Tài liệu Tìm hiểu mối liên quan giữa sự có mặt của gen core-precore với một số dấu ấn của hbv trong huyết thanh

Bé gi¸o dôc vμ ®μo t¹o Bé Y tÕ Tr−êng §¹i häc Y Hμ Néi ------Y Z------ §μm thÞ tó anh t×m hiÓu mèi liªn quan gi÷a sù cã mÆt cña gen core/precore víi mét sè dÊu Ên cña hbv trong huyÕt thanh luËn v¨n th¹c sü y häc Chuyªn ngµnh: miÔn dÞch häc M· sè: 60.72.04 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: TS. ph¹m ®¨ng khoa Hμ néi - 2008 MỤC LỤC Mục lục Chữ viết tắt ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. 3 Đại cương về bệnh viêm gan B 1.1.1. Dịch tễ học bệnh viêm gan B 3 1.1.1.1 Dịch tễ học bệnh viêm gan B trên thế giới 3 1.1.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan B tại Việt nam. 5 1.1.2. Lâm sàng và mức độ nguy hiểm của bệnh viêm gan B 8 1.1.2.1 Viêm gan B cấp 8 1.1.2.2 Viêm gan B mạn 10 1.2. Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan B. 11 1.2.1 Cấu trúc của vi rút viêm gan B 11 1.2.2. Sự nhân lên của HBV 13 1.2.3. Các phương thức lây truyền của HBV 14 1.2.3.1. Lây truyền HBV từ mẹ sang con 15 1.2.3.2. Lây HBV qua đường tiêm truyền 15 1.2.3.3. Lây HBV qua đường tình dục 15 1.3. Vai trò của các đoạn gen trong bộ gen của HBV 16 1.4. Các dấu ấn huyết thanh của HBV 17 1.4.1 Kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) và anti-HBs 17 1.4.2 Kháng nguyên lõi của HBV (HBcAg) và anti-HBc 18 1.4.3 Kháng nguyên e của HBV (HBeAg) và anti-HBe 19 1.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 20 1.5.1 Kỹ thuật PCR 20 1.5.2 Kỹ thuật ELISA 23 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Đối tượng nghiên cứu 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.3. Các bước tiến hành nghiên cứu 24 2.4. Các kỹ thuật sẽ sử dụng trong nghiên cứu 25 2.4.1. ELISA xác định các dấu ấn HBsAg, anti-HBs, HBeAg, antiHBe, anti-HBc. 25 2.4.1.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện HBsAg trong huyết thanh 25 2.4.1.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện Anti-HBs trong huyết thanh 25 2.4.1.3 Kỹ thuật ELISA phát hiện HbeAg trong huyết thanh 26 2.4.1.4 Kỹ thuật ELISA phát hiện anti-HBe trong huyết thanh 27 2.4.1.5 Kỹ thuật ELISA phát hiện Anti-HBc trong huyết thanh 28 2.4.2 Kỹ thuật PCR xác định gen Core/Pre-Core 29 2.5. Thu thập và xử lý số liệu 31 2.6. Thời gian tiến hành nghiên cứu 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 32 3.1. Tỷ lệ phát hiện gen core/precore 32 3.2. Đánh giá tỷ lệ phát hiện các dấu ấn HBeAg, anti-HBe, antiHBc, anti-HBs 34 3.3. Mối liên quan giữa gen Core/Pre-Core với bốn dấu ấn trong huyết thanh 35 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 38 4.1. Tỷ lệ phát hiện gen Core và gen PreCore ở các phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ có HBsAg(+) 40 4.2. Tỷ lệ phát hiện HBeAg, anti-HBe, anti-HBc, anti-HBs 42 4.3. Mối liên quan giữa sự hiện diện của gen Core, gen PreCore với bốn dấu ấn trong huyết thanh 47 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHỮ VIẾT TẮT Anti- HBs : Antibody against Hepatitis B surface antigen. ( Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B) Anti- HBc : Antibody against Hepatitis B core antigen. ( Kháng thể kháng kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B) Anti- HBe : Antibody against Hepatitis B e antigen. ( Kháng thể kháng kháng nguyên e vi rút viêm gan B) Au : Australia antigen. ( Kháng nguyên Australia) cccDNA : DNA vòng đóng tương đương. ( Covalently closed circle DNA). DNA : Deoxyribonucleic Acid. ( Axít deoxyribonucleic) ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay ( Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn men) HBV : Hepatitis B virus ( Vi rút viêm gan B) HBsAg : Hepatitis B surface antigen. ( Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B) HBcAg : Hepatitis B core antigen. ( Kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B) HBeAg : Hepatitis B e antigen. ( Kháng nguyên e vi rút viêm gan B) PCR : Polymerase Chain Reaction. ( Phản ứng khuếch đại chuỗi) 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan B là bệnh gan truyền nhiễm gây ra bởi vi rút viêm gan B (Hepatitis B Virus). Trong sáu loại vi rút gây viêm gan ( A, B, C, D, E, và G ), vi rút viêm gan B được đặc biệt quan tâm bởi tính chất lây truyền và mức độ nguy hiểm của nó. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) đến cuối năm 2000, thế giới có hơn 2 tỷ người nhiễm HBV. Khoảng 400 triệu người mang HBV mạn tính. Hàng năm có hơn 500 000 người mang HBV mạn tính chết vì xơ gan và ung thư gan [44]. Người ta thấy rằng 90% những người mang HBV mạn tính ở các nước Đông Nam Á là bị lây nhiễm ở thời kỳ chu sinh, đặc biệt là trong cuộc đẻ [23]. Như vậy, nhiễm HBV ở thời kỳ sơ sinh là rất nguy hiểm, bởi đại đa số những trẻ này sẽ là người mang HBV mạn tính với nguy cơ tiến triển thành những bệnh gan mạn tính là rất lớn. Lây nhiễm cho trẻ nhỏ ở thời kỳ sơ sinh chủ yếu là từ những mẹ có mang HBV, đặc biệt là ở những mẹ mang HBV mạn tính. Việt Nam là nước thuộc khu vực có tỷ lệ HBV lưu hành cao. Người mang HBsAg(+) trong cộng đồng ở Việt Nam chiếm tỷ lệ 11,1% đến 16,8% [1,4,5,12,15,16,18]. Tỷ lệ phụ nữ mang HBV mạn tính cao. Đặc biệt những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ nếu mang cả hai kháng nguyên bề mặt HBsAg và HBeAg thì khả năng lây truyền HBV cho con của họ tăng lên rõ rệt. Phát hiện HBV ở Việt Nam hiện nay phổ biến sử dụng kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbernt Assay). Đây là kỹ thuật phát hiện kháng nguyên bề mặt (HBsAg) hay kháng nguyên hoà tan (HBeAg) của HBV và các kháng thể (Anti-HBs, Anti-HBc, Anti-HBe). Những kỹ thuật này chỉ cho phép phát hiện các dấu ấn hòa tan của HBV mà không trực tiếp phát hiện cấu trúc genom của HBV, kỹ thuật này không cho thấy khả năng đang nhân lên của HBV. Kỹ thuật PCR phát hiện các cấu trúc genom của HBV. Gen Core/Precore chứa thông tin liên quan đến sự nhân lên của HBV. Vì vậy, việc phát hiện gen Core và gen PreCore trong huyết thanh bằng kỹ thuật 2 PCR cho phép xác định chính xác sự có mặt của HBV cũng như khả năng nhân lên HBV ngay ở giai đoạn sớm của nhiễm HBV. Đặc biệt việc phát hiện gen PreCore còn liên quan đến sự xuất hiện hay không của HBeAg, một kháng nguyên được cho là có vai trò quan trọng trong sự lây nhiễm HBV từ mẹ sang con. Thế giới đã có nhiều các công trình nghiên cứu về vấn đề này. Nhiều công trình đã tiến hành giải trình tự gen Core, gen PreCore và xác định được các vị trí hay xảy ra đột biến ở vùng gen Core và vùng gen PreCore. Tuy nhiên, chưa có công trình nào khảo sát về mối liên quan giữa sự có mặt của hai gen Core/PreCore với sự có mặt của các dấu ấn trong huyết thanh. Ở Việt Nam nhiều công trình nghiên cứu về HBV đã được công bố. Các nghiên cứu chủ yếu ở khía cạnh lâm sang, sự hiện diện và sự thay đổi của dấu ấn trong huyết thanh ở các bệnh nhân viêm gan mạn, viêm gan cấp, bệnh nhân xơ gan, và ung thư gan… Về sinh học phân tử, cũng đã có một số công trình nghiên cứu kết hợp với nước ngoài để xác định các thể đột biến của HBV trên các bệnh nhân có bệnh gan mạn tính. Có công trình đã tiến hành xác định HBV-DNA trên những phụ nữ có thai có HBsAg(+) và một số trẻ nhỏ con của những sản phụ này. Nhưng cũng chưa thấy có công trình nào công bố về tỷ lệ phát hiện gen Core và gen PreCore cũng như mối liên quan của hai gen này với một số dấu ấn huyết thanh ở những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với hai mục tiêu : 1. Phát hiện gen Core / PreCore ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ mang HBsAg. 2. Tìm hiểu mối liên quan giữa sự có mặt của gen Core/PreCore với một số dấu ấn của HBV trong huyết thanh. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan B. 1.1.1. Dịch tễ học bệnh viêm gan B. 1.1.1.1. Dịch tễ học bệnh viêm gan B trên thế giới. Vi rút viêm gan B (HBV - Hepatitis B Virus) là một tác nhân gây viêm gan rất đa dạng về phương diện dịch tễ. Tỷ lệ mang HBV rất khác biệt ở những vùng địa lý khác nhau và liên quan đến độ tuổi khi bị nhiễm HBV [64]. Theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới đến cuối năm 2000, thế giới có khoảng 400 triệu người mang HBV, hơn 500 000 trong số đó chết do các bệnh gan hàng năm [44]. Ở Mỹ tỷ lệ mang HBV mạn tính là 1,25 triệu người [22,53]. Tỷ lệ người mang HBV trên toàn thế giới dao động từ 0,1% đến 20%, khác nhau giữa các châu lục. Căn cứ vào tỷ lệ mang HBV trong cộng đồng người ta chia thế giới thành ba khu vực với ba mức độ lưu hành dịch khác nhau. Khu vực dịch lưu hành thấp: có tỷ lệ mang HBV từ 0,1% đến 2%, đó là các vùng như Tây Âu, Úc, Niu-di-lân và Mỹ. Khu vực dịch lưu hành trung bình đó là các nước Trung Đông, Nhật Bản, Ấn Độ và Singapo, tỷ lệ mang HBV ở đây khoảng 3% đến 5%. Khu vực lưu hành dịch cao đó là Đông Nam Á và khu vực Tiểu Sahara thuộc Châu Phi có tỷ lệ người mang HBV trong cộng đồng từ 10% đến 20% [49]. Ở Mỹ số người nhiễm HBV bao gồm cả mới nhiễm và số cũ là khoảng 5%, đáng lưu ý là gần 100% những người lớn trong số này là người Đông Nam Á và người Phi. Nhìn chung sự nhiễm HBV tăng lên theo tuổi và tỷ lệ nhiễm HBV cao ở những cộng đồng người Mỹ gốc Phi, người Mỹ gốc Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và gốc Á [53]. Một vài nghiên cứu cũng cho thấy một số cộng đồng có tỷ lệ người mang HBV cao hơn các cộng đồng lân cận như người Eskimo ở Alaska, người sống ở các đảo thuộc Châu Á - Thái Bình Dương và những thổ dân ở Australia. 4 Ở hầu hết các nước thuộc khu vực có dịch lưu hành cao như Hồng Kông và Trung Quốc, lây truyền chu sinh ( lây truyền dọc) là phương thức lây truyền chủ yếu. Những người nhiễm HBV mạn tính ở đây chủ yếu là do bị lây nhiễm trong giai đoạn chu sinh. Nhưng ở một số vùng khác như Châu Phi và Trung Đông, lây truyền ngang trong hai năm đầu đời là chủ yếu, đây cũng là phương thức lây truyền chính ở của một số các bệnh địa phương khác. Hiện tại vẫn chưa có lý giải rõ ràng nào cho việc chiếm ưu thế trong phương thức lây truyền chu sinh ở những người có nguồn gốc Á Đông. Nhưng người ta thấy ở những người Á Đông có tỷ lệ cao mang đồng thời cả HBsAg và HBeAg. Thêm vào đó 40% đến 50% những người mang cả hai loại kháng nguyên ( HBsAg và HBeAg) ở trong độ tuổi sinh sản trong khi ở Châu Phi số người cùng trong nhóm này chỉ có 10% đến 20%. Những khu vực dịch lưu hành trung bình, sự lan truyền HBV là tương đương ở các nhóm tuổi. Nhưng người ta cũng thấy hầu hết những lây nhiễm sớm đều dẫn đến nhiễm HBV mạn tính. Ở những khu vực dịch lưu hành thấp hầu hết các trường hợp lây nhiễm là do sinh hoạt tình dục không được bảo vệ hoặc do tiêm truyền khi còn trẻ tuổi. Thực tế cho thấy tuổi bị nhiễm HBV có ý nghĩa rất quan trọng lien quan đến các diễn biến lâm sàng sau này của người bệnh [62]. Bởi vì 90% trẻ bị nhiễm ở giai đoạn sơ sinh, đặc biệt là lúc đẻ sẽ chuyển thành nhiễm HBV mạn tính. Nếu trẻ bị nhiễm trong giai đoạn từ 1 đến 5 tuổi chỉ 25% đến 50% chuyển mạn tính. Và chỉ 5% bị chuyển thành mạn tính khi người bị nhiễm đã ở tuổi trưởng thành [23]. 1.1.1.2. Dịch tễ học bệnh viêm gan B tại Việt Nam. Đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm HBV ở người Việt Nam trên khắp các vùng miền trong cả nước. Các kết quả đều cho thấy tỷ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng là rất cao. Tại Hà nội: Lê Vũ Anh, bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng của 1.304 người thuộc cộng đồng dân cư ở Hà Nội, cho thấy tỷ lệ người mang HBsAg là 11,35±0,02% [1]. Trần Thị Chính nghiên cứu những người lành là cán bộ công chức và sinh viên Y thấy tỷ lệ mang HBsAg là 14,4% [5]. Phan Thị Phi Phi khảo sát trên người lành và người ung thư tế bào gan thấy tỷ lệ mang HBV là 