Tài liệu Tinh chế albumin trứng sử dụng trong dược phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ THÚY NGHIÊN CỨU TINH CHẾ ALBUMIN TRỨNG SỬ DỤNG TRONG DƯỢC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ THÚY NGHIÊN CỨU TINH CHẾ ALBUMIN TRỨNG SỬ DỤNG TRONG DƯỢC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS Nguyễn Thanh Hải 2. ThS Nguyễn Văn Khanh Hà nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS Nguyễn Thanh Hải và Ths Nguyễn Văn Khanh, hai người thầy đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên thuộc bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và thực nghiệm tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, phòng Đào tạo, bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, các bộ môn, ban phòng liên quan trong nhà trường, các anh chị ở viện Dược liệu, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị và hóa chất thí nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như hoàn thành khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên Trần Thị Thúy DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ABS Aqueous Biphasis System (Hệ 2 pha thân nước) ACE Angiotensin I Converting Enzym (Enzym chuyển hóa angiotensin I) UF BCA BMBC dd Ultra Filtration (Siêu lọc) Bicinchoninic Acid Bộ môn bào chế Dung dịch EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao) NSX Nhà sản xuất OVA Ovalbumin PEG Polyethylen Glycol SDS Sodium Dodecyl Sulfat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfat Polyacrylamid gel elecphoresis (Điện di trên gel polyacrylamid sử dụng natri dodecyl sulfat) v/v Thể tích/Thể tích w/v Khối lượng/Thể tích WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Nội dung Bảng 1.1 Thành phần và tỷ lệ phần trăm khối lượng một số protein lòng trắng trứng 3 Bảng 1.2 Thành phần và một số tính chất của các protein chính trong lòng trắng trứng 5 Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của các protein lòng trắng trứng Trang 7 Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu sử dụng 14 Bảng 2.2 Công thức chuẩn bị mẫu điện di 23 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các phương pháp tinh chế ovalbumin trứng 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tinh chế ovalbumin 29 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của ovalbumin Bảng 3.4 Hiệu suất tinh chế và độ tinh khiết của ovalbumin với quy mô tinh chế 300 g lòng trắng trứng 31 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang Hình 1.1 Cấu trúc 3-D của ovalbumin Hình 2.1 Sơ đồ tinh chế albumin trứng bằng phương pháp điều chỉnh pH 16 Hình 2.2 Sơ đồ tinh chế ovalbumin sử dụng dd muối amoni sulfat bão hòa 17 Hình 2.3 Sơ đồ tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng 19 Hình 2.4 SDS phá vỡ cấu trúc dạng cuộn xoắn của protein 22 Hình 2.5 DDT đóng vai trò phá vỡ các liên kết disulfid 23 Hình 3.1 Sản phẩm đông khô thu được từ các phương pháp tinh chế ovalbumin trứng 25 Hình 3.2 Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu thu được từ các bước 28 Hình 3.3 Kết quả đo mật độ hình ảnh các băng điện di bằng phần mềm ImageJ 30 Ảnh hưởng của nhiệt độ biến tính lên hiệu suất tách và độ tinh khiết của ovalbumin 31 Hoàn thiện quy trình tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng 33 Hình 3.4 Hình 3.5 8 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………..………………… 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………... 2 1.1. Sơ lược về lòng trắng trứng……………………………………………. 2 1.1.1. Thành phần……………………………………..………...…..…… 2 1.1.2. Các protein chính trong lòng trắng trứng.….………….……….…. 