Tiểu luận Enzyme oxydase

  • Số trang: 24 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 60 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 27372 tài liệu

Mô tả:

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM  GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Lớp: DHSH6LT SVTH: Nhóm 6 Võ Thị Kim Chi Nguyễn Thị Hiếu Đoàn Thị Kim Hồng Hiệp Võ Thị Mỹ Trang ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ MỤC LỤC 1. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE:........................................................................3 2. NGUỒN THU NHẬN......................................................................................................6 3. VAI TRÒ VÀ TÁC DỤNG..............................................................................................7 3.1. Sản xuất bánh nướng...................................................................................................7 3.2. Sản xuất bột trứng.......................................................................................................8 3.3. Bảo quản thực phẩm....................................................................................................9 3.4. Sản xuất bia, rượu.....................................................................................................10 3.5. Chế biến sữa.............................................................................................................10 3.6. Công ngệ dệt............................................................................................................11 3.7. Mỹ phẩm..................................................................................................................11 3.8. Xử lý môi trường......................................................................................................11 3.9. Định lượng thực phẩm...............................................................................................13 3.10. Y học, chuẩn đoán bệnh...........................................................................................13 4. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN......................................................................................14 4.1. Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc...................................14 4.2. Lên men sinh tổng hợp enzyme GOD........................................................................14 5.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH.......................................................................................15 6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG..................................................................................16 6.1. Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry.............................................................16 a. Nguyên tắc...............................................................................................................16 b. Hoá chất cần dùng....................................................................................................16 c. Cách tiến hành..........................................................................................................16 d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn....................................................................................17 7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOSE-OXIDASE............18 7.1. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp dựa vào đường cong chuẩn hydrogen peroxide.........................................................................................................................18 7.1.1Nguyên tắc:..........................................................................................................18 7.1.2 Dụng cụ - Hoá chất..............................................................................................19 7.1.3. Cách tiến hành....................................................................................................19 SVTH: Nhóm 6 Trang 2 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 7.1.4. Xây dựng đồ thị đường chuẩn H2O2......................................................................20 7.1.5. Tính kết quả........................................................................................................20 7.2. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp chuẩn độ......................................20 8. PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ENZYME....................................................................22 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................23 SVTH: Nhóm 6 Trang 3 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 1. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE: Oxydase là enzyme thuộc lớp Oxydoreductase. Đây là enzyme xúc  tác cho phản ứng oxi-hóa-khử.  Là nhóm enzyme oxy hóa cơ chất, chuyển hóa electron đến oxy. Oxydase hoạt hóa oxy, làm cho chúng có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường.  Lớp enzyme này tác dụng trực tiếp với oxy, tạo ra nước (H 2O) hoặc hydrogen peroxide ( H2O2).  Enzym tiêu biểu là xitocromoxydase, poly phenoloxydase, ascorbatoxydase, peroxydase, catalase, các oxydase flavin.  Sơ đồ hoạt động của oxydase như sau: SVTH: Nhóm 6 Trang 4 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Hình1 Cấu trúc không gian của glucose oxidase Với trọng lượng phân tử 192.000 Dalton. Glucose oxidase là một protein lưỡng phân hình thành từ 2 tiểu đơn vị giống nhau. Mỗi tiểu đơn vị hoặc monomer, cuộn vào trong 2 domain: một domain gắn với cơ chất, β-D-glucose,  trong khi đó domain khác liên kết không đồng hóa trị với một nhân tố phụ, flavin adenine dinucleotide (FAD), mà nó sử dụng như một tác nhân oxy hóa mạnh. FAD là một thành phần phổ biến trong các phản ứng oxy hóa khử sinh học, nó nhận và cho các điện tử từ một phân tử. Trong glucose oxydase, FAD hoạt động như một chất nhận điện tử mà làm cho nó bị khử thành FADH2; FADH2 sau đó bị oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng, phân tử oxy, oxy sẽ bị khử thành hydrogen peroxide (H2O2). Glucose oxidase được tiết ra bởi nấm mốc, chủ yếu là Aspergillus niger hay Penicillium amagaskinense. Nó được phân bố giữa dịch ngoại bào, vách tế bào, và trong chất dịch nhầy của nấm mốc. Quá trình tổng hợp gucose oxydase có thể được kích thích bởi các chất khác nhau, bao gồm phân tử oxy, mà nó kích thích sự dịch mã enzyme. Glucose Oxidase bản thân nó không hoạt động, nhưng với sự hiện diện của những cơ chất đặc trưng, enzyme được sử dụng để oxy hóa trực tiếp phân tử glucose hoặc oxygen. SVTH: Nhóm 6 Trang 5 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Nhóm ngoại của enzyme này là FAD. Các sản phẩm của phản ứng này là gluconic acid và hydrogen Glucose oxydase có thể oxi hóa β-D-glucose sử dụng các chất oxi hóa khác bên cạnh phân tuoxy,bao gồm các quinine và các chất nhận 1 electron. D-glucono-1,5-lactone sau đó tự động thủy phân để tạo ra gluconic acid C6H12O6 + H2O + 1/2O2 → C6H12O7 + H2O2 Glucose gluconic acid Phản ứng tối ưu ở điều kiện nhiệt độ giữa 30 đến 50oC tại pH giữa 4.5 đến 6.5. 2. NGUỒN THU NHẬN Enzym Nguồn enzym Glucose oxidase (EC.1.1.3.4) Aspergillus niger. A. Oryzae Penicillium notatum. Catalase (EC.1.11.1.6) Cholesterol Gan bò, Aspergillus sp. oxydase Nocardiaerythr (EC.1.1.3.6) Ascorbat oxydase Cucurbita sp. (EC.1.10.3.3) Peroxidase (EC.1.11.1.7) Củ cải ngựa Pyruvate oxidase (EC.1.2.3.3) Pediococcus sp. SVTH: Nhóm 6 Trang 6 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Glycerol 3-phosphate oxidase Aerococcus viridans (EC.1.1.3.21) NADH-peroxidase Streptococcus faccalis (EC.1.11.1.1) Sulfite oxidase (EC.1.8.3.1) Gan gà Urate oxidase (EC.1.7.3.3) Arthrobacter protophormiac Xanthine oxidas(EC.1.1.3.22) Sữa bò 3. VAI TRÒ VÀ TÁC DỤNG Oxydase là enzyme ứng dụng nhiều trong nhiều lĩnh vực. 3.1. Sản xuất bánh nướng Các oxydase thường dùng là Glucose oxidase, Hexose oxidase, Peroxidase, Lipoxygenase, polyphenol