BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
Lớp: DHSH6LT
SVTH: Nhóm 6
Võ Thị Kim Chi
Nguyễn Thị Hiếu
Đoàn Thị Kim Hồng Hiệp
Võ Thị Mỹ Trang
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
MỤC LỤC
1. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE:........................................................................3
2. NGUỒN THU NHẬN......................................................................................................6
3. VAI TRÒ VÀ TÁC DỤNG..............................................................................................7
3.1. Sản xuất bánh nướng...................................................................................................7
3.2. Sản xuất bột trứng.......................................................................................................8
3.3. Bảo quản thực phẩm....................................................................................................9
3.4. Sản xuất bia, rượu.....................................................................................................10
3.5. Chế biến sữa.............................................................................................................10
3.6. Công ngệ dệt............................................................................................................11
3.7. Mỹ phẩm..................................................................................................................11
3.8. Xử lý môi trường......................................................................................................11
3.9. Định lượng thực phẩm...............................................................................................13
3.10. Y học, chuẩn đoán bệnh...........................................................................................13
4. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN......................................................................................14
4.1. Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc...................................14
4.2. Lên men sinh tổng hợp enzyme GOD........................................................................14
5.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH.......................................................................................15
6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG..................................................................................16
6.1. Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry.............................................................16
a. Nguyên tắc...............................................................................................................16
b. Hoá chất cần dùng....................................................................................................16
c. Cách tiến hành..........................................................................................................16
d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn....................................................................................17
7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOSE-OXIDASE............18
7.1. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp dựa vào đường cong chuẩn hydrogen
peroxide.........................................................................................................................18
7.1.1Nguyên tắc:..........................................................................................................18
7.1.2 Dụng cụ - Hoá chất..............................................................................................19
7.1.3. Cách tiến hành....................................................................................................19
SVTH: Nhóm 6
Trang 2
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
7.1.4. Xây dựng đồ thị đường chuẩn H2O2......................................................................20
7.1.5. Tính kết quả........................................................................................................20
7.2. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp chuẩn độ......................................20
8. PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ENZYME....................................................................22
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................23
SVTH: Nhóm 6
Trang 3
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
1. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE:
Oxydase là enzyme thuộc lớp Oxydoreductase. Đây là enzyme xúc
tác cho phản ứng oxi-hóa-khử.
Là nhóm enzyme oxy hóa cơ chất, chuyển hóa electron đến oxy. Oxydase hoạt hóa
oxy, làm cho chúng có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường.
Lớp enzyme này tác dụng trực tiếp với oxy, tạo ra nước (H 2O) hoặc hydrogen
peroxide ( H2O2).
Enzym tiêu biểu là xitocromoxydase, poly phenoloxydase, ascorbatoxydase,
peroxydase, catalase, các oxydase flavin.
Sơ đồ hoạt động của oxydase như sau:
SVTH: Nhóm 6
Trang 4
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
Hình1 Cấu trúc không gian của glucose oxidase
Với trọng lượng phân tử 192.000 Dalton. Glucose oxidase là một protein lưỡng phân
hình thành từ 2 tiểu đơn vị giống nhau. Mỗi tiểu đơn vị hoặc monomer, cuộn vào trong 2
domain: một domain gắn với cơ chất, β-D-glucose,
trong khi đó domain khác liên kết
không đồng hóa trị với một nhân tố phụ, flavin adenine dinucleotide (FAD), mà nó sử
dụng như một tác nhân oxy hóa mạnh. FAD là một thành phần phổ biến trong các phản
ứng oxy hóa khử sinh học, nó nhận và cho các điện tử từ một phân tử.
Trong glucose oxydase, FAD hoạt động như một chất nhận điện tử mà làm cho nó bị
khử thành FADH2; FADH2 sau đó bị oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng, phân tử
oxy, oxy sẽ bị khử thành hydrogen peroxide (H2O2).
Glucose oxidase được tiết ra bởi nấm mốc, chủ yếu là Aspergillus niger hay
Penicillium amagaskinense. Nó được phân bố giữa dịch ngoại bào, vách tế bào, và trong
chất dịch nhầy của nấm mốc. Quá trình tổng hợp gucose oxydase có thể được kích thích
bởi các chất khác nhau, bao gồm phân tử oxy, mà nó kích thích sự dịch mã enzyme.
Glucose Oxidase bản thân nó không hoạt động, nhưng với sự hiện diện của những cơ
chất đặc trưng, enzyme được sử dụng để oxy hóa trực tiếp phân tử glucose hoặc oxygen.