3 1.1.3. Vai trò sinh học và giá trị của các thành phần lòng trắng trứng đối với sức khỏe con người……………………………………..……...………… 5 1.2. Ovalbumin………………………………………………………………… 8 1.2.1. Cấu trúc và một số tính chất đặc trưng của ovalbum…...………… 8 1.2.2. Một số đặc tính của ovalbumin có tiềm năng nghiên cứu sử dụng trong Dược phẩm………..…….………….…………...…..…..…………...… 9 1.2.3. Các phương pháp đánh giá ovalbumin…………………….…..… 10 1.2.4. Các nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng..……..… 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………. 14 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị……………………………………………….. 14 2.1.1. Nguyên vật liệu………….………………………….…….……… 14 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu…………...………….………..…… 14 2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………... 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 15 2.3.1. Phương pháp tinh chế albumin trứng………………….…….….…15 2.3.2. Phương pháp đánh giá…………………….……………………... 20 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu……………………………...………… 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……..…………………………… 25 3.1. Khảo sát các phương pháp tinh chế albumin trứng………………… 25 3.2. Tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng và đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được…………………………………………………………………………… 27 3.2.1. Định tính sản phẩm tinh chế………………..……………………. 27 3.2.2. Hiệu suất tinh chế ovalbumin……………….…………………… 29 3.2.3. Độ tinh khiết của ovalbumin…………..………………………… 30 3.3. Nâng cấp quy mô………...…………..………………………………… 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Trứng từ lâu đã trở thành một phần thiết yếu trong chế độ ăn của con người, là một trong số những thực phẩm được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới. Mặc dù chứa đến 74% là nước, trứng vẫn là nguồn nguyên liệu dồi dào cung cấp protein, acid béo, sắt, phospho, khoáng chất và các vitamin quan trọng cho cơ thể. Lòng trắng trứng chứa khoảng 9,7-11% protein, gồm các protein chính như ovalbumin, ovotransferrin, lysozym và ovomucin. Ngoài ra, các protein lòng trắng trứng còn chứa những đặc tính chức năng quan trọng như tạo gel, tạo bọt, nhũ hóa, và đông tụ bởi nhiệt, khiến chúng trở thành một phụ gia hữu ích đối với nền công nghiệp thực phẩm [2,18,21-24]. Là protein chính chiếm hơn một nửa lượng protein khô của lòng trắng trứng, ovalbumin có hầu hết các tính chất và đặc tính chức năng của lòng trắng trứng. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy một vài hoạt tính sinh học có liên quan đến albumin trứng như hoạt tính kháng vi sinh vật, điều hòa miễn dịch, và tiềm năng ứng dụng như một chất mang thuốc, cho thấy sự cần thiết trong việc phân lập và tinh chế ovalbumin từ phức hệ các protein của lòng trắng trứng [18,23]. Albumin trứng (ovalbumin) được phân tách đầu tiên từ lòng trắng trứng bằng phương pháp sử dụng amoni sulfat nồng độ cao. Trong nhiều thập kỉ qua, nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để tinh chế ovalbumin như công nghệ màng lọc UF, sắc kí trao đổi ion, sắc kí rây phân tử, hệ ABS… [2,28]. Các phương pháp này yêu cầu các thiết bị kĩ thuật đắt tiền đồng thời một số phương pháp phải được tiến hành qua nhiều giai đoạn phức tạp. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tinh chế albumin trứng sử dụng trong dược phẩm” với 2 mục tiêu chính: - Tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng. - Đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Sơ lược về lòng trắng trứng 1.1.1. Thành phần Trứng bao gồm khoảng 9,5% vỏ trứng (bao gồm màng vỏ), 63% albumen (lòng trắng) và 27,5% lòng đỏ [21]. Thành phần chính của trứng là nước (75%), protein (12%), lipid (12%), còn lại là carbohydrat, khoáng chất và một số vitamin (A, E, K và B) [18,23]. Protein phân bố ở cả lòng đỏ và lòng trắng trứng, trong khi đó lipid phân bố chủ yếu ở lòng đỏ. Một vài khoáng chất được tìm thấy trong vỏ trứng [22]. Carbohydrat và các thành phần thứ yếu khác phân bố khắp các bộ phận của quả trứng, tồn tại ở cả dạng tự do và dạng liên hợp, liên kết với protein và lipid [23]. Lòng trắng trứng chiếm hơn một nửa (khoảng 60-63%) tổng khối lượng quả trứng. Hai thành phần chính cấu tạo nên lòng trắng trứng bao gồm nước (chiếm khoảng 88%) và protein (khoảng 9,7-11%). Carbohydrat chiếm khoảng 0,5-0,6%, lượng lipid có trong lòng trắng trứng chỉ chiếm khoảng 0,01%, không đáng kể so với lượng lipid có trong lòng đỏ [21]. Protein là thành phần chính quyết định các đặc tính lý hóa và sinh học của lòng trắng trứng. Trong nhiều thập kỉ qua, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để nhận biết, phân tách và định lượng các protein có trong lòng trắng trứng. Protein chiếm khối lượng lớn nhất trong tổng số protein lòng trắng trứng là ovalbumin (54%). Cùng với ovalbumin, ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), ovomucin (3,5%) và lysozym (3,4%) được xem là những protein chính của lòng trắng trứng. Các protein khác cũng đã được nhận biết và định lượng bao gồm ovoinhibitor, ovoglycoprotein, ovoflavoprotein, ovomacroglobulin (ovostatin), cystatin, avidin… [18]. 2 Bảng 1.1. Thành phần và tỷ lệ phần trăm khối lượng một số protein lòng trắng trứng [18] Protein Phần trăm khối lượng (%) Protein Phần trăm khối lượng (%) Ovalbumin 54 Ovoinhibitor 1,5 Ovotransferrin 12 Ovoglycoprotein 1,0 Ovomucoid 11 Ovoflavoprotein 0,8 Ovomucin 3,5 Ovomacroglobulin 0,5 Lysozym 3,4 Cystatin 0,05 G2-globulin 4,0 (?) Avidin 0,05 G3-globulin 4,0 (?) Như vậy, 70-80% protein lòng trắng trứng là ovalbumin, ovotransferrin và ovomucoid. Do chứa một lượng lớn các protein trên, việc phát hiện và định lượng các protein kích thước nhỏ và chiếm tỷ lệ ít trở nên khó khăn hơn [12]. Gần đây, nghiên cứu của Mann K. và Mann M. sử dụng công nghệ Orbitrap kết hợp phân tích dữ liệu bằng phần mềm MaxQuant đã cho ra đời một danh sách mới, toàn diện nhất về các thành phần cấu tạo nên lòng trắng trứng, bao gồm 158 loại protein khác nhau [20]. 1.1.2. Các protein chính trong lòng trắng trứng Lòng trắng trứng chứa từ 9,7-11% protein, được xem như một hệ thống các protein hình cầu trong dung dịch thân nước. Các protein chiếm thành phần nhiều nhất và tạo nên các tính chất đặc trưng của lòng trắng trứng bao gồm: ovalbumin, ovotransferrin, ovomucoid, ovomucin và lysozym. Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein hình cầu, khối lượng phân tử 45 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,5, được cấu tạo từ 386 amino acid. Nghiên cứu của Osuga và Feeney năm 1977 và Zabik năm 1992 cho thấy ovalbumin tồn tại ở 3 3 dạng A1, A2, A3 với tỷ lệ 85:12:3, chứa số nhóm phosphoryl tương ứng là 2, 1 và 0. Ovalbumin bị biến tính tại nhiệt độ 84oC [2,5]. Ovotransferrin là một mono glycoprotein cấu tạo từ 686 amino acid với trọng lượng phân tử 77,7 kDa, điểm đẳng điện pI = 6,1 và biến tính ở nhiệt độ 61oC [21]. Ovotransferrin có chuỗi amino acid giống với glucoprotein vận chuyển sắt trong huyết tương người và chiếm 12 % lượng protein của lòng trắng trứng. Ovotransferrin tồn tại ở hai dạng cấu trúc chính: dạng apo- (không liên kết với kim loại) và dạng holo- có khả năng liên kết với kim loại. Cấu trúc dạng holo- của ovotransferrin bền hơn với các tác nhân vật lý và hóa học. Trước đây protein này được