Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm kháng sinh và hóa chất trong sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm intertek – cần thơ

  • Số trang: 64 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 38 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRƯƠNG THỊ OANH THÙY TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH VÀ HÓA CHẤT TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN TẠI PHÒNG KIỂM NGHIỆM INTERTEK – CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRƯƠNG THỊ OANH THÙY TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH VÀ HÓA CHẤT TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN TẠI PHÒNG KIỂM NGHIỆM INTERTEK – CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS. VƯƠNG THANH TÙNG PHẠM BÍCH KIỂU 2012 GIẤY XÁC NHẬN Đề tài luận văn “Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm kháng sinh và hóa chất trong sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm intertek – Cần Thơ ” do sinh viên Trương Thị Oanh Thùy thực hiện, theo sự hướng dẫn của ThS. Vương Thanh Tùng và chị Phạm Bích Kiểu báo cáo ngày 17/05/2012 đã được hội đồng thông qua. Luận văn đã được chỉnh sửa theo góp ý của hội đồng và được cán bộ hướng dẫn phê duyệt. Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2012 Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện Vương Thanh Tùng Trương Thị Oanh Thùy LỜI CẢM TẠ Trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường, tôi gặp không ít những khó khăn và để vượt qua các trở ngại đó ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được vô số những sự giúp đỡ của mọi người. Và để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn: Trước tiên, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cha, mẹ tôi những người luôn bên cạnh tôi, động viên tôi và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Cha, mẹ không ngại gian khó tiếp bước cho tôi đến trường và cho đến hôm nay, tôi tự hào vì tôi có được những kinh nghiệm cho cuộc sống từ nền tảng được cha, mẹ xây thật vững chắc. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Vương Thanh Tùng. Thầy luôn quan tâm, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian thực hiện luận văn Tốt nghiệp. Tiếp đến, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô và các anh chị trong Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức chuyên ngành và những kỹ năng cần thiết cho sau này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Chị Phạm Bích Kiểu – Trưởng phòng Kiểm Nghiệm Intertek đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập tại cơ quan. Xin chân thành cảm ơn các anh chị trong Phòng Hóa và các anh chị của phòng Kiểm Nghiệm đã giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian thực tập. Và tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thành viên trong lớp Chế Biến Thủy Sản K34. Các bạn luôn động viên, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian tôi học tập tại trường. Cuối cùng tôi xin gửi lời chúc thành đạt, sức khỏe tới cha, mẹ, các giảng viên, các anh chị trong Phòng Kiểm Nghiệm và tất cả các bạn. Một lần nữa xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người. Cần Thơ, ngày 10 tháng 05 năm 2012 Sinh Viên Thực Hiện Trương Thị Oanh Thùy Trang i TÓM LƯỢC Thủy sản Việt Nam đang trên đà nhìn ra toàn cầu nhưng vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, tồn lưu dư lượng kháng sinh, hóa chất và vi sinh vẫn còn là rào cản lớn. Đề tài “Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm kháng sinh, hóa chất tại phòng kiểm nghiệm Intertek” được thực hiện trên nền tảng các kiến thức được học. Trước tiên, quan sát các bước thực hiện quy trình kiểm nghiệm với kháng sinh và hóa chất. Việc ghi nhận được áp dụng trên thực tế tham gia vào cả quá trình kiểm tra Chloramphenicol và Malachite green-Leucomalachite green. Kết quả thu nhận: Phương pháp định lượng Chloramphenicol bằng LC/MS/MS. Đánh giá chung của một vài phương pháp kiểm tra Chloramphenicol đã được công bố. Phương pháp định lượng Malachite green và Leucomalachite green trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng LC/MS/MS. Nhận định chung cho một số phương pháp phân tích MG và LMG. Số lượng mẫu nhận vào và kết quả trả mẫu kiểm tra các chỉ tiêu cho các doanh nghiệp trong thời gian thực tập. Phản ánh tình hình tồn lưu kháng sinh, hóa chất trong các sản phẩm thủy sản. Trang ii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................................................................................. i TÓM LƯỢC................................................................................................... ii MỤC LỤC .................................................................................................... iii DANH SÁCH CÔNG THỨC VÀ HÌNH.........................................................v DANH SÁCH BẢNG ................................................................................... vi KÝ HIỆU VIẾT TẮT.................................................................................. viii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề...................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................... 1 1.3 Nội dung nghiên cứu...................................................................... 1 1.4 Thời gian thực hiện........................................................................ 1 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2 2.1 Giới thiệu chung về Phòng Kiểm Nghiệm INTERTEK – Cần Thơ 2 2.2 Kháng sinh, hóa chất tồn lưu trong thủy sản - vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm và sức khỏe con người........................................................ 2 2.2.1 Kháng sinh, hóa chất và những tác hại đối với thực phẩm và sức khỏe con người .............................................................. 2 2.2.2 Sơ lược về Chloramphenicol, Malachite green và Leucomalachite green ............................................................... 4 2.3 Phương pháp sắc kí........................................................................ 7 2.3.1 Sắc kí là gì?...................................................................... 7 2.3.2 Các kỹ thuật sắc kí ........................................................... 7 2.3.3 Sắc kí lỏng đầu dò khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS........... 8 2.4 Sơ lược lý thuyết về chiết pha rắn (SPE – Solid Phase Extraction ) [21] .......................................................................................................10 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................13 3.1 Vật liệu nghiên cứu.......................................................................13 3.2 Phương pháp nghiên cứu...............................................................13 3.2.1 Phương pháp tổng hợp kiến thức.....................................13 3.2.2 Phương pháp thực nghiệm...............................................13 3.2.3 Nội dung 1: Thu thập kết quả phân tích mẫu trong thời gian thực tập tại phòng kiểm nghiệm........................................13 3.2.4 Nội dung 2: Kiểm tra hàm lượng Chloramphenicol và Malachite green – Leuco Malachite green tồn lưu trong thủy sản và các sản phẩm thủy sản .........................................................13 3.3 Phương pháp thu thập , tính toán và xử lý số liệu..........................15 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................16 4.1 Kết quả phân tích Chloramphenicol và Malachite green – Leucomalachite green tại phòng kiểm nghiệm Intertek .......................16 4.2 Phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh Chloramphenicol trong thủy sản và các sản phẩm thủy sản bằng sắc kí lỏng khối phổ tại PKN ...........................................................................................................18 4.2.1 Phạm vi áp dụng của phương pháp..................................18 4.2.2 Nguyên tắc ......................................................................18 SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang iii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT 4.2.3 Dụng cụ và thiết bị ..........................................................18 