13,9% [15]. Nguyễn Anh Tuấn bằng phương pháp 5 miễn dịch phóng xạ phát hiện các dấu ấn của HBV, thấy trong số 3.311 công nhân làm việc tại Hà nội được làm xét nghiệm số người HBsAg(+) là 11.1% [18]. Phạm Văn Lình điều tra ngẫu nhiên trên 1.478 người từ 3 đến 70 tuổi sống ở Huế, đã rút ra tỷ lệ HBsAg(+) trong cộng đồng ở Huế là 16,8%, trong đó nam chiếm 10,4% và nữ là 6,4%. Nếu so sánh giữa các nhóm tuổi thấy rằng HBsAg(+) cao nhất ở nhóm tuổi từ 31 - 40 (chiếm 21,2%). Xét theo nhóm nghề nghiệp kết quả là nhóm nghề lao động chân tay ( thợ nề, thợ uốn tóc, thợ sửa xe…) chiếm tỷ lệ cao nhất 28% [12]. Viên Chinh Chiến bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên trên 587 người từ 6 tháng tuổi đến 81 tuổi cho thấy tỷ lệ mang HBsAg trong cộng đồng tại Nha Trang là 10,6%. Xét theo nhóm tuổi, tác giả thấy cao nhất ở nhóm từ 20 đến 40 tuổi. Xét theo nghề nghiệp nhóm nghề tự do và lao động chân tay chiếm tỷ lệ cao trong số những người mang HBsAg (43,6%). Các yếu tố phơi nhiễm như phẫu thuật, lấy máu, tiêm chích cũng làm cho tỷ lệ HBsAg(+) cao [4]. Cả hai nghiên cứu tại Huế và Nha Trang còn cho thấy không thấy có trường hợp nào HBsAg(+) ở nhóm tuổi trên 60 và không thấy có sự khác biệt về tỷ lệ mang HBsAg trong cộng đồng ở các vùng sinh thái khác nhau và giữa các dân tộc. Tại Thành phố Hồ Chí Minh, Phạm Hoàng Phiệt đã tổng kết trên 9.087 người đến xét nghiệm HBsAg trước khi tiêm chủng vắc xin và kết quả có HBsAg(+) là 14,8% [16]. Từ các nghiên cứu trên cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV ở Việt Nam là từ 11,1% đến 16,8%. Việt Nam là nước có tỷ lệ lưu hành HBV cao theo xếp loại của tổ chức y tế thế giới. Bên cạnh các đường lây truyền phổ biến như: lây qua tiêm truyền, lây qua đường tình dục thì phương thức lây truyền dọc (từ mẹ sang con) và những lây truyền sớm do tiếp xúc khi trẻ còn nhỏ (trước tuổi đi học) là một nguyên nhân quan trọng dẫn đến tỷ lệ cao HBsAg(+) cao trong cộng đồng. Người ta thấy trẻ ở tuổi tiền học đường (4 - 6 tuổi) có tỷ lệ mang HBsAg là 18,4%, trẻ bị nhiễm chủ yếu là do tiếp xúc trong gia đình như với bố mẹ, anh chị em, ông bà [32]. 6 Nghiên cứu của Nguyễn Anh Tuấn cho thấy trong số 1.564 phụ nữ có thai được làm xét nghiệm có 10,6% người HBsAg(+) và dẫn đến 23,6% con của các bà mẹ này có HBsAg(+) [18]. Ngoài HBsAg Việt Nam còn là nơi có tỷ lệ người mang HBeAg thuộc loại cao trên thế giới, đặc biệt là ở phụ nữ trong lứa tuổi sinh đẻ. Tỷ lệ phụ nữ có thai có HBeAg(+) là 5,1% [10]. Các nghiên cứu của Việt Nam cũng như thế giới đều đã cho thấy HBeAg có vai trò rất quan trọng trong lây truyền HBV, đặc biệt trong lây truyền từ mẹ sang con. Chu Thị Thu Hà nghiên cứu trên 1.300 sản phụ tới sinh con tại bệnh viện Phụ sản trung ương Hà nội, số sản phụ có HBsAg(+) chiếm 12,5%, số sản phụ có cả HBsAg(+) và HBeAg(+) là 40,5%. Máu cuống rốn con của các mẹ có HBsAg(+) có kháng nguyên bề mặt của HBV tới 49,08% [10]. Theo Đinh Thị Bình tỷ lệ mang HBsAg ở 1.564 sản phụ ở Hà nội là 10,6%. Trong 141 sản phụ có 25,5% mang cả hai kháng nguyên HBsAg(+) và HBeAg(+). Nếu mẹ có cả HBsAg(+) và HBeAg(+), tỷ lệ HBsAg(+) trong máu cuống rốn con của họ là 66,7%, còn con các mẹ chỉ có HBsAg(+) nhưng HBeAg(-) tỷ lệ này là 23,6% [3]. Theo Đỗ Trung Phấn các mẹ mang cả hai kháng nguyên HBsAg và HBeAg sẽ truyền HBsAg cho 67,1% con của họ và nếu mẹ chỉ mang HBsAg thì chỉ truyền cho 14,6% con của họ [14]. Nghiên cứu của Đỗ Tuấn Đạt cũng cho thấy tỷ lệ mang HBsAg ở phụ nữ có thai là 10,5%. Số sản phụ mang cả hai kháng nguyên HBsAg và HBeAg là 3,6%, và nguy cơ truyền HBsAg cho con ở các sản phụ này tăng 16,5 lần [7]. Như vậy nếu mẹ có cả hai dấu ấn bề mặt của HBV sẽ có nguy cơ truyền HBsAg cho con họ gấp 2,8 lần theo Đinh Thị Bình [3] và gấp 4,6 lần theo Đỗ Trung Phấn [14]. Điều này cũng cho thấy vai trò quan trọng của HBeAg trong lây nhiễm HBV theo chiều dọc ở Việt Nam nói riêng cũng như ở những người gốc Á nói chung trên thế giới. Các nghiên cứu còn chỉ ra lây truyền HBV ở Việt Nam là lây truyền cả theo chiều ngang và dọc. Lây truyền ngang chủ yếu ở lứa tuổi thanh thiếu niên (14-16 tuổi) chiếm 20,5% [32], do tiêm truyền, phẫu thuật…. 