gọi tên là conalbumin nhưng đã được đổi thành ovotransferrin sau khi phát hiện thấy khả năng liên kết với sắt và tăng đề kháng với nhiệt, áp suất cũng như enzym thủy phân protein và các tác nhân biến tính khác [2]. Ovomucoid là một glycoprotein có khối lượng phân tử 28 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,1. Ovomucoid chứa từ 20-25% carbohydrat và có khả năng chống chịu cao với nhiệt độ (nhiệt độ biến tính là 77oC) [21]. Ovomucoid có hoạt tính ức chế trypsin và được xem như một chất gây dị ứng có trong thực phẩm. Tuy nhiên nghiên cứu của Osuga và Feeny cho thấy ovomucoid trong trứng ức chế trypsin bò nhưng không có hoạt tính ức chế đối với trypsin người [2,5]. Ovomucin là một glycoprotein, đây là protein đóng vai trò tạo nên đặc tính nhớt của lòng trắng trứng. Khác với các protein khác, ovomucin có khối lượng phân tử lớn, trong khoảng 5,5-8,8 x 103 kDa và chứa một lượng lớn cystin nối với nhau bởi các liên kết liên phân tử. Ovomucin chiếm 1,5-3,5% lượng protein lòng trắng trứng và có điểm đặng điện pI = 4,5-5,0 [5,21]. Ovomucin tồn tại ở 2 dạng: α-ovomucin và β-ovomucin trong đó α-ovomucin có số nhóm carbohydrat ít hơn dạng β do đó có khả năng hòa tan tốt hơn. Ovomucin cũng chứa một lượng lớn nhóm disulfid và chứa tới 33% carbohydrat [5]. Lysozym là một enzym cấu tạo từ 129 amino acid với khối lượng lượng phân tử 14,2 kDa và điểm đẳng điện 10,7. Lysozym chứa 4 cầu nối disulfid dẫn đến khả năng đề kháng tốt với nhiệt, lysozym biến tính ở 75oC [15,29]. 4 Bảng 1.2. Thành phần và một số tính chất của các protein chính trong lòng trắng trứng [21] Phần trăm khối lượng khô (%) Điểm đẳng điện (pI) Khối lượng phân tử (kDa) Nhiệt độ biến tính (Tdc) (oC) Ovalbumin 54 4,5 45 84,0 Ovotransferrin 12 6,1 77,7 61,0 Ovomucoid 11 4,1 28,0 77,0 Ovomucin 3,5 4,5-5,0 5,5-5,8x103 Chưa rõ Lysozym 3,4 10,7 14,3 75,0 G2 Globulin 4,0 (?) 5,5 49,0 92,5 G3 Globulin 4,0 (?) 5,8 49,0 Chưa rõ 0,05 10,0 68,3 Chưa rõ Protein Avidin 1.1.3. Vai trò sinh học và giá trị của các thành phần lòng trắng trứng đối với sức khỏe con người Trứng từ lâu đã trở thành một phần quan trọng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết trong chế độ ăn của con người. Mặc dù chiếm đến 74% là nước, trứng vẫn là nguồn cung cấp các protein, acid béo, chất khoáng và các vitamin cần thiết cho cơ thể [34]. Quá trình chế biến, nấu chín thức ăn có liên quan đến đặc tính đông lại bởi nhiệt của protein trứng. Các tính chất đặc trưng của các protein có trong lòng trắng như tạo gel, tạo bọt khiến chúng trở thành một thành phần hữu ích trong nhiều loại thực phẩm như mỳ phở, may-on-ne, các loại bánh, sản phẩm thịt chế biến sẵn và mứt, kẹo. Đặc tính tạo gel khi đun nóng của các protein lòng trắng trứng được ứng dụng trong chế biến nhiều loại sản phẩm như các món tráng miệng, bánh pudding, thịt hộp, đậu phụ và surimi. Khả năng tạo bọt cũng được 5 ứng dụng trong bánh mỳ, bánh ngọt, bánh trứng, bánh quy, kem và nhiều loại sản phẩm mứt, kẹo [18,21]. Nhiều protein trong lòng trắng trứng còn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm nhờ tác dụng ức chế sự phát triển của các loại vi sinh vật gây phân hủy thức ăn. Lysozym là một trong những protein gây phân hủy vi khuẩn chính được tìm thấy trong lòng trắng trứng, có tác dụng ức chế Listeria monocytogens và Clostridium botulinum, hai nguồn bệnh gây ra các vấn đề chính trong công nghiệp thực phẩm [29]. Ngoài ra, protein này có tác dụng kháng virus, kháng viêm và có nhiều hiệu quả chữa bệnh [18]. WHO và nhiều quốc gia cho phép sử dụng lysozym như một chất bảo quản trong các loại thực phẩm như giấm kimuchi, sushi, pho