Đề tài tiểu luận: Ứng dụng các kỹ
thuật array trong lĩnh vực môi trường
Mở đầu
PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY
1. Lịch sử ra đời
2. Kỹ thuật DNA array
2.1 Cấu trúc và chức năng của DNA array
2.2 Quá trình thực hiện DNA array
2.2.1 Chế tạo mảng
2.2.2 Tiến hành thí nghiệm
3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi
trường
PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG
QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG
1. Các cải tiến loại một
1.1 Cải tiến mẫu dò
1.2 Cải tiến mảng
2. Các cải tiến loại hai
2.1 PNA array
2.2 Nanowire array
2.3 Peptide array
2.4 Glycan array
2.5 Array hoá học (Chemical array)
2.6 Protein array
PHẦN III_ KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY
1. Lịch sử ra đời
Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA array vì kỹ thuật này tương đối mới và
thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên có thể kể đến các mô tả đầu tiên về cấu
trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy có thể tách DNA thành hai mạch
đơn (biến tính) khi xử lý nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty
mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai
phân tử. Các nghiên cứu này gợi ra cách phân tích axit nucleotide dựa trên mối liên
hệ trình tự giữa chúng và các phương pháp lai phân tử phát triển nhanh chóng. [1]
Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson tìm ra phương pháp
lai in situ (sau này kết hợp với mẫu dò đánh dấu huỳnh quang gọi là FISH).
Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính, sao cho DNA tạo
thành mạch kép với mẫu dò, ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính
trong phương pháp microarray. Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển,
cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. [1]
Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một
màng lọc theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự
(1979) đưa ra. Trong kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên giá thể và lai
với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989)
đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên
màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên
với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos
(1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được
Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu để phân tích nhiều loại mẫu dò với
phương pháp FISH. Hiện nay, phương pháp này được sử dụng để phân tích so sánh
mRNA từ những nguồn khác nhau. [1]
Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng
hợp in situ. Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách
dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể giúp tăng tốc độ quá trình, giảm sai sót
chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và
tăng tính chính xác vị trí. [1]
Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Kỹ
thuật này phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR
không thể thiếu trong sinh học hiện nay.
2. Kỹ thuật DNA array
DNA microarray đầu tiên được thiết kế khám phá các
loại thuốc mới [2], phân tích biểu hiện gen [3], tái giải
trình tự DNA [4]. Kỹ thuật này mới được ứng dụng trong
lĩnh vực vi sinh môi trường trong vài năm gần đây [5]
nhưng đã cho thấy những tiềm năng vô cùng to lớn trong
phân tích quần xã vi sinh vật, xác định sinh vật gây bệnh
cũng như kiểm soát các quá trình trong cả khoa học cơ
bản và khoa học ứng dụng về môi trường [6].
2.1
Cấu trúc và chức năng của DNA array
Trong kỹ thuật DNA array, người ta cố định các axit nucleic có trình tự xác định
(mẫu dò) trên giá thể (mảng) thích hợp theo thứ tự. Axit nucleic cần nghiên cứu
(đích) được đánh dấu sau đó lai với mẫu dò trên mảng. Ở những điều kiện lý
tưởng, các axit nucleic có trình tự bổ sung bắt cặp chính xác với nhau. Hơn nữa
dưới các điều kiện này, cường độ phát hiện tín hiệu tỷ lệ trực tiếp với lượng mẫu
dò nên có thể định lượng các loại axit nucleic trong mẫu ban đầu [7].
Đường kính chấm (mỗi chấm đại diện cho một loại mẫu dò) trên macroarray
thường ≥ 300 µm và có thể được hiện hình bằng kỹ thuật gel thông thường hoặc
máy quét dùng trong những kỹ thuật blot trước đây. Ngược lại, các chấm trên
microarray thường có đường kính 200 µm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như
máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner) [8; 9]. Các phương pháp mới đây
có thể tạo ra đường kính chấm 100 µm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt
(photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra
chấm có đường kính 20 µm [8].
Microarray mật độ thấp
Trong ứng dụng này, axit nucleic gắn chặt với
màng nylon hoặc phiến kính đã biến đổi hoá học.