4.2.4 Hóa chất và thuốc thử......................................................18 4.2.5 Quy trình chiết tách Chloramphenicol .............................20 4.2.6 Giải thích quy trình .........................................................21 4.2.7 Thông số chạy máy sắc kí LC/MS/MS ............................24 4.2.8 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp tại PKN.........25 4.2.9 Kết quả thí nghiệm Chloramphenicol trên mẫu ...............26 4.2.10 Kết luận.........................................................................29 4.3 Quy trình định lượng Malachite green và Leuco Malachite green bằng sắc kí lỏng hai lần khối phổ LC/MS/MS.....................................30 4.3.1 Phạm vi áp dụng..............................................................30 4.3.2 Nguyên tắc ......................................................................30 4.3.3 Thiết bị và dụng cụ..........................................................30 4.3.4 Hóa chất và thuốc thử......................................................30 4.3.5 Quy trình chiết tách MG và LMG ...................................33 4.3.6 Giải thích quy trình .........................................................34 4.3.7 Thông số chạy máy sắc kí LC/MS/MS ............................36 4.3.8 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp phân tích MG và LMG tại PKN so với một số phương pháp khác ..................37 4.3.9 Kết quả thí nghiệm Malachite green và Leucomalachite green trên mẫu .........................................................................38 4.3.10 Kết luận.........................................................................41 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................42 5.1 Kết luận ........................................................................................42 5.2 Đề xuất .........................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................43 PHỤ LỤC .....................................................................................................45 SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang iv Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT DANH SÁCH CÔNG THỨC VÀ HÌNH Công thức 2.1 Công thức cấu tạo Chloramphenicol........................................ 4 Công thức 2.2 Sự chuyển hóa giữa Malachite green và Leuco Malachite green ....................................................................................................................... 6 Công thức 2.3 Quá trình tạo ion của phân tử LMG ......................................... 6 Công thức 2.4 Cách tính tỉ số ion trong phân tích sắc ký ................................ 9 Công thức 2.5 Công thức tính RF (Response)............................................... 10 Công thức 2.6 Phương trình xây dựng đường chuẩn ..................................... 10 Hình 2.1 Hệ thống LC/MS/MS....................................................................... 8 Hình 2.2 Hệ thống chiết pha rắn SPE ........................................................... 10 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................. 14 Hình 4.1 Bảng thống kê kết quả phân tích mẫu – Intertek............................. 16 Hình 4.2 Quy trình phân tích Chloramphenicol ............................................ 20 Hình 4.3 Đường chuẩn CAP......................................................................... 26 Hình 4.4 Kết quả thí nghiệm CAP trên mẫu ................................................. 28 Hình 4.5 Quy trình phân tích MG và LMG .................................................. 33 Hình 4.6 Đường chuẩn MG và LMG ............................................................ 38 Hình 4.7 Kết quả thí nghiệm MG và LMG trên mẫu..................................... 39 SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang v Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 Kết quả phân tích mẫu................................................................... 16 Bảng 4.2 Nồng độ CAP trong mẫu xây dựng đường chuẩn........................... 