mát và rượt vang. Ovotransferrin được biết đến với hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh, do đó có thể được sử dụng để tăng độ an toàn của thực phẩm. Nghiên cứu của Babini và Livermore (2000) chỉ ra rằng ovotransferrin có khả năng tăng cường hoạt động của pipercillintazobactam chống lại Escherichia coli và Streptococcus mutans [6]. Ovomucin cho thấy hoạt tính ức chế tốt một số vi khuẩn như E. coli, Bacillus sp. và Pseudomonas sp. [33]. Do đó cũng được sử dụng như một phụ gia bảo quản trong thực phẩm. Bên cạnh đó, nhờ có đặc tính nhũ hóa và tạo bọt, ovomucin còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp làm bánh [2]. Ngày nay, trứng là nguồn nguyên liệu được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực bao gồm cung cấp thực phẩm, sản xuất Dược phẩm và ứng dụng trong Y học. Nhiều hoạt tính sinh học đã được phát hiện có liên quan đến các thành phần protein cấu tạo nên trứng, bao gồm khả năng kháng vi khuẩn và virus, khả năng điều chỉnh miễn dịch, chống ung thư, hạ huyết áp [23]. 6 Bảng 1.3. Hoạt tính sinh học của các protein lòng trắng trứng [18,23] Protein Ovalbumin Hoạt tính sinh học Kháng vi khuẩn. Chống tăng huyết áp. Điều hòa miễn dịch (Peptid thu được từ Ovalbumin.) Protein Ovoinhibitor Hoạt tính sinh học Ức chế serin protease. Chống virus. Kháng vi sinh vật. Ức chế các enzym Kháng khuẩn của serin, cystein, Ovotransferrin peptid OTAP-92. Ovomacroglobulin thiol, metallo Điều hòa miễn protease. dịch. Kháng vi sinh vật. Ovomucoid Ovomucin Ức chế serin protease. Điều hòa miễn dịch. Chất mang thuốc. Phối tử sinh học. Cystatin Kháng vi sinh vật. Chống bám dính. Lysozym Phòng ngừa khối u. 7 Ức chế cystein protease. Kháng vi sinh vật. Phòng ngừa khối u. Điều hòa miễn dịch Chống vi khuẩn, virus. Kích thích miễn dịch. Phòng ngừa khối u. 1.2. Ovalbumin 1.2.1. Cấu trúc và một số tính chất đặc trưng của ovalbumin Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein có khối lượng phân tử 45 kDa, cấu tạo từ 386 amino acid, điểm đẳng điện pI = 4,5. Ovalbumin được tổng hợp tại vòi trứng và cấu thành nên 54% tổng khối lượng khô của protein lòng trắng trứng [2]. Đây là một protein dự trữ và là nguồn cung cấp acid amin chủ yếu cho phôi trứng đang phát triển [24]. Ovalbumin chứa 3,5% carbohydrat, có 4 nhóm Sulfhydric tự do và một cầu nối disulfid (Cys74-Cys121) [5]. Cấu trúc bậc 2 của ovalbumin gồm 41% xoắn α, 34% phiến β và 12% nếp gấp β [26]. Cấu trúc 3-D của ovalbumin với một mạch xoắn ốc phản ứng α (màu vàng) và các phiến βA (màu đỏ) được mô tả trong hình 1.1. Hình 1.1. Cấu trúc 3-D của ovalbumin [17] Trong quá trình bảo quản, ovalbumin dần chuyển thành S-ovalbumin là một dạng cấu trúc bền hơn với nhiệt và thường được xem là ovalbumin “bền”. Sự có mặt của S-ovalbumin đã được chứng minh bởi sự khác nhau về nhiệt độ 8 biến tính của 2 dạng cấu trúc này (92,5oC đối với S-ovalbumin và 84,5oC đối với ovalbumin gốc). S-ovalbumin đồng thời cũng cho thấy tính kị nước bề mặt cao hơn. Lượng S-ovalbumin trong trứng tăng dần theo thời gian bảo quản, từ 5% ở trứng mới đẻ đến 81% sau 6 tháng bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2oC. Cấu trúc tinh thể của S-ovalbumin đã được xác định là không có sự khác biệt với cấu trúc bậc 2 của ovalbumin [5,15]. Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự chuyển đổi cấu trúc ovalbumin sang dạng S-ovalbumin. Nghiên cứu của Alleoni năm 1977 cho thấy phần trăm S-ovalbumin khi bảo quản ở 8oC sau thời gian 7, 14 và 21 ngày lần lượt là 18, 26 và 24%; ở nhiệt độ bảo quản 25oC, lượng Sovalbumin tương ứng sau 7 và 14 ngày là 56% và 60%. Smith và Back nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sự chuyển đổi cấu trúc của ovalbumin và cho thấy 95% ovalbumin chuyển thành dạng S-ovalbumin ở pH 10, nhiệt độ 55oC trong 20 giờ. Lượng S-ovalbumin chiếm tỷ lệ nhiều nhất ở pH 9,2 và ít nhất ở pH 7,9 [5]. 