Tài liệu Tìm hiểu ảnh hưởng của ba và naa lên sự tạo chồi và rễ trong nuôi cấy in vitro cây cẩm chướng dianthus telstar purple picotee

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ NHẪM TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ RỄ TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO CÂY CẨM CHƯỚNG DIANTHUS ‘TELSTAR PURPLE PICOTEE’ Chuyên ngành: Sinh lý thực vật Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN DU SANH Tp. HCM, năm 2011 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, với lòng biết ơn sâu sắc em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: • Cố GS. TS. Mai Trần Ngọc Tiếng, người thầy đã sáng lập nên Bộ môn Sinh lý Thực vật cho em có cơ hội được học tập chuyên ngành này. • Thầy TS. Nguyễn Du Sanh, người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu, quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. • Thầy PGS. TS. Bùi Trang Việt, cô PGS. TS. Võ Thị Bạch Mai, cô PGS. TS Trương Thị Đẹp, thầy PGS.TS. Nguyễn Minh Châu, cô PGS.TS. Nguyễn thị Quỳnh, thầy TS. Nguyễn Hữu Hổ, cô TS. Lê Thị Thủy Tiên đã giảng dạy cho em những kiến thức quý báu. • Qúy thầy cô ở Bộ môn Sinh lý Thực vật: cô TS. Trần Thanh Hương, thầy Th.s Phan Ngô Hoang, thầy Th.s Đỗ Thường Kiệt, cô Th.s Trịnh Cẩm Tú, cô Th.s Trần Thị Thanh Hiền đã luôn chỉ dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và làm luận văn. • Các bạn cùng học cao học khóa 19 đã bên cạnh, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và làm luận văn. Cảm ơn em Phước đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn. • Cảm ơn các anh chị ở Trạm thực nghiệm Huấn luyện & Thực nghiệm Nông nghiệp-Trung tâm Khuyến nông Tp. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và làm luận văn. • Con xin cảm ơn cha mẹ và gia đình đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con học tập và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011. Vũ Thị Nhẫm MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... viii DANH MỤC CÁC ẢNH .............................................................................................. ix MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 2 1.1. Giới thiệu về cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ ....................... 2 1.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................................ 2 1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố ....................................................................... 2 1.1.3. Một số kết quả nghiên cứu về cây cẩm chướng Dianthus ............................. 3 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật............................................................................ 5 1.2.1. Định nghĩa ...................................................................................................... 5 1.2.2. Phát sinh cơ quan trực tiếp ............................................................................. 6 1.2.2.1. Sự hình thành chồi ngọn và chồi nách ............................................... 6 1.2.2.2. Sự hình thành chồi bất định ............................................................... 6 1.2.2.3. Sự hình thành rễ bất định ................................................................... 7 1.2.3. Phát sinh cơ quan gián tiếp ............................................................................ 8 1.2.3.1. Sự tạo mô sẹo ................................................................................... 8 1.2.3.2. Sự hình thành chồi và rễ gián tiếp ..................................................... 9 1.2.2. Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ..................................... 10 1.2.2.1. Auxin ............................................................................................... 10 1.2.2.2. Cytokinin ......................................................................................... 12 1.2.2.3. Sự tương tác giữa auxin và cytokinin............................................. 13 1.2.2.4. Giberelin .......................................................................................... 15 1.2.2.5. Acid abscisic.................................................................................... 16 1.2.2.6. Etylen............................................................................................... 17 1.2.2.7. Nước dừa ......................................................................................... 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 19 2.1. Vật liệu .................................................................................................................. 19 2.1.1.Vật liệu nuôi cấy .......................................................................................... 