SVTH: Nhóm 6
Trang 5
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
Nhóm ngoại của enzyme này là FAD. Các sản phẩm của phản ứng này là gluconic acid
và hydrogen
Glucose oxydase có thể oxi hóa β-D-glucose sử dụng các chất oxi hóa khác bên cạnh
phân tuoxy,bao gồm các quinine và các chất nhận 1 electron. D-glucono-1,5-lactone sau
đó tự động thủy phân để tạo ra gluconic acid
C6H12O6 + H2O + 1/2O2 → C6H12O7 + H2O2
Glucose
gluconic acid
Phản ứng tối ưu ở điều kiện nhiệt độ giữa 30 đến 50oC tại pH giữa 4.5 đến 6.5.
2. NGUỒN THU NHẬN
Enzym
Nguồn enzym
Glucose oxidase (EC.1.1.3.4)
Aspergillus niger.
A. Oryzae
Penicillium notatum.
Catalase (EC.1.11.1.6)
Cholesterol
Gan bò, Aspergillus sp.
oxydase Nocardiaerythr
(EC.1.1.3.6)
Ascorbat
oxydase Cucurbita sp.
(EC.1.10.3.3)
Peroxidase (EC.1.11.1.7)
Củ cải ngựa
Pyruvate oxidase (EC.1.2.3.3)
Pediococcus sp.
SVTH: Nhóm 6
Trang 6
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
Glycerol 3-phosphate oxidase Aerococcus viridans
(EC.1.1.3.21)
NADH-peroxidase
Streptococcus faccalis
(EC.1.11.1.1)
Sulfite oxidase (EC.1.8.3.1)
Gan gà
Urate oxidase (EC.1.7.3.3)
Arthrobacter protophormiac
Xanthine oxidas(EC.1.1.3.22)
Sữa bò
3. VAI TRÒ VÀ TÁC DỤNG
Oxydase là enzyme ứng dụng nhiều trong nhiều lĩnh vực.
3.1. Sản xuất bánh nướng
Các oxydase thường dùng là Glucose oxidase, Hexose oxidase,
Peroxidase,
Lipoxygenase, polyphenol oxidase với tác dụng là: Tăng lực của gluten, đảm bảo chất
lượng bột làm bánh, cải thiện mùi vị và màu sắc của sản phẩm.
SVTH: Nhóm 6
Trang 7
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
3.2. Sản xuất bột trứng
Các oxydase thường dùng là Glucose oxidase, , catalase với tác dụng là: Loại
glucose của lòng trắng trứng để tránh phản ứng mailard, tăng thời gian bảo quản sản
phẩm trứng.
Người ta thấy rằng nêu trong bột trứng có chứa glucose thì trong quá trình chế
biến cũng như khi bảo quản, glucose sẽ tương tác với protein và sẽ bị oxy hóa dần để tạo
nên những phẩm vật có màu sẫm và mùi khó chịu, làm cho chất lượng thành phẩm bị
giảm sút. Trong albumin trứng thường có chứa 3% glucose còn trong lòng đỏ chứa 0,5%
glucose (so với chất khô). Vì vậy, trong sản xuất bột trứng và albumin trứng, người ta
dùng glucose oxydase để oxy hóa trước các glucose đó, khiến cho những quá trình trên
không xảy ra, đồng thời cũng tăng được thời gian bảo quản các sản phẩm trứng.
SVTH: Nhóm 6
Trang 8
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
3.3. Bảo quản thực phẩm
Các oxydase thường dùng: Glucose oxidase, catalase nhằm tránh thực phẩm khỏi bị
oxyhóa, như thịt, sữa, phomat…
Glucose oxidase được sử dụng thành công đê cầu nối glucose và oxy trong thực phẩm và
thức uống để kéo dài thời gian bảo quản cho thực phẩm và đồ uống. Hydrogen peroxide
được sản sinh ra từ enzyme này hoạt động như một chất diệt vi khuẩn rất tốt
Glucose oxidase có thể được sử dụng để loại bỏ oxy ở đầu chai nước đồ uống trước khi
chúng được đóng chai.
Để bảo quản các sản phẩm dạng lỏng, người ta có thể hòa tan vào đó Glucose oxidase
cùng một ít glucose trước khi bao gói. Khi đó tất cả oxy dư trong sản phẩm sẽ được tách
hết.