Nếu cần, có thể sử dụng tia cực tím để tạo liên kết
đồng hoá trị giữa mẫu dò với màng nilon. Plasmid
và các sản phẩm của phản ứng PCR thường được
đặt trên màng hoặc phiến kính với mật độ 80 - 200
chấm/cm2 với microarray mật độ thấp và 500 10.000 chấm/cm2 với microarray mật độ trung bình
[10].
Đó là microarray có trên 10.000 mẫu dò/cm2. Ngày nay người ta đã tạo ra các
DNA microarray với hơn 250.000 mẫu dò/cm2 gọi là DNA chip. Giá thể thường
dùng là thuỷ tinh hoặc silicon. Trên chip có thể chứa các oligonucleotide dài từ 25
đến 60 base, sản phẩm PCR hoặc đôi khi là các plasmid lớn từ 500 đến 5.000 base
[7].
2.2
Quá trình thực hiện DNA array
Về cơ bản, quá trình thực hiện thí nghiệm DNA array gồm hai bước: (i) chế tạo
mảng và (ii) tiến hành thí nghiệm [1].
▲Hình 1: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray.
2.2.1
Chế tạo mảng
Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò,
tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ
liệu cao [11]. Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử
dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon [1], trong đó thuỷ tinh thường được
dùng nhất [11]. Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò.
Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino
silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá [3] để tăng tính kỵ nước và khả năng
bám dính của mẫu dò [12].
Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa
chọn kỹ theo đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu
giúp đơn giản hoá công đoạn này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là
oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide)
hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) [11].
Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng
hai cách: (i) cố định (cDNA) (ii) tổng hợp in situ (oligonucleotide). Cách thứ nhất
thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in
vi tiếp xúc (micro-contact printing (µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks
(µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ
thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai.
Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing
(µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ [7].
In kim (Contact-tip deposition printing)
Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều
nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit
nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu
của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất (Hình 2). Trong thực
nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc [13].
▲Hình 2: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing [Theo
7].
Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung
dịch. Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000
cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6
cm2 [7].
In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing)
Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim. Trong đó, dùng “con dấu”
polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 3).
Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công các mảng mật độ cao [7].
▲Hình 3: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing [Theo 7].
In vi kênh (µFN- Micro-fluidics network)
µFN là kỹ thuật µCP cải tiến. Trong đó, con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt
trên thuỷ tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide. Dung dịch
cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao
quản (Hình 4).
▲Hình 4: Sản xuất mảng bằng kỹ thuật µFN [Theo 7].
Giống như µCP, tính khả thi của µFN để sản xuất các DNA array đang được chứng
minh [7].
In mạ (Electro capture)
Các array này giống như một con chip silicon. Giá thể ở đây là silicon có lớp bề
mặt bị ôxi hoá bởi nhiệt. Ở những vị trí xác định trên bề mặt này có các điện cực
platin dày 500 nm. Sau đó tiến hành một loạt các biến đổi hoá học có thứ tự để tạo
ra chip gồm nhiều lớp. Toàn bộ chip trừ phần không gian của điện cực platin được
phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si3N4 dày 2 mm, bằng cách này có thể thao tác với
điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ bởi lớp Si3N4. Trên
cùng của chip là lớp streptavidin-agarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã
biotin hoá (Hình 5).
▲Hình 5: In mạ [Theo 7].
Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide
đã biotin hoá [7]. Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin
bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực (Hình 6). Hiện tại, chip
với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích di truyền
(http://www.nanogen.com).
▲Hình 6: Sơ đồ chip electric silicon. (A) Sơ đồ chip có 25 điện cực platin, chiều
dài mỗi cạnh 1 cm. Phần ngoại biên của chip có các điện cực platin (ô vuông màu
sáng) để nối chip với nguồn điện. Khi có dòng điện sẽ xuất hiện các đường sáng
chạy giữa điện cực ngoại biên và điện cực nhỏ hơn ở trung tâm. (B) Mặt cắt vùng
điện cực trong trung tâm. Vùng này chứa điện cực đường kính 160 µm tại bốn góc
và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông. (C) Vùng điện cực [Theo 7].