19 2.1.2.Vật liệu làm sinh trắc nghiệm...................................................................... 20 2.1.3. Điều kiện thí nghiệm .................................................................................. 20 2.2. Phương pháp.......................................................................................................... 20 2.2.1. Khử trùng hột.............................................................................................. 20 2.2.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo ............................................................................... 21 2.2.3. Khảo sát sự tạo chồi ................................................................................... 22 3.2.3.1. Tạo chồi từ mô sẹo......................................................................... 22 3.2.3.2. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ ...................................... 23 3.2.3.3. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh ..................................... 24 2.2.4. Khảo sát sự tạo rễ ....................................................................................... 25 2.2.4.1. Tạo rễ từ mô sẹo ............................................................................. 25 2.2.4.2. Tạo rễ từ lá ..................................................................................... 25 2.2.4.3. Tạo rễ từ chồi in-vitro ..................................................................... 25 2.2.5. Đưa cây ra vườn ươm ................................................................................ 26 2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu....................................................................... 26 2.2.7. Đo cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh ......................................................................................................... 26 2.2.8. Xử lý thống kê............................................................................................ 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả .................................................................................................................. 30 3.1.1. Khử trùng hột ............................................................................................. 30 3.1.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo .............................................................................. 30 3.1.2.1. Tạo mô sẹo từ lá .............................................................................. 30 3.1.2.2. Tạo mô sẹo từ lá mầm ..................................................................... 34 3.1.2.3. Tạo mô sẹo từ khúc cắt trụ hạ diệp ................................................. 36 3.1.3. Khảo sát sự tạo chồi ................................................................................... 37 3.1.3.1. Tạo chồi từ mô sẹo lá ...................................................................... 37 3.1.3.2. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ ....................................... 39 3.1.3.3. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh ...................................... 44 3.1.4. Khảo sát sự tạo rễ ....................................................................................... 46 3.1.4.1. Tạo rễ từ mô sẹo ............................................................................. 46 3.1.4.2. Tạo rễ từ lá ...................................................................................... 47 3.1.4.3. Tạo rễ từ chồi in-vitro ..................................................................... 49 3.1.5. Đưa cây ra vườn ươm ................................................................................ 50 3.1.6. Quan sát hình thái giải phẫu....................................................................... 51 3.1.6.1. Quan sát hình thái giải phẫu trong quá trình tạo mô sẹo từ lá........ 51 3.1.6.2. Quan sát hình thái giải phẫu trong quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo lá ............................................................................................... 52 3.1.6.3. Quan sát hình thái giải phẫu trong quá trình tạo rễ từ mô sẹo lá ... 53 3.1.6.4. Quan sát hình thái giải phẫu trong quá trình tạo rễ trực tiếp từ lá . 53 3.1.6.5. Quan sát hình thái giải phẫu sự tạo rễ trực tiếp từ chồi in-vitro..... 55 3.1.7. Cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh ........................................................................................................... 56 3.1.7.1. Cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh trong sự hình thành mô sẹo ......................................... 