sinh, nấm men, nấm, san hô, động vật không xương sống và động vật có xương sống [20]. Do có khả năng liên kết đặc hiệu với các cấu trúc carbohydrate khác nhau trên bề mặt tế bào ung thư hoặc trên lớp vỏ vi khuẩn và virus, lectin không chỉ được dùng cũng như thuốc thử trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, mà còn đang hứa hẹn sử dụng trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư và kháng virus [21]. 1.1.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 1.1.2.1 Sự phân bố lectin trong giới thực vật Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt. Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hành điều tra ở 2.663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [22]. Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [23]. Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [24]. Lectin từ họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [25]. Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y (Lichenes) và Rong (Algae). Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là 12 của Boyd và cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [26], từ đó đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khác nhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam…[27]. Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [28]. 1.1.2.2 Sự phân bố lectin trong giới động vật Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm. Lectin trong giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus). Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra. Ở Việt Nam, khi khảo sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa xuất hiện 10 loài có chứa lectin [28]. Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được khảo sát như lớp Cá (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia). Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)…. Một kết quả nghiên cứu khá thú vị là ở mô người như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin. Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin. Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [29]. 1.1.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện vào năm 1942, khi Hirst và cộng sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [28]. Sau này, một số công trình khoa học của Bruoly (1948), Stone (1949) và Bruet (1951) cũng đã phát hiện thấy lectin ở một số loài virus khác [30]. Trên đối tượng là vi khuẩn E. coli, Ofek và cộng sự đã cho biết: trên bề mặt của tế bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào. Hoạt tính này mất đi khi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó [31]. 13 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TỪ RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI Trong vài thập niên qua, đã có nhiều công bố về kết quả sàng lọc lectin từ rong biển ở các khu vực khác nhau trên thế giới như ở Anh [3], [32], [33], [34], Nhật bản [35], Tây Ban Nha [36], Hoa Kỳ [37], [38], Brazil [39], [40], [41], Pakistan [42], Trung Quốc [43], Việt Nam [13], [15], Ấn độ [44], Nam cực [45] và hơn 800 mẫu rong biển đã được sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu, trong số đó khoảng 60 % mẫu được thông báo có chứa lectin, tuy nhiên số lượng lectin được tinh chế vẫn còn ít so với lectin từ thực vật bậc cao. Các nghiên cứu về đặc tính cho thấy rằng lectin từ rong biển khác với lectin từ thực vật bậc cao trong các tính chất hóa-lý và hóa sinh. Hầu hết lectin từ rong biển có một số đặc tính chung như tồn tại ở dạng monomer, có khối lượng phân tử nhỏ hơn lectin từ các nguồn khác, bền nhiệt và hoạt tính không bị ảnh hưởng bởi các kim loại hóa trị 2, có ái lực cao với các glycoprotein nhưng không với các monosaccharide [46], [47]. Do có khối lượng phân tử thấp, vì vậy khi sử dụng lectin từ rong biển trong y học ít tạo ra kháng nguyên so với lectin từ các nguồn khác [48]. 1.2.1 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển 1.2.1.1 Tính tan và kết tủa Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng. Lectin có bản chất là protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số tác nhân hóa học như ethanol, acetone và một số muối trung tính ở nồng độ cao. 1.2.1.2 Đặc tính liên kết cacbohydrat của lectin Phụ thuộc vào nguồn gốc rong biển, hoạt tính ức chế sự ngưng kết hồng cầu của lectin thì đa dạng (Bảng 1.1). Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển thường bị ức chế mạnh bởi các glycoprotein và glycopeptide khác nhau. Do đó, dựa trên đặc tính liên kết của chúng với glycoprotein, các lectin từ rong biển được chia làm 3 loại là loại đặc hiệu Nglycan dạng phức, đặc hiệu N-glycan dạng high-mannose hoặc đặc hiệu cả 2 14 dạng. Tuy nhiên, cũng có một vài lectin từ rong biển có đặc tính liên kết với các đường đơn monosaccharide và các dẫn xuất của chúng. a/ Lectin liên kết với N-glycan dạng phức Một số lectin thể hiện tính đặc tính đối với các chuỗi đường thuộc loại N-glycosidic [49], trong khi một số ít là đặc hiệu với O-glycan [13]. Hoạt tính ngưng kết hồng cầucủa các lectin từ rong E. duperreyi [50], Ptilota filicina [51], Pterocladiella capillacea [52], G. ornata [53] và G. cornia [54] đã bị ức chế mạnh bởi porcine stomach mucin (PSM). PSM làmột glycoprotein dạng O-glycan có các gốcN-acetyl galactosamine (GalNAc) ở vị trí cuối cùng của chuỗi