1.2.2. Một số đặc tính của ovalbumin có tiềm năng nghiên cứu sử dụng trong Dược phẩm Lòng trắng trứng chứa một lượng lớn protein có hoạt tính kháng vi sinh vật, đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên của trứng. Ovalbumin và lysozym là hai protein chính tạo nên các đặc tính sinh học này của lòng trắng trứng. Các peptid tạo ra trong quá trình thủy phân ovalbumin nhờ các enzym tiêu hóa được phát hiện là có hoạt tính chống lại Bacillus subtilus, E. coli, Bordetella bronchiseptica, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens cũng như Candida albicans [23]. Ovalbumin cũng có tiềm năng là một chất điều hòa miễn dịch, ovalbumin cho thấy khả năng gây ra sự giải phóng yếu tố hoại tử u TNF-α trong nghiên cứu in vitro, đồng thời các peptid có hoạt tính miễn dịch của ovalbumin được sử dụng để tăng cường đáp ứng miễn dịch trong miễn dịch trị liệu ung thư. Hoạt 9 động thực bào của đại thực bào cũng được tăng cường khi thêm peptid OVA 7778 và OVA 126-134 [23]. Ovokinin, một peptid tách ra từ ovalbumin (OVA 358-365) và OV 359364 cho thấy tác dụng làm giảm mạnh huyết áp tâm thu trong tăng huyết áp tự phát ở chuột. Hai peptid ức chế enzym chuyển hóa angiotensin I (ACE) cũng được tìm thấy trong ovalbumin là peptic (OVA 183-184) và tryptic (OVA 200218) [22,23]. Nghiên cứu của Fujita và cộng sự năm 2000 tiến hành thủy phân ovalbumin với pepsin, trypsin và α-chymotrypsin cũng tạo ra 7 peptid ức chế ACE bao gồm LKA, LKP, LAP, IKW, FQKPKR, FKGRYYP và IVGRRHQG, trong đó một vài peptid đồng thời có tác dụng làm giảm nồng độ lipid trong máu [2]. So với các polyme protein khác, ovalbumin được lựa chọn là một công cụ dẫn truyền thuốc, đặc biệt trong kiểm soát phân bố thuốc nhờ tính chất dễ kiếm, có nguồn gốc sinh học, giá thành rẻ, khả năng tạo gel, làm ổn định nhũ tương và nhạy cảm với pH, nhiệt độ [31]. 1.2.3. Các phương pháp đánh giá ovalbumin Phương pháp định lượng: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ ovalbumin trong dung dịch là đo độ hấp thụ quang của protein này tại bước sóng hấp thụ cực đại. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp cũng thường được sử dụng để định lượng ovalbumin nhờ hiệu quả và tính chính xác cao. Bên cạnh đó, ovalbumin cũng được định lượng bằng các phương pháp định lượng protein bao gồm: Phương pháp so màu (Biuret, Lowry, Bradford), phương pháp dùng acid bicinchoninic (BCA), phương pháp phân tích amino acid sau khi thủy phân protein, phương pháp định lượng nito Kjeldahl [32]. Phương pháp định tính: Để định tính ovalbumin, các phương pháp thường được sử dụng là: HPLC, phương pháp điện di trên gel polyacrylamid, kĩ thuật miễn dịch ELISA [3,10,11,13,28]. 10 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết: HPLC, điện di SDS-PAGE [34,10,13,28]. 1.2.4. Các nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng Ovalbumin là một trong những protein đầu tiên được tách ra từ lòng trắng trứng. Nó được phân tách lần đầu tiên vào những năm 1900 bằng phương pháp sử dụng dung dịch muối amoni sulfat nồng độ cao [8,14]. Mặc dù được phân lập nhưng lượng muối sử dụng quá cao và độ tinh khiết của protein không được báo cáo. Amoni sulfat bão hòa tiếp tục được sử dụng để tách ovalbumin bởi Warner và Weber (1951) và Warner (1954) tuy nhiên độ tinh khiết của protein tách được là thấp [28]. Năm 1940, Littlefield cùng cộng