56 3.1.7.2. Cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh trong sự hình thành chồi từ mô sẹo............................. 56 3.1.7.3. Cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh trong sự tạo rễ từ mô sẹo ............................................ 57 3.2. THẢO LUẬN ....................................................................................................... 59 3.2.1. Sự thay đổi hình thái và sinh lý trong sự hình thành mô sẹo cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ .................................................................... 59 3.2.2. Sự thay đổi hình thái và sinh lý trong sự tạo chồi cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ .................................................................................... 63 3.2.3. Sự thay đổi hình thái và sinh lý trong sự tạo rễ cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ .................................................................................... 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 69 4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................... 69 4.2. ĐỀ NGHỊ.............................................................................................................. 69 CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 1,4-Dichlorophenoxy-acetic acid ABA : Abcisic acid BA : Benzyl adenin GA3 : Acid giberelic IAA : Indol-3-acetic acid IBA : Indol butyric acid MS : Murashige & Skoog NAA : α-naphthalen acetic acid TLT : Trọng lượng tươi cs : Cộng sự ND : Nước dừa DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo mô sẹo của lá, lá mầm, khúc cắt trụ hạ diệp cây mầm cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi ....................................................................................................... 21 Bảng 2.2. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi .................................................................................... 22 Bảng 2.3. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ ........................................................... 23 Bảng 2.4. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh .......................................................... 24 Bảng 2.5. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi .......................................................................................... 25 Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hột với Javel ở các nồng độ khác nhau......................... 30 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá cẩm chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian nuôi cấy ... ..................................................................................................................... 31 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá mầm cẩm chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian nuôi cấy........................................................................................................ 34 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi trên các môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy .................................... 37 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái khúc cắt thân mang chồi ngủ theo thời gian nuôi cấy ................................................................. 39 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................... 43 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................................. 44 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi trên các môi trường khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy ......................................................... 46 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ từ lá trên các môi trường khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy ...................................................................................... 47 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ từ chồi in-vitro trên các môi trường khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy ..................................................................... 49 Bảng 3.11. Cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh trong sự hình thành mô sẹo trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) theo thời gian ................................................... 56 Bảng 3.12. Cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mô sẹo lá 3 tuần tuổi trên môi trường tạo chồi MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) sau 1 tuần nuôi cấy ....................................................................... 