In quang hoạt (Photolithography)
Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-
cleotide in situ trên giá thể rắn [14]. Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công
nghiệp bán dẫn [15].
Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân huỷ bởi tia cực tím trên bề mặt
giá thể rắn. Dùng mặt nạ để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực
tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại đó. Sau đó ủ với các nucleotide để
chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt những vùng đã hoạt hoá, kết thúc
một chu kỳ (Hình 7). Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra
một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại những vị trí xác
định trên cơ chất [14]. Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau
trên diện tích 1,28x1,28 cm (http://www.affymetrix.com).
In áp điện (Piezoelectric printing)
In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân
phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường [16]. Đầu áp điện
tạo ra các giọt nhỏ trên đầu phân phối (hình 8). Hiện tại có thể dùng phương pháp
này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2.
Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách
dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử
phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa
chất khử trityn hoá, hình 9) [16].
▲Hình 7: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt [Theo 16].
▲Hình 8: Sơ đồ ống phun áp điện. Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối
của điện áp [Theo 7].
▲Hình 9: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện. Thủ
tục nhiều ống phun. DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl
hoá [Theo 7].
In vi lỏng (µWP - Micro wet printing)
Kỹ thuật này được Ermantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in
khung silicon để định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng. Khung silicon kết hợp với
đường ống phân phối thuỷ tinh tạo thành hệ thống kênh. Kênh này sẽ liên kết các
đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực. Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến
của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với
hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ. Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch
rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết thúc một chu kỳ
(hình 10). Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào và vị trí mặt
nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ
chất. Hệ thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các
chất khác như protein hoặc kháng thể.
▲Hình 10: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng [Theo 7].
2.2.2
Tiến hành thí nghiệm
Về cơ bản, các bước tiến hành thí nghiệm với microarray là như nhau và gồm 3
bước: (i) chuẩn bị mẫu; (ii) tiến hành lai; (iii) xác định tín hiệu và chuẩn hoá dữ
liệu.
Chuẩn bị mẫu
Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu.
Mẫu để lai (đích) có thể là RNA hoặc DNA được đánh dấu nhằm mục đích phát
hiện trực tiếp chúng sau khi lai. Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh
dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm.
Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng
phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng
enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất
phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P, 33P,
35
S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin; và
nhuộm vàng/bạc [7]. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất [17].
Tiến hành lai
Sau khi đánh dấu, tiến hành lai trên mảng. Do sử dụng chất mang rắn nên phương
pháp microarray dễ tiến hành hơn các phương pháp blot. Trong quá trình lai, cho
dung dịch đích đã đánh dấu đi qua mảng. Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có)
với đích. Nếu dùng chất mang thuỷ tinh, có thể đặt úp một phiến kính thuỷ tinh lên
trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe trống giữa chúng bởi lực mao dẫn [1].
Một cách đơn giản khác là đặt trực tiếp mảng trong bể nhỏ chứa dung dịch lai. Các
điều kiện lai (như nồng độ mẫu, lực ion, nhiệt độ) phụ thuộc lớn vào kích thước
mẫu dò trên mảng và phải được xác định cho từng thí nghiệm [17]. Hiệu quả lai có
thể tăng lên nếu dung dịch lai luôn ở trong trạng thái động so với bề mặt mảng [1].
▲Hình 11: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5 [Theo Yu et al., 2002].
Xác định và phân tích tín hiệu lai
Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc
hiệu với mẫu dò [9]. Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất
đánh dấu trên đích phát ra. Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu
quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 12). Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu
cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên một mảng có thể đặt
hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại
có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân. Do đó cần có các phần mềm máy
tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết
luận nhanh và chính xác.
Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại
mảng ứng với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi
sử dụng chúng.
▲Hình 12: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng.
Mảng chứa mẫu dò cDNA
Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu
dò cDNA có kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau. Mỗi
mẫu được đánh dấu một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau
(hình 13). Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh
mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên
quan tới điều kiện nghiên cứu [18].
Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có
mẫu đối chứng cho mỗi phiến kính. (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu
quả lai hoặc gây ra hiện tượng lai chéo [19]. (iii) Không phân biệt được các gene
liên quan gần và các gene khác nhau một nucleotide. (iv) Sự đan xen giữa hai kênh
màu tạo ra nhiễu. Hơn nữa, hai loại chất phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo
ra hiệu quả lai khác nhau (cho dù là nhỏ). Do đó, cần phải chuẩn hoá dữ liệu [20].