sự đã bào chế bột ovalbumin khô bằng phương pháp dùng dung dịch acid clohydric acid hóa dung dịch lòng trắng trứng về pH bằng điểm đẳng điện pI của ovalbumin. Kết tủa được tách khỏi dung dịch bằng bộ lọc và sau đó được sấy khô [19]. Rhodes cùng cộng sự là những người đầu tiên sử dụng phương pháp sắc kí cho mục đích phân tách ovalbumin từ trứng. Nhiều phép sắc kí khác nhau bao gồm sắc kí trao đổi ion đã được tiến hành thử nghiệm để tinh chế ovalbumin từ trứng. Geng F. cùng cộng sự đã phân lập được 4 protein của lòng trắng trứng gà bao gồm lysozym, ovotransferrin, ovalbumin, ovoflavoprotein bằng chất kết tủa polyethylen glycol, các protein này tiếp tục được tinh chế bằng sắc kí trao đổi ion. Phương pháp HPLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của các protein tinh chế được. Kết quả cho thấy độ tinh khiết của lysozym, ovotransferrin, ovalbumin, ovoflavoprotein lần lượt là 91,84%, 94,55%, 96,45% và 88,16% [13]. Tuy nhiên phương pháp này chỉ phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm, khó để áp dụng trên quy mô lớn. Năm 2009, Datta và cộng sự đã sử dụng công nghệ màng siêu lọc để tách ovalbumin từ lòng trứng gà. Trong nghiên cứu này, hệ thống lọc 2 giai đoạn gồm một màng lọc polyether sulfon (PES) 30 kDa và một màng lọc PES 50 kDa được sử dụng, đồng thời dung dịch lòng trắng trứng được pha loãng bằng dung dịch 11 muối NaCl 200mM. Nghiên cứu cho thấy ovalbumin có độ tinh khiết cao (98,7%) ở điều kiện áp suất màng 2,5 kgfcm-2, tốc độ khuấy 200 rpm, pH 2,5 và tỷ lệ pha loãng dung dịch lòng trắng trứng 1:1 (v/v). Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này liên quan đến đặc tính tạo bọt của protein lòng trắng trứng và khó để thực hiện ở quy mô lớn. Việc kiểm soát áp suất, tốc độ khuấy, pH dung dịch và pha loãng vật liệu trên màng cũng khó duy trì [10]. Trong vài thập kỉ gần đây, phương pháp sử dụng hệ hai pha thân nước ABS (Aqueous Biphasic Systems) được nhiều nhà nghiên cứu thử nghiệm để tinh chế protein. Saravan cùng cộng sự đã nghiên phân tách ovalbumin bằng hệ ABS poly(ethylenglycol) (PEG)-poly(acrylic acid). Kết quả cho thấy có 87,4% ovalbumin phân lập được [30]. Năm 2016, Pereira cùng các cộng sự đã nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng sử dụng hệ ABS gồm một pha polyme là polyethylen glycol và pha dung dịch đệm kali citrat/acid citric, thu hồi 65% ovalbumin từ pha polyme [28]. Nerli cùng cộng sự nghiên cứu nhiệt động học liên quan đến sự phân tách của ovalbumin trên một vài hệ hai pha thân nước khác nhau (được cấu tạo từ các PEG có khối lượng phân tử khác nhau và dextran), chỉ ra rằng quá trình chuyển ovalbumin lên pha trên là quá trình tỏa nhiệt, cho thấy có tương tác tĩnh điện giữa nhóm hydroxyl của PEG và chuỗi bên thân nước của protein [25]. Hệ ABS gồm 16% (w/v) PEG 1000 và 17% (w/v) kali phosphat cũng đã được Zhi cùng các cộng sự sử dụng để tinh chế ovotransferrin, ovalbumin và lysozym từ lòng trắng trứng. Nghiên cứu cho kết quả ovalbumin có độ tinh khiết cao (trên 95%) [35]. Abeyrathne cùng cộng sự đã tiến hành tách đồng thời ovalbumin, ovotransferrin, ovomucin và lysozym bằng các phương pháp khác nhau. Lysozym được tách trong bước đầu tiên nhờ sử dụng nhựa trao đổi ion FPC3500. Phần dịch sau khi loại lysozym tiếp tục được điều chỉnh pH thích hợp để loại ovomucin. Ovalbumin và ovotransferrin được tách khỏi dung dịch lòng trắng trứng đã loại lysozym và ovomucin bằng cách thêm vào dung dịch amoni sulfat và acid citric (nồng độ amoni sulfat và acid citric trong dung dịch tương ứng là 5% (w/v) và 2,5% (w/v)) để thu hồi kết tủa chứa ovotransferrin và phần dịch 12