7 lây truyền dọc từ mẹ sang con cũng rất đáng kể. Tỷ lệ trẻ có HBsAg giai đoạn chu sinh ở nông thôn Việt Nam là 12,5%. Tỷ lệ nhiễm HBV hiện tại và nhiễm HBV cũ ở tuổi chu sinh là 19,6% [32]. Như vậy Việt Nam cũng như các nước có lưu hành HBV cao nói chung đều có tỷ lệ lây nhiễm dọc rất lớn. Đường lây này có vai trò quan trọng đến diễn tiến của HBV bởi 85% đến 90% trẻ được sinh ra từ những bà mẹ có HBsAg(+) và HBeAg(+) sẽ chuyển thành nhiễm HBV mạn tính [18]. Qua các nghiên cứu thấy rằng lây nhiễm dọc ở nước ta cao, do nhóm mang HBsAg trong cộng đồng cao nhất nằm trong độ tuổi sinh đẻ [4,12]. Những người này hầu như không có triệu chứng, không được trang bị đầy đủ kiến thức để có thái độ đúng trong phòng chống lây nhiễm HBV cho cộng đồng. Điều này góp phần làm tăng tỷ lệ nhiễm HBV, tăng tỷ lệ người nhiễm HBV mạn và viêm gan. 1.1.2 Lâm sàng và mức độ nguy hiểm của bệnh viêm gan B. Nhiễm HBV tiên phát trên lâm sàng có thể biểu hiện từ mức độ nhẹ đến nặng nhất là thể viêm gan tối cấp. Nhiễm HBV trường diễn thường có hình ảnh mô học bình thường hoặc gần như bình thường, lâm sàng có thể có biểu hiện hội chứng viêm gan mạn tồn tại hoặc viêm gan mạn hoạt động. Hội chứng viêm gan mạn tồn tại ít khi tiến triển nặng, còn viêm gan mạn hoạt động có thể nặng và tiến triển tới xơ gan hoặc ung thư gan nguyên phát. Do vậy trên lâm sàng có thể gặp nhiều biểu hiện khác nhau của nhiễm HBV. 1.1.2.1 Viêm gan B cấp: Thời gian ủ bệnh khoảng 60-110 ngày [39]. Thời kỳ khởi phát (thời kỳ tiền hoàng đảm) dao động từ 2-16 ngày [8]. Các triệu chứng hay gặp là sốt nhẹ, mệt mỏi, tiểu vàng, chán ăn [9]. Thời kỳ toàn phát (thời kỳ hoàng đảm). Trường hợp điển hình thường có tiền triệu: đau đầu, mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ (37,5-390C) khoảng 2-7 ngày trước khi có vàng da. Sau đó có đầy bụng hoặc đau khu trú ở hạ sườn phải (hay gặp), nước tiểu sẫm màu và phân nhạt màu, một số có ngứa nhẹ, có đau khớp [66]. Khi bắt đầu thấy ăn ngon, tiểu nhiều, vàng da vàng mắt giảm dần là bệnh lui. Trẻ nhỏ thường hồi phục sau 8 2 tuần, người lớn sau 4-6 tuần. Tuy nhiên dấu hiệu mệt mỏi, chán ăn có thể còn kéo dài sau nhiều tháng [11]. Nói chung viêm gan B cấp với các biểu hiện lâm sàng không đặc hiệu muốn xác định chắc chắn cần dựa vào các xét nghiệm huyết thanh và chẩn đoán vi rút học. - Xét nghiệm công thức máu: thấy bạch cầu tăng, chủ yếu do tăng lymphocyte. - Có hội chứng huỷ hoại tế bào gan: Transaminase tăng cao dần, tăng ALT (alanine aminotransferase) và AST (aspartate aminotransferase) [41]. - Hội chứng ứ mật: Bilirubin trực tiếp trong máu tăng sớm nhất ngay cả khi bilirubin toàn phần còn bình thường. Trong 10-14 ngày đầu bilirubin toàn phần tăng dần nhưng không quá 17µmol/l sau đó giảm dần. Sau 3 tuần nếu nồng độ bilirubin toàn phần giảm còn dưới 51µmol/l là tiên lượng tốt, nếu không giảm là dấu hiệu bệnh diễn biến nặng và kéo dài [8]. Phosphataza kiềm bình thường hoặc tăng nhẹ. - Hội chứng suy tế bào gan: Tỷ lệ prothrombin giảm, nếu giảm dưới 40% thường là diễn biến kéo dài và tiên lượng không tốt. Albumin, globulin huyết thanh bình thường hoặc hơi tăng trong các thể nhẹ. Thể nặng có albumin giảm và globulin tăng [11]. Các thể lâm sàng của viêm gan B cấp. - Thể không triệu chứng: 80-90% các trường hợp nhiễm HBV. - Thể vàng da thông thường: thời gian ủ bệnh dài (50-100 ngày), có các biểu hiện của thời kỳ khởi phát rồi toàn phát như đã mô tả ở trên. Bệnh khỏi không để lại di chứng. - Các thể đặc biệt (được đặt tên theo những biểu hiện lâm sàng nổi trội nhất bên cạnh những biểu hiện chung): o Thể không vàng da (lâm sàng không có vàng da). o Thể ứ mật. o Thể kéo dài ( biểu hiện lâm sàng kéo dài sau 3-4 tháng). 