22 Bảng 4.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn CAP trong thí nghiệm .................. 26 Bảng 4.4 Kết quả phân tích nồng độ đường chuẩn CAP ............................... 27 Bảng 4.5 Kết quả diện tích peak CAP d5 trên mẫu blank, mẫu QC và mẫu thật ..................................................................................................................... 27 Bảng 4.6 Kết quả phân tích nồng độ CAP trong mẫu thí nghiệm .................. 29 Bảng 4.7 Nồng độ MG và LMG trong mẫu xây dựng đường chuẩn.............. 35 Bảng 4.8 Kết quả xây dựng đường chuẩn MG và LMG................................ 38 Bảng 4.9 Kết quả diện tích peak MG d5 và LMG d5 trên mẫu blank, mẫu QC và mẫu thật................................................................................................... 39 Bảng 4.10 Kết quả phân tích nồng độ MG và LMG trong mẫu thí nghiệm ... 40 Bảng A1 Danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (Ban hành kèm Thông tư số 15/2009/TT-BNN, ngày 17 tháng 3 năm 2009 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sửa đổi năm 2012) .................................................................................................. 45 Bảng A2 Danh mục hóa chất, kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (Ban hành kèm Thông tư số 15/2009/TT-BNN, ngày 17 tháng 3 năm 2009 của Bộ trưởng BNN-PTNT, sửa đổi năm 2012) .......... 46 Bảng A3 Bảng Thống Kê Kết quả thực hiện chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại của Cơ quan quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản Khu vực Nam bộ .......................................................................................... 47 Bảng A4 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm ............................................................... 47 Bảng C1 Tổng hợp kết quả phân tích CAP ................................................... 50 Bảng C2 Tổng hợp kết quả phân tích MG .................................................... 50 Bảng C3 Tổng hợp kết quả phân tích LMG .................................................. 50 Bảng C4 Tổng hợp kết quả phân tích CAP tại PKN...................................... 51 Bảng C5 Tổng hợp kết quả phân tích MG tại PKN ....................................... 51 Bảng C6 Tổng hợp kết quả phân tích LMG tại PKN..................................... 52 SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang vi Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT Bảng D1 Phân tích thống kê CAP................................................................. 53 Bảng D2 Phân tích thống kê MG.................................................................. 53 Bảng D3 Phân tích thống kê LMG................................................................ 53 SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang vii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT KÝ HIỆU VIẾT TẮT VASEP EU XK TNHH PKN LC/MS/MS ppb ppm CAP MG LMG HPLC SPE LOD m ng API APCI ESI ACN EtOAC MeOH ml FA IS QC The Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers European Union Xuất Khẩu Trách nhiệm hữu hạn Phòng kiểm nghiệm Liquid chromatography-Mass spectrometry/Mass spectrometry part per billion part per million Chloramphenicol Malachite green Leucomalachite green High pressure Liquid chromatography Solid Phase Extraction limit of detection Micrometer Nanogram Atmospheric Pressure Ionization Atmospheric Pressure Chemical Ionization Electrospray Ionization Acetonitrile Ethyl acetate Methanol mililiter Acid formic Internal Standard Quality Control SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang viii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Thủy sản Việt Nam đang trên đà phát triển nhìn ra thị trường toàn cầu, theo thống kê của VASEP sản lượng xuất khẩu thủy sản lên đến 4960,757 triệu USD trong 10 tháng đầu năm 2011.