57 Bảng 3.12. Cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mô sẹo lá 3 tuần tuổi trên môi trường tạo rễ MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2) sau 1 tuần nuôi cấy ...................................................................................... 58 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Sự tương tác giữa auxin và cytokinin đối với phát sinh hình thái .................. 14 Hình 2 : Sơ đồ ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật .................................... 29 Hình 3: Sơ đồ nhân giống in-vitro cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ ... ...................................................................................................................................... 68 DANH MỤC CÁC ẢNH Ảnh 1: Cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’............................................ 3 Ảnh 2: Hột cẩm chướng (A), cây cẩm chướng in-vitro 1 tuần tuổi (B), cây cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi (C, D) nẩy mầm từ hột ....................................... 19 Ảnh 3: Sự thay đổi hình thái lá sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau................................................................................... 32 Ảnh 4: Sự thay đổi hình thái lá mầm sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau..................................................................... 35 Ảnh 5: Khúc cắt trụ hạ diệp sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2) .................................................................. 36 Ảnh 6: Tái sinh chồi từ mô sẹo lá sau 1 tuần (A), sau 2 tuần (B), sau 4 tuần (C) nuôi cấy trên môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) ............................ 38 Ảnh 7: Sự hình thành chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ sau 4 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau ...................................... 41 Ảnh 8: Sự hình thành chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh sau 4 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau ...................................... 45 Ảnh 9: Tạo rễ trực tiếp từ lá sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½ (A), MS½+ NAA 0,1 mg/l (B), MS½+ NAA 0,2 mg/l (C), MS½+ NAA 0,5 mg/l (D), MS½+ NAA 1 mg/l (E) .................................................................................. 48 Ảnh 10: Cây con in-vitro chuẩn chuẩn bị đưa ra vườn ươm (A), cây cẩm chướng invitro trồng trong vườn ươm sau 20 ngày (B), ra hoa sau 45 ngày (C) .......... 50 Ảnh 11: Cắt ngang lá ở ngày 0 (A), lá gia tăng kích sau 1 tuần nuôi cấy (B), mô sẹo hình thành từ lá sau 2 tuần nuôi cấy (C) trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) .................................................................. 51 Ảnh 12: Mô sẹo đang phân chia ở ngày thứ 2 nuôi cấy trên môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3)................................................................................. 52 Ảnh 13: Sơ khởi chồi (A) ở ngày thứ 5, chồi phát triển (B) ở ngày thứ 7 trên môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) ................................................. 52 Ảnh 14: Mô sẹo ở ngày thứ 2 (A), sơ khởi rễ ở ngày thứ 5 (B), sơ khởi rễ kéo dài (C, D) ở ngày thứ 7 trên môi trường MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2) .................. 53 Ảnh 15: Vùng gân lá ở ngày 0 ..................................................................................... 54 Ảnh 16: Cắt ngang lá sau 3 ngày trên môi trường MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2)........... 54 Ảnh 17: Sơ khởi rễ ở ngày thứ 5 (A), sơ khởi rễ kéo dài (B) sau 1 tuần trên môi trường MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2) ................................................................. 54 Ảnh 18: Thân chồi ở ngày 0 (A), sơ khởi rễ và rễ kéo dài sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½ + 0,2 mg/l NAA (B) .......................................................... 