9 o Thể tái phát. o Thể viêm gan tối cấp: là bệnh do sự kết hợp một bệnh não gan và sự suy tế bào gan. Viêm gan tối cấp là thể nặng nhất, nếu không ghép gan tử vong chiếm 90%. o Thể viêm gan ở phụ nữ có thai: Biểu hiện lâm sàng không có gì đặc biệt nhưng có nguy cơ gây xẩy thai và truyền HBV cho con. o Thể viêm gan ở trẻ em: Các biểu hiện toàn trạng thường rõ ràng. o Thể viêm gan ở người có suy giảm miễn dịch (AIDS, bệnh máu ác tính, hoá trị liệu chống ung thư): Biểu hiện thường không điển hình nhưng nguy cơ chuyển thành viêm gan mạn rất cao [11]. 1.1.2.2 Viêm gan B mạn: Viêm gan mạn tồn tại: Thường không có triệu chứng, đôi khi có mệt mỏi, chán ăn, tức nhẹ hạ sườn phải. Lâm sàng bình thường hoặc gan to nhẹ. Transaminase tăng. Bilirubin, phosphataza kiềm và γ globulin bình thường. Tiên lượng tốt với những tổn thương tồn tại không tiến triển. Tuy nhiên có thể tiến triển thành viêm gan mạn hoạt động đặt biệt khi có sự duy trì nhân lên của vi rút [11]. Viêm gan mạn hoạt động: Biểu hiện lâm sàng có mệt mỏi, đau hạ sườn phải, vàng da, ngứa, gan to vừa, có thể có lách to. Đặc biệt có tăng áp lực tĩnh mạch cửa ngay cả khi không có xơ gan. Xét nghiệm transaminase tăng, ALT tăng, phosphataza kiềm và γ globulin bình thường hoặc tăng nhẹ (trừ trường hợp có ứ mật sẽ tăng cao), bilirubin bình thường hoặc tăng nhẹ. Prothrombin giảm. Tiến triển theo hướng nặng lên, hoặc từng đợt dẫn tới xơ gan sau nhiều năm [11]. Xơ gan: Biểu hiện lâm sàng không phân biệt căn nguyên. Xơ gan là kết quả của kích thích gây viêm liên tục kéo dài hoặc do rối loạn trong cơ chế điều hoà gây nên thể kinh diễn (hình thành u hạt). Nguy cơ dẫn đến ung thư gan nguyên phát rất cao ở nhóm bệnh nhân này. Bệnh nhân cần được kiểm tra bằng cộng hưởng từ, chụp động mạch có cản quang [11]. 10 1.2. Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan B. 1.2.1 Cấu trúc của vi rút viêm gan B. Vi rút viêm gan B là một vi rút có cấu trúc DNA sợi kép, có vỏ thuộc họ Hepadnaviridae. Vi rút lưu hành trong máu dưới 3 dạng hình thể: Hình 1.1: Ba dạng hình thể của HBV trong máu . - Các hạt hình ống nhỏ có kích thước 20-22nm × 40-400nm. - Các hạt hình cầu có đường kính 20-22 nm. - Các hạt hình cầu to có đường kính 42 nm (hình 1.1). Các hạt hình cầu to chính là các hạt vi rút hoàn chỉnh (hạt Dane). Hạt Dane được cấu tạo bởi 3 phần: + Bao ngoài (envelop). + Vỏ trong của hạt vi rút (capsid). + Bộ gen của HBV (genome). 11 Hình 1.2: Cấu trúc hạt vi rút viêm gan B hoàn chỉnh. + Bao ngoài (envelop): được cấu tạo bởi 3 loại protein: ƒ Protein bề mặt nhỏ: Trọng lượng phân tử (TLPT) 25 kilo Dalton. Đây là protein chiếm số lượng nhiều nhất trong thành phần bao ngoài. Đây chính là thành phần chính của HBsAg (kháng nguyên bề mặt) với 5 quyết định kháng nguyên khác nhau: a, d, y, w, r (trong đó a đặc hiệu chung cho nhóm). ƒ Protein bề mặt trung bình: TLPT 29 kilo Dalton, có cấu trúc gồm protein bề mặt nhỏ (HBsAg) và thêm một đoạn có 55 acid amin ( là sản phẩm của Pre-S2). ƒ Protein bề mặt lớn: TLPT 33 kilo Dalton, có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi trung bình và thêm một đoạn có 108 acid amin ( là sản phẩm của Pre-S1). Đây là thành phần quan trọng của hạt vi rút hoàn chỉnh và có tính sinh miễn dịch cao ( hình 1.2). + Vỏ trong của hạt vi rút (capsid): là một khối hình hộp có đường kính 2728 nm, khoảng cách giữa lớp bao ngoài và lớp này là 7 nm. Vỏ được cấu tạo bởi 2 loại polypeptid được gọi là polypeptid lõi và tiền lõi. Polypeptid lõi có TLPT 22 kilo Dalton, chính là kháng nguyên lõi của vi rút được kí 12 hiệu là HBcAg. Polypeptid tiền lõi có TLPT 25 kilo Dalton, có cấu trúc gồm polipeptid lõi và thêm một peptid đơn có 29 acid amin (hình 1.2). Kháng nguyên e (HBeAg) chính là một sản phẩm chuyển hoá của lớp vỏ trong (của polypeptid tiền lõi) [58]. + Chứa trong vỏ của hạt vi rút là bộ gen của HBV (genome). Bộ gen của HBV là một DNA phụ thuộc DNA polymeraza, có 3200 đôi bazơ (hình 1.2).