[16] Thủy sản xuất khẩu của Việt Nam ngày càng được cải thiện về chất lượng và được ưa chuộng tại các thị trường lớn trên thế giới như EU, Mỹ và Nhật Bản. Tuy nhiên, theo hệ thống cảnh báo của 3 thị trường trên, vẫn còn tồn dư một số hóa chất và tạp chất trong các lô hàng thủy sản XK, đặc biệt là Trifluralin và Enrofloxacin, gây ảnh hưởng đến uy tín chung của các sản phẩm thủy sản Việt Nam (VASEP, 9/2011). Theo báo cáo của Cơ quan quản lý chất lượng nông lâm thủy sản Nam bộ về kết quả thực hiện chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại tháng 11/2011 tại khu vực Nam bộ thì các loại kháng sinh được sử dụng cho việc trị bệnh tại các ao nuôi cá tra, tôm thường là Quinolones, sulfanamides, trimethoprim, florfenicol, tetracyclines, chloramphenicol, fluoroquinolone, Malachite green và Leuco Malachite green, nitrofuran và các dẫn xuất… Nên việc tồn lưu kháng sinh, hóa chất trong sản phẩm thủy sản có nguy cơ trở thành rào cản xuất khẩu của nước ta. Các nước nhập khẩu yêu cầu nghiêm ngặt về sản phẩm xuất khẩu phải được kiểm định bởi các cơ quan kiểm nghiệm có uy tín cao, là điều kiện giúp chúng ta vượt rào cản tốt. Và Phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ là một trong những phòng kiểm nghiệm chất lượng nông lâm thủy sản của nước ta. Với những lý do trên, đề tài “Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm kháng sinh, hóa chất tại phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nhằm nắm vững các phương pháp kiểm nghiệm kháng sinh, hóa chất trong sản phẩm thủy sản và tìm hiểu điều kiện tối ưu cho các phương pháp. 1.3 Nội dung nghiên cứu Tìm hiểu các phương pháp kiểm tra kháng sinh, hóa chất trong sản phẩm thủy sản. Thực hành trên thực tế các phương pháp trên tại Phòng kiểm nghiệm. 1.4 Thời gian thực hiện Từ tháng 1/2012 đến tháng 4/2012 SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 1 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về Phòng Kiểm Nghiệm INTERTEK – Cần Thơ Công Ty TNHH Intertek Việt Nam – chi nhánh Cần thơ là một trong những chi nhánh của tập đoàn Intertek được thành lập từ năm 1885, trụ sở tại Anh Quốc là một trong những tập đoàn hàng đầu trên thế giới về lĩnh vực kiểm nghiệm, giám định và chứng nhận, với hơn 1000 văn phòng, chi nhánh, phòng kiểm nghiệm. Công Ty TNHH Intertek Việt Nam – chi nhánh Cần Thơ được thành lập theo giấy phép số 011043000077 ngày 10/11/2008 do Ủy Ban Nhân Dân Thành Phố Hà Nội cấp; chứng nhận đăng ký hoạt động chi nhánh số 5714000009F cấp ngày 17/02/2008 do Ủy Ban Nhân Dân Thành Phố Cần Thơ, Sở kế hoạch đầu tư cấp, với ngành nghề kinh doanh của Phòng Kiểm Nghiệm là kiểm nghiệm và giám định sản phẩm, xác nhận chất lượng, cung cấp dịch vụ chứng nhận theo hệ thống quản lý chất lượng và sản phẩm, cấp chứng thư cho các sản phẩm, tư vấn về hệ thống và kỹ thuật phòng kiểm nghiệm. [1] Phòng kiểm nghiệm công ty đã được VILAS công nhận ISO 17025:2005 theo quyết định số 644/QĐ-CNCL ngày 31/12/2008 số hiệu VILAS 278, lĩnh vực hóa học, sinh học. Theo quyết định 2595/QĐ-BNN-QLCL ngày 15/09/2009 về việc chỉ định Phòng Kiểm Nghiệm Công Ty TNHH Intertek Việt Nam chi nhánh Cần Thơ là phòng kiểm nghiệm chất lượng nông lâm thủy sản. Kèm theo quyết định này là danh mục các chỉ tiêu được chỉ định của Phòng Kiểm Nghiệm Công Ty TNHH Intertek Việt Nam chi nhánh Cần Thơ. Địa chỉ: M10, 11, 12, 13 Khu đô thị Nam Sông Cần Thơ, Phường Phú Thứ, Quận Cái Răng, TP. Cần Thơ. 2.2 Kháng sinh, hóa chất tồn lưu trong thủy sản - vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm và sức khỏe con người 2.2.1 Kháng sinh, hóa chất và những tác hại đối với thực phẩm và sức khỏe con người Kháng sinh là một nhóm chất hữu cơ phức tạp đầu tiên do vi sinh vật sản xuất ra trong quá trình sinh trưởng và với một lượng nhỏ có thể gây hại cho sinh vật khác. Cơ chế tác động của kháng sinh bao gồm: SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 2 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT - Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn. - Ức chế chức năng của màng tế bào. - Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. - Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic. Mặt khác, kháng sinh gây ra những ảnh hưởng bất lợi đối với sức khỏe con người, môi trường và kể cả vật nuôi được tiêm kháng sinh.