Phomai được đóng gói trong một màng đặc biệt có tẩm Glucose oxidase, sẽ ngăn ngừa
được sự xâm nhập của oxy, sự biến đổi do oxy hóa và sự tạo màu xẫm ở lớp bề mặt. Còn
thịt nếu được bọc trong giấy trắng kính tẫm enzyme cũng sẽ bảo vệ được màu sắc tự
nhiên của nó.
Gần đây, có những sản phẩm dạng “túi khử oxy”, chúng gồm một ít glucose, chế
phẩm Glucose oxidase-catalase và dung dịch đệm cần thiết cho vào trong 1 túi polyetylen
(hay vật liệu khác) chỉ để cho oxy và không khí đi qua mà không cho nước đi qua. Đặt túi
vào trong hộp, thùng kín có chứa các sản phẩm cần bảo quản. Túi đó sẽ hấp thu hoàn toàn
oxy, làm cho vật liệu được bảo quản tốt.
Sữa khô, các mặt hang kẹo, bơ có thể được bảo quản lâu nhờ túi khử này, ngoài ra
còn dùng bảo vệ các chi tiết máy tinh vi và các thiết bị khỏi bị han gỉ và ăn mòn.
SVTH: Nhóm 6
Trang 9
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
3.4. Sản xuất bia, rượu
Glucose oxidase , catalase, peroxydase, ascorbinatoxydase Kéo dài thời gian sử dụng bia,
chống sự mất màu đỏ của rượu vang đỏ, và vang trắng chuyển màu.
Glucose oxidase có khả năng sử dụng trong công ngiệp làm rượu, mà nó làm giảm độ
cồn trong rượu thông qua việc loại bỏ một số glucose (chuyển nó thành dạng D-glucono1,5-lactonea nếu không nó sẽ chuyển thành cồn. Hơn nữa glucose oxidase có thể ngăn
chặn sự hư hỏng rượu thông qua tác động diệt vi khuẩn của nó lên vi khuẩn acetic acid và
vi khuẩn lacitc acid trong suốt quá trình lên men. Enzyme này sẽ được bổ sung thêm vào
rượu đê tăng hiệu quả diệt vi sinh vật.
Trong sản xuất bia, người ta dùng Glucose oxidase để ổn định thành phần. ở nhiệt
độ phòng bia chưa được thanh trùng sẽ bị đục sau 10-15 ngày bảo quản do nấm mốc và vi
khuẩn phát triển. Nếu cho một ít chế phẩm Glucose oxidase vào bia (1g/200-250l) thì sẽ
tách hết oxy có trong chất lỏng cũng như trong các khoảng không tự do, kết quả là tính
cảm quan của sản phẩm sẽ được bảo đảm trong thời gian từ 50-100 ngày.
3.5. Chế biến sữa
Glucose oxidase, catalase Peroxidase,Lactoperoxidase dùng trong bảo quản sữa.
SVTH: Nhóm 6
Trang 10
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
3.6. Công ngệ dệt
Glucose oxidase, catalase, Lacase dùng để làm trắng, loại peroxide thừa trên sợi trước khi
nhuộm màu, phân giải và oxy hóa chất màu.
3.7. Mỹ phẩm
Trong thuốc nhuộm tóc, enzyme peroxydase tạo H 2O2 tại chỗ nồng độ thấp, không
làm hại tóc.
3.8. Xử lý môi trường
Loại bỏ H2O2 trong nước thải nhanh và có hiệu quả.
Catalase (EC 1.11.1.6) xúc tác phản ứng đặc hiệu phân huỷ H2O2 [2]. Ngoài ra,
catalase có thể phân huỷ formaldehyde, formic acid và alcohol - Các chất độc hại với môi
trường, được thải ra trong nước thải của các nhà máy chế biến sữa, pho mát hoặc các nhà
máy dệt, sợi. Catalase vi khuẩn có tác dụng tích cực trong việc phá hủy chúng. Trong các
enzyme peroxidase thì catalase, peroxidase và manganese peroxidase được nghiên cứu
nhiều phục vụ cho việc phát hiện một số ion kim loại độc cho môi trường như: Hg+2,
Pb+2, Cd+2, Cr+6, Mn+2 [3].
Peroxidase củ cải ngựa (Horseradish peroxidase-HRP) có k. hiệu EC 1.11.1.7, tác động
như catalase, xúc tác phản ứng đặc hiệu. HRP là một trong những enzyme được nghiên
cứu nhiều nhất có liên quan tới phương pháp xử lý. rác thải bằng enzyme. HRP có thể
SVTH: Nhóm 6
Trang 11
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
xúc tác phản ứng oxy hoá một phổ rộng các hợp chất thơm độc bao gồm phenol,
biphenol, aniline, benzidine và các hợp chất thơm dị v.ng như hydroxyquinoline và
arylamine carcinogen như benzidine và naphthylamine.