55 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nghề trồng hoa kiểng tại thành phố Hồ Chí Minh cũng như các tỉnh khác trong cả nước đang phát triển rất mạnh. Trồng hoa kiểng là một thú vui tao nhã đã có từ lâu đời, để trang trí nhà cửa, tạo cảnh đẹp, giúp cho tinh thần thư thái, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống. Để đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa kiểng ngày càng cao, hiện nay đã có nhiều giống hoa kiểng đẹp, mới lạ được du nhập vào nước ta, trong đó có giống cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’, có nguồn gốc từ Mỹ. Đây là một giống cây lai giữa hai loài Dianthus barbatus L. và Dianthus chinensis L., được giới thiệu rộng rãi trên các trang mạng và sử dụng chủ yếu làm cây kiểng trang trí, do có hoa đẹp và thích nghi được với điều kiện khí hậu ôn đới cũng như nhiệt đới. Tuy nhiên, giá thành hạt giống cao nên chưa được trồng phổ biến ở nước ta. Xuất phát từ nhu cầu thực tế về cung cấp nguồn giống giá rẻ, chất lượng tốt phục vụ cho nhu cầu hoa cây kiểng của nước ta. Đề tài “Tìm hiểu ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tạo chồi và rễ trong nuôi cấy in-vitro cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ ” được thực hiện nhằm mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của hai chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô là BA và NAA lên quá trình tạo chồi và rễ trực tiếp từ cơ quan và gián tiếp thông qua mô sẹo, cũng như một số biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi và rễ để tạo ra số lượng lớn cây con khỏe mạnh, đồng nhất, phục vụ cho nhu cầu sản xuất cây giống của thành phố và làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về đối tượng này. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 1.1.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Caryophyllales Họ: Caryophyllaceae Chi : Dianthus Tên thực vật: Dianthus ‘telstar purple picotee’ Tên tiếng Anh: Dianthus Telstar Purple Picotee 1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố Cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ là cây thân thảo mọc hơi bò ở phần gốc và thẳng đứng ở ngọn, thân có tiết diện tròn, nhẵn, cao 25-30cm, có đốt ngắn, hơi phình rộng chỗ mọc lá và có 1 đường sọc dọc trên thân. Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục, đầu nhọn, dài 3-3,5cm, rộng 0,8-1cm, màu xanh đậm. Bẹ lá ngắn khoảng 2mm, hình lòng máng ôm lấy thân, không có cuống. Hoa đơn độc hay mọc thành dạng xim ngắn trên đầu ngọn cây, rộng 2,5-3 cm, mùi thơm nhẹ. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; tổng bao lá bắc gồm 4 lá bắc hợp thành; 2 lá bắc con giống lá thường nhưng nhỏ hơn lá thường; 5 lá đài dính nhau bên dưới thành hình ống, dài 1cm, phía trên chia 5 thùy hình tam giác, màu xanh; 5 cánh hoa đều, rời chia thành 2 phần: phần móng hẹp màu xanh lục nhạt, dài 1cm; phần phiến mỏng hình quạt, màu tím đỏ viền vòng ngoài màu trắng, bìa phiến hoa chia thành những đầu nhọn hình tam giác. 10 nhị đều rời đính trên đế hoa thành 1 vòng, chỉ nhị hình sợi, màu trắng. Bầu noãn thượng, hình trụ cao 0,8 cm, màu xanh lục nhạt; vòi nhụy chia làm 2 từ đỉnh bầu, dài 1,5cm màu trắng. 3 Đây là cây lai tạo có nguồn gốc xuất xứ từ Mỹ và được trồng bằng hột, là cây ôn đới nhưng thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới ẩm ướt và nóng, phát triển rất tốt khi trồng trong vườn, ra hoa quanh năm, thời gian trồng đến khi bắt đầu ra hoa là 30-35 ngày. Ảnh 1: Cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 1.1.3. Một số kết quả nghiên cứu về cây cẩm chướng Dianthus Trong quá trình tham khảo tài liệu, chưa thấy công bố nghiên cứu nào về cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’. Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu tập trung chủ yếu về nhân giống một số loài Dianthus như Dianthus caryophyllus, D. barbatus, D. chinensis, D. henteri. Trong đó, D. caryophyllus được nghiên cứu nhiều nhất. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý ethymethane sulphonate (EMS) in-vitro đối với cây cẩm chướng Dianthus caryophylus thấy rằng nồng độ EMS càng cao, thời gian xử lý mẫu càng dài thì tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi càng giảm. Xử lý EMS đã làm tăng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm chướng nuôi cấy in- vitro từ 5,1 đến 22,7 lần so với đối chứng. Nồng độ và thời gian xử lý thích hợp là 0,4% EMS trong thời gian 2 giờ (Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2009). Nghiên cứu phát sinh phôi soma và tái sinh cây Dianthus caryophyllus ghi nhận phôi soma chỉ được thành lập từ mô sẹo cánh hoa còn các mô sẹo có nguồn 4 gốc từ đài hoa, đế hoa và lá non (lá thứ 2 và thứ 3 của chồi đỉnh) thì không tạo phôi soma. Mô sẹo tạo ra trên môi trường MS + 2 mg/l 2,4-D + 0,2 mg/l BA + 9% sucrose sẽ tạo được phôi soma khi chuyển qua môi trường MS không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật hoặc có bổ sung 2,4-D ở nồng độ thấp 0,2-0,4 mg/l, và 8085% phôi soma nẩy mầm phát triển thành cây con bình thường khi nuôi trên môi trường MS½ + 3% sucrose (Karami, 2008) Nghiên cứu nhân giống in-vitro từ mô phân sinh chồi đỉnh và mô phân sinh chồi ngủ của cây cẩm chướng Dianthus caryophyllus ghi nhận môi trường MS + 4 mg/l BA đáp ứng hình thành chồi sau 6 ngày nuôi cấy đối với mô phân sinh chồi đỉnh và sau 7 ngày nuôi cấy đối