(v) Không có khả năng định lượng. (vi) Cần lượng lớn đích [9].
Ưu điểm: (i) Rẻ, có thể tự chế tạo. (ii) Cho kết quả tốt với những gen chưa biết
trình tự [9]. (iii) Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo
thực tế nên tăng tính đặc hiệu [21]. (iv) Tính đặc hiệu cao [21].
▲Hình 13: Thủ tục lai sử dụng mẫu dò cDNA.
Mảng chứa mẫu dò oligonucleotide
Các chip tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gene khác nhau, mỗi gene
được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 “cặp mẫu dò” khác nhau [22].
Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò có trình tự ngắn
(25-60 base) nên để tăng tính chính xác và loại bỏ các tín hiệu nhiễu người ta đã
nghĩ ra mô mẫu dò bắt cặp không hoàn hảo/hoàn hảo (MM/PM). Oligonucleotide
bắt cặp hoàn hảo khác oligonucleotide bắt cặp không hoàn hảo chỉ một base chính
giữa (hình 15). So sánh cường độ dấu hiệu MM/PM để quyết định tính đặc hiệu
gắn. Ô đầu tiên trong hình cho thấy hiệu quả lai của các mẫu dò MM/PM như nhau
nên không được dùng để đánh giá. Tương tự, vùng 3 không được đánh giá vì
cường độ tín hiệu lai MM/PM như nhau, cho thấy kết quả lai không đặc hiệu. Tất
cả các vùng khác có kết quả lai đặc hiệu và là đối tượng phân tích.
Ưu điểm: (i) Các điều kiện được điều khiển chính xác, chip có chất lượng đồng
nhất và có thể so sánh hiệu quả. (ii) Có thể xác định các gene liên quan gần. (iii)
Có khả năng định lượng. (iv) Cần lượng nhỏ đích [9]. (v) Mật độ mẫu dò lớn cho
phép phân tích nhiều gen hơn trên một array [21]. (vi) Chỉ dựa trên thông tin trình
tự tức chỉ việc dựa trên các trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng
mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng…
do đó tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng,
cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot [14].
▲Hình 14: Thủ tục lai dùng mẫu dò tổng hợp in situ.
Nhược điểm: (i) Các trình tự được chọn dựa ngân hàng gene nên có thể phải chỉnh
sửa. (ii) Mẫu dò ngắn làm giảm độ nhạy và tính đặc hiệu. (iii) Không thể so sánh
đồng thời sự biểu hiện gene của hai mẫu thí nghiệm liên quan trên cùng một mảng
[21; 23].
▲Hình 15: Sơ đồ nguyên lý hệ thống MM/PM [Theo 14].
3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực
môi trường
3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực
môi trường
Mặc dù microarray ra đời mở ra một kỷ nguyên mới trong rất nhiều lĩnh vực, song
khi ứng dụng trong môi trường nó gặp phải một số vấn đề.
Vấn đề kỹ thuật
Tồn tại cố hữu của phương pháp microarray là các điều kiện lai (nhiệt độ, nồng độ
muối…) không bao giờ tối ưu cho mọi phân tử, dẫn đến hiệu quả lai không đặc
hiệu hoặc không hoàn toàn và kết quả sẽ thiếu chính xác.
Vấn đề quan trọng khi áp dụng kỹ thuật microarray với mẫu môi trường liên quan
đến các biến đổi khác nhau của dấu hiệu lai do mật độ và trình tự khác nhau [24].
Tính đa dạng di truyền rất lớn trong môi trường tác động đến cả việc chế tạo mảng
và giải thích dữ liệu. Tính đa dạng trình tự gene cấu trúc trong các quần thể liên
quan về mặt chức năng (như vi khuẩn cố định nitơ, khử sulfate hay nitrat hoá) lớn
làm khả năng tính toán của máy tính hiện khó đáp ứng nổi, đặc biệt khi sử dụng
các mẫu dò oligonucleotide ngắn [25]. Hơn nữa, hiệu quả của microarray với các
mẫu môi trường khác nhau có tương tự với mẫu chủng đơn hay không là một vấn
đề khó đánh giá [6; 26].