Peroxidase được sử dụng để cải thiện quá trình khử nước bằng cặn phosphate
L-galactonolactone oxidase (EC 1.1.3.24) có . nghĩa đối với việc xử lý ô nhiễm môi
trường. Enzyme này xúc tác phản ứng đặc hiệu là phản ứng oxi hoá L-galactono-1,4lactone thành L-ascorbate
Các enzyme polyphenol oxidase có khả năng xúc tác cho các phản ứng ôxy hoá các hợp
chất phenol. Các enzyme này được chia thành hai phân họ: tyrosinase và laccase. Hoạt
tính của cả hai họ đều cần sự có mặt của oxy phân tử nhưng không cần có mặt các
coenzyme.
Tyrosinase (EC 1.14.18.1) hay polyphenol oxydase, phenolase hay catecholase xúc
tác cho hai phản ứng liên tiếp: phản ứng thứ nhất là phản ứng thuỷ phân monophenol nhờ
oxy phân tử thành các o-diphenol và phản ứng thứ hai là phản ứng dehydrogen hoá các odiphenol nhờ oxy thành các o-quinon. Các quinon thường không bền và bị polime hoá
không cần enzyme thu được các hợp chất không tan trong nước và dễ dàng bị loại bỏ nhờ
kết tủa.
Laccase (EC 1.10.3.2) là một enzyme kim loại xúc tác cho phản ứng oxi
hoáhydroquinone thành benzoquinone
Quá tr.nh tẩy trắng giấy được áp dụng rộng rãi trong công nghiệp nghiền bột giấy để loại
bỏ các gốc lignin trong bột giấy. Các gốc này là nguyên nhân làm cho bột giấy có màu
nâu và được loại bỏ mà ít tốn kém bằng cách dùng các chất tẩy trắng như chlorine và các
oxid chlorine. Quá trình tẩy trắng tạo ra dịch lỏng có màu nâu đen chứa các sản phẩm bị
chlorin hoá độc và có khả năng gây đột biến gây nguy hiểm đối với môi trường.
Peroxidase và laccase có tác dụng tích cực trong việc xử l. dịch lỏng sau quá tr.nh tẩy nói
trên và dạng cố định của các loại enzyme này trong mọi trường hợp đều hiệu quả hơn so
với dạng tự do.
SVTH: Nhóm 6
Trang 12
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
3.9. Định lượng thực phẩm
Phân tích thành phần cholesterol, sulfite..trong thực phẩm.
Dùng cholesterol oxydase, sau đó dùng catalase để chuyển hóa tiếp H 2O2 được tạo thành,
và xác định formaldehyde được tạo thành.
Sulfite thường dùng để bảo quản thực phẩm, nông sản, làm bất hoạt nhiều enzyme, ngăn
ngừa tạo màu nâu, nếu nồng độ quá cao sẽ gây hại. Dùng sulfite oxydase, sau đó dùng
NADP peroxydase để chuyển hóa H2O2 tạo thành.
3.10. Y học, chuẩn đoán bệnh
Làm thuốc thử trong hóa phân tích, kháng khuẩn.
Sử dụng glucose oxidase trong phương pháp đo hàm lượng glucose trong máu
Những người bệnh tiểu đường cần phải kiểm tra hàm lượng glucose trong máu thường
xuyên để xác định sự dao động của nồng độ glucose có thể tăng hay giảm trong máu từ
đó đưa ra cách điều trị bệnh hợp lý. Gần đây, thiết bị cảm biến sinh học (Biosensor) được
phát triển để dùng cho việc đo lường hàm lượng glucose, và glucose oxydase là một trong
những enzyme chủ yếu mà biosensor có thể sử dụng.
Sự định lượng chính xác hàm lượng glucose trong máu thì rất quan trọng trong sự chuẩn
đoán và điều khiển sự tăng và giảm đường huyết.