với mô phân sinh chồi ngủ. Môi trường nhân chồi thích hợp nhất là MS + 1 mg/l BA cho số chồi nhiều nhất, đã tạo được 25,2 chồi trong 16,2 ngày nuôi cấy, còn môi trường tạo rễ thích hợp nhất là MS +1 mg/l NAA đã tạo được 9,6 rễ trong 8 ngày nuôi cấy (Ali và cs, 2008), và một nghiên cứu khác khi nhân giống in-vitro từ mô phân sinh chồi đỉnh của cây cẩm chướng Dianthus caryophyllus cũng ghi nhận môi trường MS + 1 mg/l BA hay 1 mg/l kinetin thích hợp nhất cho việc nhân nhanh chồi, còn môi trường MS + 0,5 mg/l NAA thích hợp nhất cho việc tạo rễ (Danial và cs, 2009). Nghiên cứu nhân giống một số loài Dianthus (Dianthus caryophyllus, D. chinensis, D. barbatus) từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh và khúc cắt thân mang chồi ngủ ghi nhận môi trường nhân chồi tốt nhất là MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BA đã tạo được 10-15 chồi sau 4 tuần nuôi cấy (Pareek và cs, 2004). Nghiên cứu về ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in-vitro cây cẩm chướng Dianthus henteri ghi nhận môi trường nhân chồi tốt nhất là MS +0,1 mg/l NAA + 1 mg/l BA, còn môi trường tạo rễ tốt nhất là MS + 1 mg/l NAA + 0,1 mg/l BA (Cristea và cs, 2010). Nghiên cứu về hiện tượng thủy tinh thể trong nuôi cấy in-vitro đối với của cây cẩm chướng Dianthus caryophyllus trên hai giống trồng Eskimo Mogr và Innover Orange Bogr, ghi nhận khi tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì số chồi tăng đồng thời tỷ lệ chồi bị thủy tinh thể cũng tăng. Số chồi đạt được 5 nhiều nhất khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 4 mg/l BA, nhưng tỷ lệ chồi bị thủy tinh thể rất cao, ở giống Eskimo Mogr là 84,2% và ở giống Innover Orange Bogr là 78,5% chồi bị thủy tinh thể. Môi trường thích hợp nhất để nhân chồi là MS + 2 mg/l BA (Kharrazi và cs, 2011). 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1. Định nghĩa Phát sinh hình thái thực vật được hiểu một cách tổng quát là sự phát triển của tế bào, mô và cơ quan thực vật theo thời gian, từ lúc khởi đầu đến lúc trưởng thành, để hoàn tất chu trình phát triển, bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh cơ quan (organogenesis), phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000) Phát sinh hình thái thực vật nghiên cứu hình dáng bên ngoài và cấu trúc bên trong của một thực vật. Nhiều nhà sinh lý học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc thực vật mà cần phải tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trong các biến đổi hình thái và cấu trúc. Sự phát sinh hình thái tùy thuộc vào hai quá trình căn bản: điều hòa hướng kéo dài và kiểm soát mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thể của cơ quan và cơ thể thực vật. Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện tới nguồn gốc và sự phát triển hình thái thực vật, nên không có một kỹ thuật hay phương pháp nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Tất cả các kỹ thuật từ nhiều lãnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng nhất là sự cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó, và sự nuôi cấy trong điều kiện vô trùng có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể thực vật. Các nghiên cứu sinh lý học trực tiếp trên mô phân sinh thường khó tiến hành do kích thước mô phân sinh quá bé nhỏ, nên sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh nghiên cứu các sự kiện phát sinh hình thái trên những cơ quan tách rời, đặc biệt là trong các thí nghiệm in-vitro được sử dụng 6 phổ biến, đã cung cấp nhiều thông tin quan trọng cho sự hiểu biết về phát sinh hình thái (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in-vitro có thể phát sinh trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua giai đoạn tạo mô sẹo hay phôi vô tính, tùy thuộc vào nguồn gốc của mẫu cấy, loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy và nồng độ của chúng. 1.2.2. Phát sinh cơ quan trực tiếp Phát sinh cơ quan trực tiếp là sự tạo chồi và rễ trực tiếp từ mẫu cấy mà không qua giai đoạn tạo mô sẹo . 1.2.2.1. Sự hình thành chồi ngọn và chồi nách Chồi hiện diện ở các ngọn thân hay nhánh (chồi ngọn) hay ở nách lá (chồi nách), được tạo bởi mô phân sinh ngọn chồi và các phác thể lá xếp chồng lên nhau. Sự phát sinh chồi bao gồm sự tổ chức của một mô phân sinh ngọn chồi, sự kéo dài và sự phân hóa các mô (Bùi Trang Việt, 2000). Các chồi nách thường bị cản phát triển do hiện tượng ưu tính ngọn, các chồi này sẽ phát triển khi hiện tượng ưu tính ngọn được gỡ, người ta có thể chích BA hay kinetin vào gốc một chồi nách sẽ hạn chế tác động của auxin từ trên đi xuống và giúp sự tăng trưởng của chồi này (Bùi Trang Việt, 1998). Trong nuôi cấy in-vitro, người ta có thể kích thích chôi nách tạo thành cụm chồi bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở nồng độ thích hợp. Ví dụ như ở cây Nyctanthes arbortristic, mô phân sinh chồi nách nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l BA, 50 mg/l adenine sulfate và 0,1 mg/l IAA đã tạo được 6,65 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy (Rout và cs, 2007). 