carbohydrate[51]. Lectin từ rong Hypnea japonica có đặc tính liên kết với N-glycans dạng phức như transferrin, fetuin và α1-acid glycoprotein hoặc O-glycan (fetuin và mucin), nhưng không liên kết với N-glycan dạng highmannose [2], [55]. Tương tự, các lectin từ rong Hypnea valentiae, H. boergesenii, H. nidulans và Gracilaria salicornia thì đặc hiệu cho O-glycan và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng bị ức chế mạnh bởi asialofetuin mang cả N-glycan phức tạp và O-glycan cũng như bovine stomach mucin và dẫn xuất của chúng [13] (Bảng 1.1). b/ Lectin liên kết với N-glycan dạng high-mannose Một số lectin từ các loài rong đỏ, carrageenophyte, như Eucheuma serra [2], Kappaphycus alvarezii [13], Kappaphycus striatum [6], Eucheuma denticulatum [7] và Soliera filiformis [8] có đặc tính liên kết nghiêm ngặt các các N-glycan dạng high-mannose nhưng không liên kết với monosaccharide (Bảng 1.1). c/ Lectin liên kết với cả hai N-glycan dạng high-mannose và dạng phức Lectin từ Carpopeltis flabellata [49], [56] và S. robusta [35]có thể liên kết với cả N-glycan dạng high-mannose và N-glycan dạng phức (Bảng 1.1). d/ Lectin liên kết với đường đơn monosaccharide Hầu hết các lectin từ rong biển đều có ái lực cao hướng đến các glycoprotein. Tuy nhiên, cũng có một số lectin có ái lực với các monosaccharide và các dẫn xuất của chúng. Lectin từ C. flabellata bị ức chế bởi rhamnose [49]. Các lectin từ P. serrata, PSL [51], P. filicina PFL [57] và 15 V. obtusiloba [58] bị ức chế mạnh bởi đường galactose và các dẫn xuất của chúng (Bảng 1). 1.2.1.3 Điểm đẳng điện và hàm lượng axit amin Lectin từ rong biển có điểm đẳng điện thấp (pIs), thường nằm trong phạm vi từ 4 đến 6 (Bảng 1.1). Lectin từ rong biển chiếm tỉ lệ cao của axit amin dạng axit (axit aspartic và axit glutamic) và tỉ lệ thấp axit amin dạng bazơ (arginine, histidine và lysine) [46], [51], [59]. 1.2.1.4 Trọng lượng phân tử Lectin từ rong biển thường có khối lượng phân tử thấp và tồn tại ở dạng monomer như các lectin từ C. flabellata, S. robusta [ 46], B. seaforthii, B. triquetrum [60], E. serra [61], P. capillacea [52], H. musciformis [62], G. ornata [53], G. cornia [54], Griffithsia sp.[63], [64], [65], K. alvarezii [14], T. crinitus [66], G. confluens [45], K. striatum [6], E. denticulatum [7] và S. filiformis [8].Tuy nhiên, một lectin có cấu trúc dimer như lectin từ rong P. palmata[67] và V. obtusiloba [58]; dạng trimer như lectin từ rongPtilota filicina[57], P. serrata [51], P. plumosa và P. gunneri [68]; hoặc cấu trúc tetramer như lectin từ rong G. verrucosa [69]. Dựa trên các tính chất hóa lý và hóa sinh, Rogers và Hori [47] đã phân loại lectin thành ba loại: (a) lectin có khối lượng phân tử thấp đặc hiệu cho glycoprotein và không đòi hỏi cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học. (b) lectin đặc hiệu monosacharide vớikhối lượng phân tử trung bìnhvà không đòi hỏi cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học. (c) lectin đặc hiệu monosacharide (MW ˃ 64.000) đòi hỏi cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học (Bảng 1.1). 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin 1.2.2.1 Ảnh hưởng của pH Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các lectin từ rong biển như lectin từ E. serra, K. alvarezii [70], A. tenera [71], C. purpureum[72] và G. verrucosa [69], K. striatum, E. denticulatum [6], [7] ổn định trong phạm vi pH rộng từ 3 đến 10. Bên cạnh đó, một số lectin có độ ổn định pH trong phạm vi hẹp từ 6 16 đến 8, như các lectin từ P. serrata [51], Gracilaria bursa-pastoris [49] và T. crinitus [66] và mất hoạt tính khi pH nằm ngoài phạm vi trên. 1.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của một số lectin từ rong biển, như lectin từ P. Capillacea [52], G. ornata [53], K. alvarezii [14], G. fishingi [73], K. striatum, E. denticulatum [6], [7] và E. serra [74]bền ở nhiệt độ 50 °C và mất hoạt tính khi nhiệt độ vượt quá 50 °C. Tuy nhiên, một số ít lectin có độ bền nhiệt cao, ở 100 oC vẫn không mất hoạt tính trong khoảng thời gian 30 phút như các lectin từ rong B. seaforthii, B. triquetrum [60], G. verrucosa [75], [76], H. japonica [55], P. serrata [51] và G. confluens [45] 1.2.2.3 Ảnh hưởng của cation hóa trị hai Hầu hết hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển không phụ thuộc vào cation hóa trị hai. Tuy nhiên, một số lectin từ rong biển như lectin từ rong Plumaria Elegans, P. serrata [77], P. filicina [57], E. Duperreyi [50] và V. obtusiloba [58] cần kim loại hóa trị hai cho hoạt tính sinh học, như Ca2+, Mn2+ và Mg2+ (Bảng 1.1). 1.2.2.4 Hàm lượng carbohydrate Hầu hết lectin từ rong biển ở dạng protein. Tuy nhiên cũng có một vài lectin từ rong biển tồn tại ở dạng glycoprotein với hàm lượng carbohydrate khác nhau, như lectin từ rong C. purpureum [72], G. bursa-pastoris 59], E. duperreyi [50], G. ornata [53] và T. crinitus [66] (Bảng 1.1). Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh của lectin từ rong biển [78] Tên tảo/rong biển Tên lectin Đặc tính liên kết Đường/Glycoprotein Tính chất của lectin Tảo lục lam Microcystis aeruginosa MAL N-acetyl-D-galactosamine M. viridis MVL Yeast mannan, Monomer, MW 57 kDa, pI 6.4, giàu Asx & Arg, hàm lượng carbohydrate 7.8 % Dimer đồng nhất, 113 gốc oligomannosides như axit amin, MW 13 kDa, bền