Phương pháp sử dụng thuốc thử trong đo lường hàm lượng glucose trong máu
Phản ứng glucose oxidase kết hợp với một phản ứng phụ đã được sử dụng rộng rãi cho
việc xác định glucose trong dung dịch sinh học. Nhiều phản ứng bổ trợ khác được phát
triển để cải tiến toàn bộ hệ thống phản ứng đặc trưng hoặc giữ lại các đặc tính vốn có của
glucose oxidase. Phương pháp sử dụng thuốc thử dựa vào 10 phản ứng chỉ thị màu của
hydrogen peroxide mà nó kết hợp với 4-aminontipyrine để tạo một phức phenolic,
phương pháp này được đề xuất đầu tiên bởi Trinder
Phương trình phản ứng:
Glucose Oxidas
1. Glucose + O2 + H2O ————> Gluconic Acid + H2O2
2. H2O2 + HBA + 4-AAP————> thuốc nhuộm Quinoneimine + H2O
SVTH: Nhóm 6
Trang 13
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
Phương trình 1: Glucose bị oxy hóa bởi glucose oxydase tạo ra gluconic acid và
hydrogen peroxide
Phương trình 2: Hydrogen peroxide phản ứng với HBA và 4-aminoantipyrine với sự hiện
diện của enzyme Peroxidase hình thành nên 1 quinoneimine bắt màu đỏ. Cường độ màu
tạo thành thì tương ứng với nồng độ glucose và có thể được đo lường bằng phương pháp
đo mật độ quang ở bước sóng giữa 460-560nm.
Chú thích:
HBA = 4-hydroxybenzoic acid
4-AAP = 4-aminoantipyrine
4. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN
Thu nhận GOD từ nấm mốc: chủng Penicilium: Pen. Notatum, Pen.chrysoenum,
Pen.vitale và chủng Aspergillus: A. niger,
4.1. Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc
Đem vật phẩm (mẫu vật đã để lên mốc) giã nhỏ, hòa vào trong 200ml nước cất vô
trùng, hút 0.1 ml dịch cho vào đĩa petri có môi trường Czapek. Dùng que trang trải đều
khắp mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ 300C trong 3-7 ngày.
Chọn khuẩn lạc đứng tách biệt dùng que cấy lấy một ít VSV cấy lên các đĩa petri khác,
làm tương tự cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần chủng, dùng que cấy lấy một ít bào tử
khuẩn lạc đó cấy vào ống thạch nghiêng.
4.2. Lên men sinh tổng hợp enzyme GOD
Tiến hành lên men trong môi trường lỏng với thành phần (g/l): (NH4)2SO4 0.4;
KH2PO4 0.4; MgSO4.7H2O 0,1; saccharose 100; peptone 15; CaCO3 40.
Đun sôi môi trường cho tan hết, điều chỉnh pH 6.5 – 6.9. Lấy 70 ml môi trường vào mỗi
bình nón 250 ml, hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút, làm nguội xuống nhiệt độ môi
trường và cấy với 3 vòng que cấy VSV.
SVTH: Nhóm 6
Trang 14
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
Bình nón được nuôi 70h trên máy lắc với tốc độ 175 vòng/phút. Sau lên men, canh
trường VSV được ly tâm 15 phút (5200 vòng/phút) để tách riêng phần lỏng và sinh khối
VSV.
5.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH
Nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật người ta
thực hiện thử nghiệm oxidase.
NGUYÊN TẮC:
Cytochrome oxidase trong chuỗi chuyền điện tử của hô hấp hiếu khí với
oxy là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh
vật hiếu khí hay kỵ khí tùy ý.
Thuốc thử p-phenylenediamine.
Có sự hiện diện của cytochrome c khử trong tế bào: thuốc thử bị oxy hóa
thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
SVTH: Nhóm 6
Trang 15
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
6.1. Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry
a. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp
photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu
xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước song 660nm.
Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một
phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác
định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
b. Hoá chất cần dùng
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000ml nước cất.
- Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%)
hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%.
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi
dùng).
- Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N.
- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml
c. Cách tiến hành
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp
cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút. Sau đó
thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên
trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da trời và đạt đến cường độ
mầu cực đại. Đem so mầu của hỗn hợp trên máy so mầu quang điện ở bước sóng 660nm.
Xác định được trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. Đo trên máy 3 lần lặp
lại và lấy trị số trung bình.
SVTH: Nhóm 6
Trang 16
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
- Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C
và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn
Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry,
dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.
Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được
dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với
các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 g/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như
trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10
phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm.
- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung
dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý
theo phương pháp thống kê thông thường.
Ta có phương pháp hồi quy.
y = 0,55066844x + 0,01791961
SVTH: Nhóm 6
Trang 17
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
OD
0,6
660
0,5
nm
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
mg
1,2
Hàm lượng protein
Hình 1. Đường đồ thị xác định nồng độ Protein theo phương pháp Lowry
Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên
cứu.