[2] Các ảnh hưởng của không tốt của kháng sinh bao gồm: - Tạo ra dòng vi khuẩn kháng thuốc. Đây là vấn đề đáng lo ngại vì Việt Nam là nước đang sử dụng kháng sinh thế hệ thứ 2 nên nếu tăng liều kháng sinh lên trong quá trình trị bệnh thì hầu như vi khuẩn sẽ lờn thuốc và khó điều trị.[14] - Giảm quá trình hấp thu kháng sinh. - Gây rối loạn vi khuẩn có lợi trong đường ruột. - Tạo ra sức đề kháng chéo. - Có độc tính cao gây ảnh hưởng với sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường. - Một số kháng sinh có tiềm ẩn gây ra nhiều căn bệnh cho con người như ung thư… Và còn nhiều ảnh hưởng khác. Trong thủy sản, việc tồn lưu kháng sinh, hóa chất dần dần trở thành phổ biến. Nhiều qui định mới về dư lượng kháng sinh, hóa chất được ban hành nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh hóa chất quá liều và không đúng cách của người nuôi trồng thủy sản. Trong khi, thủy sản là một trong những thế mạnh xuất khẩu của Việt Nam. Nhiều lô hàng bị nhiễm kháng sinh, hóa chất cấm hoặc dư lượng kháng sinh, hóa chất hạn chế cao hơn mức qui định đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành thủy sản. Nguyên nhân tồn lưu của kháng sinh, hóa chất trong thủy sản là do: - Kháng sinh có thế kích thích tăng trọng cho thủy sản - Kháng sinh, hóa chất dùng để trị bệnh trong quá trình nuôi. - Kháng sinh, hóa chất sử dụng bảo quản nguyên liệu thủy sản hay thức ăn nuôi thủy sản. - Hóa chất sử dụng trong quá trình cải tạo môi trường nuôi. [20] Nếu tình trạng sử dụng kháng sinh, hóa chất không được kiểm soát thì trong tương lai sẽ có nhiều trường hợp kháng thuốc xảy ra đối với một số dòng vi khuẩn. Vì thế, nhà nước đã đưa ra danh mục những kháng sinh, hóa chất cấm sử dụng và danh mục kháng sinh, hóa chất hạn chế sử dụng để nhằm kiểm soát vấn đề kháng sinh, hóa chất tồn lưu trong sản phẩm thủy sản. SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 3 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT 2.2.2 Sơ lược về Chloramphenicol, Malachite green và Leucomalachite green 2.2.2.1 Chloramphenicol Năm 1947, chloramphenicol được cô lập từ Streptomyces venezuelae. Do có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố tốt vào các mô trong cơ thể nên chloramphenicol rất được ưa chuộng trong trị liệu. Tuy nhiên từ khi phát hiện độc tính đáng kể trên cơ quan tạo máu, việc sử dụng chất này được giới hạn và cho đến nay nó trở thành khàng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Chloramphenicol có phổ tác dụng rộng. Có khả năng diệt rất nhiều vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), các vi khuẩn hiếm khí, kị khí và các loại nấm. Công thức 2.1 Công thức cấu tạo Chloramphenicol Trong thủy sản, Chloramphenicol được sử dụng để tắm cho tôm khi tôm bị bệnh do nấm hoặc do vi khuẩn. Chloramphenicol cũng được dùng chữa các bệnh: nhiễm khuẩn máu cho cá, phun vào nước để chữa bệnh phát sáng (dùng kết hợp với bactrim), chữa bệnh đỏ dọc thân ấu trùng, trộn với thức ăn để trị bệnh đốm nâu (tôm càng xanh) và bệnh mòn vỏ kitin. Ngoài ra, Chloramphenicol còn được sử dụng trong chế biến và bảo quản thủy sản để chống ôi thiu.[19] Chloramphenicol là chất kháng sinh có độc tố cao, chỉ sử dụng với liều nhất định, được quy định rất chặt chẽ và thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng đối với trẻ em vì ảnh hưởng đến tình hình tăng trưởng. Tác dụng đáng sợ của Chloramphenicol là làm suy tủy. Nếu Chloramphenicol vào trong cơ thế người có sẵn bệnh lý gan, thận, hoặc sẵn bệnh lý suy tủy tiềm tàng, rối loạn tăng trưởng sụn xương thì lúc đó khả năng gây độc của loại thuốc này không lường trước được.