Một điều đặc biệt quan trọng là khi lai cùng lúc hàng trăm hoặc hàng ngàn mẫu dò
trên mảng sẽ làm tăng khả năng lai chéo giữa các trình tự không liên quan [27]. Tín
hiệu lai khác nhau phản ánh khá xác thực độ khác nhau giữa các mẫu tuy nhiên,
khi kết quả lai giống nhau không có nghĩa là những mẫu này giống nhau. Vì có thể
tồn tại các trình tự khác biệt nhưng chúng không được đặt thành mẫu dò trên mảng
[24].
Tính nhạy và đặc hiệu cũng là một tham số rất quan trọng khi sử dụng microarray
để nghiên cứu với các mẫu môi trường. Ở đó, sinh khối hay nồng độ đích thấp và
nhiều chất ô nhiễm làm giảm giới hạn phát hiện [6; 26; 25]. Do đó, một số nhà
nghiên cứu đã làm giàu mẫu hoặc sử dụng PCR để thu được đủ đích đã đánh dấu
[27]. Điều này chắc chắn làm thay đổi các điều kiện môi trường in situ và có thể
tác động sâu xa tới biểu hiện gene, thành phần quần xã và cản trở việc định lượng
các quần thể tự nhiên [28]. Tính đặc hiệu và độ nhạy cả hai phụ thuộc vào các yếu
tố thí nghiệm liên quan đến việc chế tạo mảng và lai. Tất cả các yếu tố như bề mặt
hoá học của phiến kính, hình thái chấm, khả năng gắn mẫu dò và các điều kiện lai
cũng như rửa đều ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và độ nhạy [29].
Ngoài ra, các cấu trúc bậc hai nội phân tử như cấu trúc kẹp tóc ảnh hưởng lớn đến
hiệu quả lai và gây ra sai số [4].
Vấn đề phân tích
Các vấn đề phân tích liên quan đến việc thu nhận và giải thích dữ liệu từ các thí
nghiệm mảng rất đáng chú ý. Việc giải thích dữ liệu rất khó do luôn tồn tại các
khác nhau cố hữu trong thí nghiệm mảng, một phần do các yếu tố thực nghiệm đã
đề cập ở trên. Ngoài ra, do thiếu sự lặp lại và định lượng của một số lớn dữ liệu thu
được nên làm cản trở việc phân tách các dữ liệu thích đáng. Trừ một số ngoại lệ
[30-32], thậm chí hầu hết sự chú ý nhỏ nhất với các tiêu chuẩn phân tích bị bỏ qua
trong những nghiên cứu môi trường. Điều này làm phần lớn các kỹ thuật mảng
dùng cho môi trường hiện vẫn đang trong giai đoạn phát triển [25].
Tuy còn khá nhiều vấn đề song nếu so sánh với các kỹ thuật trước đây thì những
hạn chế của microarray không đáng kể và hoàn toàn có thể bù đắp bởi lợi ích của
nó mang lại. Hơn nữa, các hạn chế này đa phần đều có thể khắc phục bằng những
cải tiến, phát triển mới trong kỹ thuật.
PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG
QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG
PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG
QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG
Vi sinh vật đóng vai trò độc nhất vô nhị trong chức năng cũng như trong việc duy
trì hệ sinh thái. Mới đây, đã có bằng chứng cho thấy rằng hoạt tính của vi sinh vật
là thiết yếu cho tính ổn định của sinh quyển [33]. Trạng thái tồn tại, phân bố của vi
sinh vật hoặc quần xã vi sinh vật chỉ thị có thể báo trước các hiệu ứng môi trường
trong một thời gian dài. Hầu như mọi thay đổi môi trường đều làm thay đổi thành
phần quần xã vi khuẩn. Do đó, có thể phát hiện sớm các yếu tố biến đổi không biết
trước bằng cách phân tích biến thiên quần thể hay nói cách khác, có thể sử dụng vi
sinh vật để giám sát trạng thái và các biến đổi môi trường [34]. Tuy nhiên, để có
thể quản lý môi trường trên diện rộng, cần phân tích một lượng mẫu sinh học
khổng lồ, điều này không thể đạt được với các kỹ thuật trước đây [35].