7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME
GLUCOSE-OXIDASE
7.1. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp dựa vào đường cong
chuẩn hydrogen peroxide
7.1.1Nguyên tắc:
Hoạt tính enzyme Glucose oxidase được đo bằng cách xác định hàm lượng
hydrogen peroxide (H2O2) tạo thành trong phản ứng chuyển hoá đường glucose
thành gluconic acid trong phản ứng sau :
GOD GOD
Glucose +
SVTH: Nhóm 6
O2
gluconic acid + H2O2
Trang 18
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
POD
H2O2+ α-dianisidine
α-dianisidine + H2O
Đường cong chuẩn hydrogen peroxide (H 2O2) được xây dựng để xác định hàm lượng
Hydrogen peroxide (H2O2) trong phản ứng .
Một đơn vị hoạt tính là lượng enzyme cần để tạo ra 1µ mol gluconic acid và H2O2 trong
một phút ở điều kiện pH 5.1 và nhiệt độ 250C .
7.1.2 Dụng cụ - Hoá chất
a. Dụng cụ
− Ống nghiệm
− Pipets
− Quang phổ kế
− Cuvettes
b. Hoá chất & enzyme
−Dung dịch Hydrogen peroxide (H2O2) chuẩn
−Acid sulfuric (H2SO4)
−Thuốc thử α-dianisidine
−Enzyme Peroxidase (POD)
−Enzyme Glucose oxidase (GOD)
−Dung dịch Glucoses
7.1.3. Cách tiến hành
Cho 0.1 ml (2mg/ml) glucose oxidase vào ống nghiệm chứa 2.9 ml dung dịchglucose (1 –
20mM) được pha trong dung dịch đệm acetate (pH 5.1). Phản ứngđược thực hiện ở nhiệt
độ 250C trong thời gian 1 – 3 phút .
Sau đó thêm vào 0.1ml (60U/ml) peroxidase (POD) và 2.4mlo-dianisidine (0.21mM)
− POD là chất xúc tác cho phản ứng giữa Hydrogen peroxide (H2O2) và α-dianisidine
SVTH: Nhóm 6
Trang 19
ENZYME OXYDASE
GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ
( chất tạo màu). Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm vào 0.5ml dung dịch acid
sulfuric 2.5M
Đo mật độ quang OD 530nm (OD530) và xác định lượng hydrogen
peroxide(H2O2) tạo ra dựa trên đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD530 và nồng
độchuẩn hydrogen peroxide (H2O2).
7.1.4. Xây dựng đồ thị đường chuẩn H2O2
Pha loãng dung dịch hydrogen peroxide (H2O2)chuẩn theo các nồng độ khác nhau. Có
thể cho trong bảng sau :
Hóa chất
H2O2 (ml)
Nước cất (ml)
Nồng độ
ống 1
0,2
9,8
0,2
ống 2
0,4
9,6
0,4
ống 3
0,6
9,4
0,6
ống 4
0,8
9,2
0,8
ống 5
1,0
9,0
1,0
Từ các ống nghiệm trên lấy 2.4ml ở mỗi ống nghiệm vào 5 ống nghiệm khác
và thêm vào mỗi ống 2.4mlo-dianisidine ( chất tạo màu) với 0.1ml (60U/ml)
peroxidase (POD) chất xúc tác phản ứng. Sau đó cho vào 0.5ml H2SO4 2.5M để
dừng phản ứng .
Đo mật độ quang OD 530nm (OD530) và xây dựng đường chuẩn H2O2 .
7.1.5. Tính kết quả
Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được lượng H2O2 tạo thành trong phản ứng
enzyme .
7.2. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp chuẩn độ
Đây là được sử dụng phương pháp phổ biến để xác định hoạt tính của GOD. Trong
phương pháp này, 1 ml dung dịch enzyme được thêm vào 25 ml đệm CH3COONa 60
mM pH 5.6 chứa 2% β-D-glucose. Hỗn hợp được lắc 1h trong không khí ở 300C trên
máy lắc, tốc độ 200 vòng/phút. Phản ứng dừng lại bởi thêm vào 20ml dung dịch NaOH
0.1N. Hỗn hợp đó đem chuẩn độ với dung dịch chuẩn HCl 0.1N. Mẫu trống (không có
SVTH: Nhóm 6
Trang 20
- Xem thêm -