[19] Chloramphenicol là một loại kháng sinh, có các đặc tính kháng khuẩn và dược động học nên được sử dụng cho quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc động vật. Tuy nhiên, trong cơ thể người nó lại gây ra những độc tính huyết học, cụ thể là thiếu máu biến dạng với một hàm lượng nào đó chưa SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 4 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT được xác định rõ. Điều này dẫn đến việc Chloramphenicol đã bị cấm sử dụng trong việc điều trị cho súc vật dùng làm nguyên liệu chế biến thực phẩm. Nhật Bản và các nước Âu Mỹ cũng định mức kiểm soát Chloramphenicol rất nghiêm ngặt, quy định thủy sản phải có kết quả xét nghiệm âm tính với Chloramphenicol, nhưng thực tế mức kiểm soát ở Nhật là 0.5ppb (part per billion: phần tỷ), ở EU và Mỹ là 0.3ppb. Có nhiều nghiên cứu về CAP trong và ngoài nước, theo Nguyễn Thanh Điền và Phùng Võ Cẩm Hồng [3] nghiên cứu về sự đào thải CAP trên tôm sú trong điều kiện thí nghiệm với nồng độ CAP cho vào thức ăn là 20ng/g thì thời gian đào thải CAP là 60 giờ và thời gian bán rã của CAP trên thịt tôm là 13,5 giờ, việc nghiên cứu này giúp các nhà quản lý và người nuôi sử dụng kháng sinh hợp lý ở Việt Nam. 2.2.2.3 Malachite green và Leucomalachite green Malachite green được sử dụng để trị bệnh ký sinh trùng ngoài da, nấm, những bệnh do các động vật nguyên sinh gây ra (bệnh protozoa) trong cá và trứng cá. MG được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ở giai đoạn xử lý ao nuôi và nhiễm vào trong tảo, rong trong ao. Khi nuôi tôm, cá trong ao có tồn lưu MG thì khi vào trong cơ thể tôm, cá chất này sẽ chuyển hóa thành hợp chất bền LMG. Leucomalachite green, được sinh ra từ sự khử Malachite green bởi các enzyme trong cá, một hợp chất chuyển hóa rất bền của Malachite green. Leucomalachite green được tích lũy bên trong, vỗ béo cơ thịt, tồn trữ lâu dài trong cơ thịt của cá. Quá trình chuyển hóa ngược lại diễn ra rất khó. Tuy nhiên, trong một vài nghiên cứu trên những động vật thí nghiệm (chủ yếu là chuột), Malachite green gây độc cho gan, gây ra bệnh thiếu máu, những sự bất thường trong tuyến giáp, ảnh hưởng đến sự phát triển thai nhi của những động vật thí nghiệm. Qua việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra quyết định rằng Malachite và Leucomalachite là hai chất nguy hiểm có tiềm năng gây ung thư cho người. Về genotoxicity (khả năng gây ra thiệt hại cho Gen), cho rằng Malachite green và Leucomalachite green là nguyên nhân gây ra sự biến đổi Gen hoặc thiệt hại cho Gen.[15] Vì thế, các thị trường nhập khẩu thủy sản và các sản phẩm thủy sản yêu cầu gay gắt về tồn lưu MG và LMG. Hiện tại, MG và chuyển hóa của nó được đưa vào danh sách chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Yêu cầu giới SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 5 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT hạn phát hiện đối với các phương pháp kiểm tra nằm trong giới hạn quy định 2 ppb đối với thị trường Mỹ, EU và Nhật Bản. Sự chuyển hóa giữa Malachite và Leucomalachite: Reduction - HCl - Cl H3C N N CH3 CH3 CH3 Oxidation H3C N N CH3 CH3 CH3 Leucomalachite green (LMG) Malachite green (MG) Công thức 2.2 Sự chuyển hóa giữa Malachite green và Leucomalachite green Theo nghiên cứu của trường Đại Học Nông Lâm – Thành Phố Hồ Chí Minh áp dụng việc tối ưu hóa cho phương pháp phân tích bằng LC/MS/MS với việc nghiên cứu 2 loại nguồn ion hóa là ESI và APCI thì kết quả cho thấy nguồn ion hóa ESI cho hiệu quả cao hơn hẳn theo giải thích như sau: [21] - Trong công thức cấu tạo, MG có mang điện tích dương trên nitơ nên tạo ra ion dương có m/z = MMG = 329. - Đối với LMG là chất kém phân cực hơn trong phân tử có nhiều nguyên tử nitơ hơn nên dễ dàng bị proton hóa bởi acid trong pha động để tạo thành peak mẹ có m/z = 331. Theo cơ chế: H+ H+ Công thức 2.3 Quá trình tạo ion của phân tử LMG - Ngoài ra, khi so sánh cường độ peak sắc kí thì độ nhạy của ESI tốt hơn APCI. Cũng theo nghiên cứu này cho thấy, việc sử dụng pha động khá ảnh hưởng tới kết quả phân tích, độ bền của chất phân tích và ảnh hưởng đến máy phân tích. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng pha động có độ pH thấp sẽ làm biến đổi MG thành LMG và môi trường acid cũng ảnh hưởng lớn đến cột sắc kí. Nếu pH <2, sẽ xảy ra sự phân ly của các nhóm eter ra khỏi cột làm cột SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 6 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT mất hoạt tính làm cho các chất phân tích không thể tương tác với cột. Và pha động có nồng độ acid formic 0,1% là thích hợp nhất cho quy trình phân tích. 2.3 Phương pháp sắc kí 2.3.1 Sắc kí là gì? Sắc kí là một họ các kỹ thuật hóa học phân tích để tách các chất trong một hỗn hợp. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong pha động (thường là dòng chảy của dung môi), di chuyển qua pha tĩnh. Pha tĩnh có tác dụng trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Các thành phần này di chuyển qua hệ thống pha tĩnh với tốc độ khác nhau theo thời gian và mỗi thành phần có thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Nguồn gốc của sắc kí, do nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh ra vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Chữ sắc trong sắc kí có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc. [23] Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc kí phân bố. Kĩ thuật sắc kí phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kí cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. 2.3.2 Các kỹ thuật sắc kí Sắc kí giấy Sắc kí lớp mỏng Sắc kí khí – lỏng Sắc kí trao đổi ion Sắc kí ái tình kim loại bất động Sắc kí lỏng hiệu cao năng Sắc kí thẩm thấu gel Sắc kí ái lực SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 7 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT 2.3.3 Sắc kí lỏng đầu dò khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS 2.3.3.1 Cấu tạo của LC/MS/MS Hệ thống LC/MS/MS (của hãng Waters) gồm 7 thành phần cơ bản sau [12] : + Hệ thống bơm (Pump system) + Hệ thống tiêm mẫu (Injection system) + Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột) + Cột sắc kí (pha tĩnh – stationary phase) + Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi) + Đầu dò khối phổ (Detector) + Hệ thống xử lý dữ liệu Hình 2.1 Hệ thống LC/MS/MS SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 8 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Khoa Thủy Sản – Trường ĐHCT 2.3.3.2 Sơ lược về đường đi của chất phân tích trong máy sắc kí LC/MS/MS tại phòng kiểm nghiệm Đối với máy sắc kí LS-MS/MS thì có 2 khay đựng các vial, mỗi khay chứa 48 vial. Khi cho các mẫu vào vị trí có thứ tự trong vial thì đồng thời phải ghi nhận trong phần mềm chạy sắc kí các code của mẫu và ngày phân tích để lưu giữ kết quả. Sau khi sắp xếp các vial vào khay cho khay vào đúng vị trí trong buồng tiêm mẫu. Điều khiển máy vi tính quá trình tiêm mẫu của máy bằng cách chọn trên màn hình vi tính mẫu nào sẽ được phân tích trước và cho máy LC/MS/MS tiến hành bơm mẫu với lượng là 10  l. Tiếp theo bộ phận bơm pha động sẽ bơm pha động cho vào buồng trộn mẫu để trộn đều mẫu và pha động. Hỗn hợp mẫu và pha động được bơm qua cột sắc kí, ở đây, cột sắc kí giữ lại các chất do lực tương tác giữa chất nhồi cột và các chất trong hỗn hợp pha động và mẫu (pha động được bơm liên tục trong thời gian phân tích). Các chất có lực liên kết mạnh thì thời gian qua khỏi cột dài hơn và ngược lại. Sau khoảng thời gian đó, các chất được đưa vào buồng cột, ở đây có chứa khí mang là Nitơ và cũng tại đây các chất bắt đầu hóa hơi do nhiệt độ ở đây lên cao đến vài trăm độ celcius (nhìn chung, các chất hóa hơi không hoàn toàn nên các chất không hóa hơi sẽ ngưng tụ và thải ra ngoài theo đường khí thải). Nhờ có áp lực bơm nên khí mang Nitơ kéo các chất hóa hơi vào trong MS/MS, ở đây chứa một loại khí trơ là Argon sẽ tiến hành bắn phá các chất hóa hơi được khí mang Nitơ kéo theo (trong đó có chất phân tích), do nhiệt độ cao và tốc độ di chuyển khác nhau nên các chất phân tích được bắn và tạo thành các ion có khối lượng phân tử nhỏ hơn chất mẹ ban đầu. Sau khi qua MS/MS thì các ion nhỏ được đi đến đầu dò (đầu dò được cài đặt để đếm các ion có khối lượng phân tử bằng với các ion con của chất phân tích và nội chuẩn của chất phân tích (nếu có) được bắn phá ra). Đầu dò đếm các ion và biểu hiện trên màn hình là các peak. Dựa vào các peak ta tính được nồng độ nhiễm của chất phân tích trong từng mẫu. 2.3.3.3 Cách tính toán kết quả Tính tỉ số ion theo phương trình sau: R 100 xA1 x% A2 Công thức 2.4 Cách tính tỉ số ion trong phân tích sắc ký Trong đó: R: tỉ số ion (%) A1: diện tích của peak thứ cấp có cường độ cao A2: diện tích của peak thứ cấp có cường độ thấp SVTH: Trương Thị Oanh Thùy Trang 9
- Xem thêm -