[6*] Ba dạng hình thể lưu hành trong huyết thanh của người nhiễm HBV có thể đứng riêng lẻ hoặc dính lại với nhau, điều này tạo ra những bao ngoài rỗng của vi rút do sự sản xuất dư thừa các protein bề mặt trong quá trình nhân lên của vi rút. Các hạt này có rất nhiều trong huyết thanh ( 106109 hạt / ml) và với tỷ lệ số hạt Dane / HBsAg là khoảng 1/10.000 [51]. 1.2.2. Sự nhân lên của HBV. Sự nhân lên của HBV, cũng giống như nhiều vi rút khác, phải trải qua nhiều bước: (1) Vi rút gắn vào tế bào chủ; (2) Vi rút xâm nhập vào tế bào chủ; (3) Vi rút di chuyển vào nhân; (4) Vi rút phóng thích bộ gen; (5) Thực hiện sao mã và dịch mã; (6) Sao chép bộ gen vi rút; (7) Sự lắp ráp để tạo bộ gen của hạt vi rút; (8) Giải phóng hạt vi rút [4]. Sau khi vào cơ thể HBV sẽ gắn và xâm nhập vào tế bào gan. 24 giờ sau đó DNA của HBV xuất hiện trong nhân của tế bào gan. Khi đó DNA vòng mở được chuyển thành DNA vòng đóng (covalently closed circle DNA (cccDNA). CccDNA tiếp tục làm khuôn mẫu tổng hợp các mRNA của vi rút [59]. Trước khi quá trình sao mã tạo các mRNA kết thúc, các tiền mRNA phải qua một quá trình biến đổi ở ngay trong nhân để tạo các mRNA hoạt động. Trong quá trình nhân lên bình thường, DNA của vi rút không liên kết với cấu trúc gen của vật chủ. Kết quả là tạo ra một loạt các mRNA với kích thước khác nhau. Các mRNA hoạt động này có khả năng tham gia dịch mã để tạo các protein là các vật liệu để lắp ráp tạo các hạt vi rút hoàn chỉnh. Sau khi dịch mã một lượng đủ HBc protein và ít nhất với một phân tử polymerase để tạo thành hạt lõi. Lõi vi rút trưởng thành được bao bọc trong các protein HBsAg tại hệ thống lưới nội bào sau đó được giải phóng ra khỏi tế bào (hình 1.3). 13 Hình 1.3: Quá trình nhân lên của vi rút viêm gan B Trong các mRNA được tạo ra chỉ có mRNA tiền genome 3,5 kb là khuôn mẫu cho quá trình dịch mã để tổng hợp phân tử DNA vòng mở. Các DNA vừa được tổng hợp này có thể vào nhân và tạo các cccDNA mới trong nhân, như vậy vi rút liên tục được nhân lên. HBsAg có tác dụng ức chế quá trình tạo cccDNA nên HBsAg là tác nhân điều hoà ngược âm tính quá trình nhân lên của vi rút. Như vậy khác đa số các vi rút, HBV cho phép DNA của vi rút mới được tổng hợp từ dịch bào tương có thể tiếp tục quay lại nhân để làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp tiếp theo [6]. 1.2.3. Các phương thức lây truyền của HBV. HBV được lây truyền khi bề mặt da và niêm mạc có các thương tổn tiếp xúc với máu có nhiễm vi rút, hay với các dịch tiết của cơ thể. Thông thường máu là nơi có nồng độ vi rút cao nhất, nồng độ vi rút trong các dịch tiết của cơ thể thường thấp. 14 Vi rút viêm gan B không lây truyền trong không khí, qua thức ăn, nước uống. Mà theo 3 phương thức lây truyền chính : • Từ mẹ sang con. • Do tiêm truyền. • Qua đường tình dục. 1.2.3.1. Lây truyền từ mẹ sang con: Lây truyền vi rút từ mẹ sang con là một đường lây quan trọng. Có 3 thời điểm đó là: lây truyền trong tử cung; lây truyền khi chuyển dạ và đẻ; và lây truyền do tiếp xúc trong thời gian ngắn sau đẻ. Các phụ nữ mang thai, mang vi rút viêm gan B hầu hết ở giai đoạn không triệu chứng nên họ không biết tình trạng nhiễm vi rút của bản thân (trừ khi họ được xét nghiệm tìm HBsAg) vì vậy nguy cơ lây truyền cho con lớn. Trẻ nhỏ là lứa tuổi mà sự đáp ứng miễn dịch chưa hoàn chỉnh, nếu bị nhiễm vi rút ở lứa tuổi này sẽ làm tăng khả năng nhiễm vi rút kéo dài và làm tăng tỷ lệ mang vi rút mạn tính trong cộng đồng. Các bà mẹ có đồng thời cả HBsAg(+) và HBeAg(+) hoặc mẹ nhiễm HBV cấp tính ở giai đoạn cuối của thai kỳ có tải lượng vi rút cao trong máu, có khả năng truyền vi rút cho các con của họ tới 85%-90% [28]. Trẻ sinh ra từ các bà mẹ này dễ trở thành người mang HBV mạn tính. 1.2.3.2. Lây qua đường tiêm truyền: Truyền máu và sử dụng các chế phẩm từ máu không qua sàng lọc HBsAg chính là nguồn lây nhiễm vi rút viêm gan B [50]. Dùng chung bơm kim tiêm khi tiêm chích ma tuý đường tĩnh mạch cũng là một phương thức lây truyền vi rút thường gặp. Các loại dụng cụ không tiệt trùng: Dụng cụ phẫu thuật, nha khoa, bơm kim tiêm, kim chích, kim châm cứu, dụng cụ xăm mình, xỏ lỗ tai, dao cạo râu… đều là những yếu tố gây lây truyền vi rút viêm gan B [40]. 