Ngày nay, trong lĩnh vực quản lý môi trường cần phát triển những phương pháp
mới để đánh giá tốc độ phân huỷ sinh học, quá trình chuyển hoá sinh học và động
học quần xã vi sinh với mục tiêu xác định quần xã, giám sát quá trình và xác định
điểm kết thúc phân huỷ sinh học... Trong thực nghiệm, để đạt được những điều trên
đòi hỏi phải: (i) xác định đồng thời nhiều loại vi sinh vật, (ii) sử dụng phương pháp
phân tích có thể tự động hoá, (iii) giám sát RNA như chỉ thị định tính hoạt tính vi
sinh vật và (iv) định lượng mức độ RNA và/hoặc hoạt tính vi sinh vật. Microarray
là kỹ thuật thoả mãn các yêu cầu này [6]. Nó mang lại những hứa hẹn trong sinh
thái vi sinh vật như phát hiện và định lượng các họ gen liên quan đến các chu trình
sinh địa hoá học, phân huỷ sinh học và vi sinh vật gây bệnh với hiệu suất cực cao
[31]. Với tập hợp mẫu dò được thiết kế thích hợp, chỉ cần một thí nghiệm để phát
hiện vài ngàn chủng vi khuẩn thuộc các loài, giống hoặc phân ngành khác nhau.
Điều này có nghĩa là trong các lĩnh vực y học, vi sinh thực vật, vi sinh động vật
động vật, quản lý chất lượng thực phẩm, nước chỉ cần một kiểm tra để phát hiện tất
cả các vi khuẩn gây bệnh/có lợi/nhiễm tạp có thể có trong mẫu nghiên cứu [36].
Kỹ thuật microarray mới ra đời vào đầu những năm 1990, thực sự phát triển từ
năm 1995 và mới được ứng dụng trong lĩnh vực môi trường chỉ vài năm gần đây
[6] nhưng đã phát triển rất mạnh mẽ. Một trong các ứng dụng nổi bất nhất của
microarray trong quản lý môi trường là xác định vi sinh vật (bảng 1). Các
microarray này chứa hàng trăm mẫu dò oligonucleotide, mỗi mẫu dò đại diện cho
các chủng/loài/giống vi sinh vật khác nhau cho phép phát hiện nhanh với hiệu suất
cao nhiều vi sinh vật từ hầu như bất cứ loại mẫu nào. Khả năng sử dụng các mảng
chuẩn đoán vi sinh vật bao phủ hầu như toàn bộ các lĩnh vực khoa học sự sống bao
gồm các chuẩn đoán người, thú y, thực vật và động vật, vi sinh môi trường, kiểm
tra chất lượng nước… Có thể xác định vi sinh vật gây bệnh cho người từ các mẫu
thử nghiệm một cách hoàn hảo với khả năng thiết kế mảng xác định nhanh, không
qua nuôi cấy, chỉ trong vài giờ và hầu như bảo trì được thông tin tự nhiên của nó.
Cũng có thể dùng microarray để phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, vi sinh vật gây
bệnh cho động, thực vật trên quy mô lớn. Ngoài ra còn có thể sử dụng để nghiên
cứu mức đa dạng vi sinh vật đất đối với tính chống chịu và độ màu mỡ của đất
cũng như biến thiên độ đa dạng theo hoạt động nông nghiệp [33].
Bảng 1: Các ứng dụng nổi bất nhất của microarray trong xác định vi sinh vật
Bên cạnh việc xác định vi khuẩn, DNA array còn có tác dụng đánh giá phân bố
gene chức năng trong môi trường tự nhiên. Gene mã hoá các enzyme chức năng
trong chu trình sinh địa hoá học (như C, S, N, các kim loại) là dấu hiệu rất hữu ích
để giám sát trạng thái sinh lý và hoạt tính chức năng của các quần thể và quần xã vi
sinh vật trong môi trường tự nhiên [59].
Bảng 2: Ứng dụng microarray để xác định các tập hợp gene chức năng trong môi
trường.
- Xem thêm -