1.2.2.2. Sự hình thành chồi bất định Sự phát sinh chồi trực tiếp cũng xuất hiện ở những cơ quan như thân, lá, đó là những chồi bất định. Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên hệ với sinh mô chóp mà còn xuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe - mộc hoặc ngoài biểu bì, 7 như vậy chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hay ngoại sinh do sự khử phân hóa của các tế bào trưởng thành dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Quá trình hình thành chồi bất định cũng được khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế bào giống như sinh mô chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân. Tuy nhiên, chồi thường được cảm ứng và tạo thành ở vùng ngoại vi nên thường được xem là có nguồn gốc ngoại sinh (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Bằng thực nghiệm nuôi cấy in-vitro đã tạo được chồi bất định từ mẫu cấy lá cây dầu mè Jatropha curcas khi nuôi trên môi trường có bổ sung 1 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l kinetin, và 100% mẫu cấy được cảm ứng phát sinh chồi trực tiếp từ rìa các vết cắt của mẫu cấy lá (Bùi Thế Vinh và cs, 2011) Chồi bất định có thể phát sinh từ tế bào biểu bì, mô giậu, mô khuyết hay vùng mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động. Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách gỡ ưu tính ngọn hoặc trên mô cấy nhờ môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp. Quá trình tái hoạt động trải qua hai giai đoạn: giai đoạn khử phân hóa và giai đoạn tái phân hóa. Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ cấp, sau đó từ trạng thái mô phân sinh thứ cấp chuyển sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Tế bào có thể tích nhỏ, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to. Trong giai đoạn tái phân hóa, tế bào trở lại trạng thái mô phân sinh thứ cấp (Bùi Trang Việt, 2003). 1.2.2.3. Sự hình thành rễ bất định Rễ bất định là những rễ rất thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều vùng trên cơ thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá thực vật cấp thấp nhưng có mạch, đơn tử diệp hay song tử diệp nào nhân giống bằng giò, dây leo, thủy thực vật hoặc những thực vật sống bám vào cây chủ (Võ Thị Bạch Mai, 2004). 8 Sự hình thành rễ bất định gồm ít ra là hai giai đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi (Mai Trần Ngọc Tiếng và cs, 1980) giai đoạn tạo ra sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc hoặc chu luân, các tế bào này trở lại trạng thái phôi, bắt đầu phân chia theo cách của các tế bào mô phân sinh ngọn, để tạo sơ khởi rễ, giai đoạn này được khởi phát bởi auxin ở nồng độ cao, auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng đồng thời giúp sự phân hóa của các mô dẫn. Giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ được kích thích bởi auxin ở nồng độ thấp. Rễ bất định thường phát sinh theo kiểu nội sinh, cũng có trường hợp phát sinh theo kiểu ngoại sinh. Trong trường hợp kiểu nội sinh, sơ khởi rễ thường xảy ra ở vùng lân cận của các mô mạch dẫn đang phân hóa của cơ quan tạo ra chúng. Các tế bào tạo ra sơ khởi rễ được hình thành từ tế bào mô mềm giữa các bó mạch, tia mạch, tầng phát sinh (Megre và cs, 2007). Nguồn gốc của các rễ bất định được khởi sinh ở vùng gần mạch, vùng tia mạch hoặc tầng phát sinh làm cho rễ mới tạo ra gần gũi với cả mộc và libe của mô mẹ, làm dễ dàng cho việc thiết lập đường nối mạch giữa hai cơ quan này. Trường hợp rễ phát sinh kiểu ngoại sinh, các sơ khởi rễ thường xuất phát từ các tế bào vùng biểu bì hay vùng dưới biểu bì. Sự phát sinh của rễ bất định dưới ảnh hưởng của nhiểu yếu tố như auxin, glucose, ánh sáng…, trong đó auxin có vai trò quan trọng (Phạm Hoàng Hộ, 1972). 1.2.3. Phát sinh cơ quan gián tiếp Phát sinh cơ quan gián tiếp là sự tạo chồi và rễ gián tiếp qua giai đoạn tạo mô sẹo. 1.2.3.1. Sự tạo mô sẹo Mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Sự tạo mô sẹo liên quan đến tình trạng sinh lý của mô cấy, liên quan đến việc sử dụng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ của auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Ví dụ, như ở cây gỗ rừng Eurycoma longifolia, mẫu cấy thân cây mầm có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất so với các mẫu cấy khác như lá, cuống lá, lá mầm, rễ. Ở cây Saccharum officinarum, 2,4-D có khả năng hình thành