1.2.3.3. Lây qua đường tình dục: Lây truyền qua đường tình dục là người bị nhiễm HBV từ bạn tình mang HBV cấp tính hay mạn tính [29]. Nguyên nhân do trong nước bọt, tinh dịch, dịch tiết âm đạo,… của những người mang vi rút viêm gan B có 15 HBsAg. Ở Bắc Âu và Tây Âu lây truyền qua đường tình dục chiếm 80-85% trong các lây nhiễm HBV ở trẻ vị thành niên và người lớn [36,65]. 1.3. Vai trò của các đoạn gen trong bộ gen của HBV. HBV là vi rút có DNA nhỏ nhất được biết đến, cấu trúc genom chỉ có 3200 đôi bazơ và tổ chức dưới dạng vòng đặc biệt. Phân tử DNA này không xoắn hai vòng mà chỉ xoắn ở đoạn cuối và xếp thành hình vòng tròn gồm hai sợi: một sợi ngắn (gọi là sợi dương của vi rút) và một sợi dài (là sợi âm). o Sợi dương của vi rút ngắn hơn, chiếm khoảng 50-80% chiều dài của sợi âm. Sợi dương có chiều dài thay đổi . o Sợi âm DNA là một vòng hoàn chỉnh có bốn khung đọc mở ( ORF: Open Reading Flame) chứa các gen mã hóa đan xen nhau là: ORF S gen tiền S1, gen tiền S2 và S, ORF C - gen tiền lõi (pre-core) hoặc lõi (core), ORF X - gen X và ORF P – gen polymeraza (hình 1.4). Hình 1.4: Bộ gen của vi rút viêm gan B o Có bốn RNA thông tin có chức năng được biết đến trong quá trình sao mã và dịch mã của HBV. Đoạn dài nhất (3,5 kb) làm khuôn cho quá trình nhân lên của genome và tổng hợp ra các protein HBc/HBe và 16 polymeraza. Đoạn 2,4 kb mã hoá protein tiền S1, tiền S2 và HBsAg (LHBs). Đoạn 2,1 kb mã hoá protein tiền S2 và HBsAg ( MHBs/SHBs). Đoạn ngắn nhất (0,8 kb) mã hoá protein X [57]. o HBcAg và HBeAg được phiên mã từ một gen chung (đoạn dài nhất 3,5 kb). Trong quá trình sao chép, HBcAg khi đến lưới nội bào liền bị cắt rời và HBeAg được tạo ra từ đoạn tiền lõi và lõi. HBcAg có chức năng chủ yếu trong việc tạo nên thành phần liên kết của nucleocapsit tạo ra lớp vỏ trong của vi rút. o Polypeptid polymeraza phiên mã từ RNA tiền genome có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của vi rút, đặc biệt là chuỗi âm của phân tử DNA. o Protein X, được mã hoá từ RNA nhỏ nhất (0,7kb), được cho là có vai trò trong quá trình nhiễm trùng tự nhiên của vi rút, nhưng cho đến nay còn chưa rõ ràng. o Các gen S và tiền S mã hoá lớp vỏ vi rút. Các protein tạo nên các hạt HBsAg. Các gen tiền S2 và S (mã hoá cho protein bề mặt trung bình MHBs), gen tiền S1 tiền S2 và S ( mã hoá cho protein bề mặt lớn LHBs), protein tiền S1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình kết hợp của HBV vào tế bào gan [54]. 1.4. Các dấu ấn huyết thanh của HBV. 1.4.1 Kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) và anti-HBs. Kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) được sản xuất trong bào tương của tế bào gan và xuất hiện chủ yếu trong huyết thanh cũng như trên màng tế bào gan với nồng độ đôi khi rất lớn [4,19], nhưng không có trong nhân tế bào gan [10,20]. HBsAg là dấu ấn huyết thanh cho thấy tình trạng nhiễm HBV của cơ thể. HBsAg có thể được xác định nhờ hai kỹ thuật: Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIAs) và kỹ thuật miễn dịch enzym (EIAs). HBsAg xuất hiện sớm nhất trong huyết thanh bệnh nhân, chỉ một đến mười tuần sau khi có phơi nhiễm với HBV, và còn có thể thấy ở giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh, trước khi men transaminaza trong máu tăng cao và trước khi vàng da từ một tuần đến một tháng [23b]. Khi bắt đầu có dấu hiệu lâm sàng là lúc nồng độ HBsAg đạt đỉnh cao nhất, 4-8 tuần sau đó nồng độ