oxidase với tác dụng là: Tăng lực của gluten, đảm bảo chất lượng bột làm bánh, cải thiện mùi vị và màu sắc của sản phẩm. SVTH: Nhóm 6 Trang 7 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 3.2. Sản xuất bột trứng Các oxydase thường dùng là Glucose oxidase, , catalase với tác dụng là: Loại glucose của lòng trắng trứng để tránh phản ứng mailard, tăng thời gian bảo quản sản phẩm trứng. Người ta thấy rằng nêu trong bột trứng có chứa glucose thì trong quá trình chế biến cũng như khi bảo quản, glucose sẽ tương tác với protein và sẽ bị oxy hóa dần để tạo nên những phẩm vật có màu sẫm và mùi khó chịu, làm cho chất lượng thành phẩm bị giảm sút. Trong albumin trứng thường có chứa 3% glucose còn trong lòng đỏ chứa 0,5% glucose (so với chất khô). Vì vậy, trong sản xuất bột trứng và albumin trứng, người ta dùng glucose oxydase để oxy hóa trước các glucose đó, khiến cho những quá trình trên không xảy ra, đồng thời cũng tăng được thời gian bảo quản các sản phẩm trứng. SVTH: Nhóm 6 Trang 8 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 3.3. Bảo quản thực phẩm Các oxydase thường dùng: Glucose oxidase, catalase nhằm tránh thực phẩm khỏi bị oxyhóa, như thịt, sữa, phomat… Glucose oxidase được sử dụng thành công đê cầu nối glucose và oxy trong thực phẩm và thức uống để kéo dài thời gian bảo quản cho thực phẩm và đồ uống. Hydrogen peroxide được sản sinh ra từ enzyme này hoạt động như một chất diệt vi khuẩn rất tốt Glucose oxidase có thể được sử dụng để loại bỏ oxy ở đầu chai nước đồ uống trước khi chúng được đóng chai. Để bảo quản các sản phẩm dạng lỏng, người ta có thể hòa tan vào đó Glucose oxidase cùng một ít glucose trước khi bao gói. Khi đó tất cả oxy dư trong sản phẩm sẽ được tách hết. Phomai được đóng gói trong một màng đặc biệt có tẩm Glucose oxidase, sẽ ngăn ngừa được sự xâm nhập của oxy, sự biến đổi do oxy hóa và sự tạo màu xẫm ở lớp bề mặt. Còn thịt nếu được bọc trong giấy trắng kính tẫm enzyme cũng sẽ bảo vệ được màu sắc tự nhiên của nó. Gần đây, có những sản phẩm dạng “túi khử oxy”, chúng gồm một ít glucose, chế phẩm Glucose oxidase-catalase và dung dịch đệm cần thiết cho vào trong 1 túi polyetylen (hay vật liệu khác) chỉ để cho oxy và không khí đi qua mà không cho nước đi qua. Đặt túi vào trong hộp, thùng kín có chứa các sản phẩm cần bảo quản. Túi đó sẽ hấp thu hoàn toàn oxy, làm cho vật liệu được bảo quản tốt. Sữa khô, các mặt hang kẹo, bơ có thể được bảo quản lâu nhờ túi khử này, ngoài ra còn dùng bảo vệ các chi tiết máy tinh vi và các thiết bị khỏi bị han gỉ và ăn mòn. SVTH: Nhóm 6 Trang 9 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 3.4. Sản xuất bia, rượu Glucose oxidase , catalase, peroxydase, ascorbinatoxydase Kéo dài thời gian sử dụng bia, chống sự mất màu đỏ của rượu vang đỏ, và vang trắng chuyển màu. Glucose oxidase có khả năng sử dụng trong công ngiệp làm rượu, mà nó làm giảm độ cồn trong rượu thông qua việc loại bỏ một số glucose (chuyển nó thành dạng D-glucono1,5-lactonea nếu không nó sẽ chuyển thành cồn. Hơn nữa glucose oxidase có thể ngăn chặn sự hư hỏng rượu thông qua tác động diệt vi khuẩn của nó lên vi khuẩn acetic acid và vi khuẩn lacitc acid trong suốt quá trình lên men. Enzyme này sẽ được bổ sung thêm vào rượu đê tăng hiệu quả diệt vi sinh vật. Trong sản xuất bia, người ta dùng Glucose oxidase để ổn định thành phần. ở nhiệt độ phòng bia chưa được thanh trùng sẽ bị đục sau 10-15 ngày bảo quản do nấm mốc và vi khuẩn phát triển. Nếu cho một ít chế phẩm Glucose oxidase vào bia (1g/200-250l) thì sẽ tách hết oxy có trong chất lỏng cũng như trong các khoảng không tự do, kết quả là tính cảm quan của sản phẩm sẽ được bảo đảm trong thời gian từ 50-100 ngày. 3.5. Chế biến sữa Glucose oxidase, catalase Peroxidase,Lactoperoxidase dùng trong bảo quản sữa. SVTH: Nhóm 6 Trang 10 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 3.6. Công ngệ dệt Glucose oxidase, catalase, Lacase dùng để làm trắng, loại peroxide thừa trên sợi trước khi nhuộm màu, phân giải và oxy hóa chất màu. 3.7. Mỹ phẩm Trong thuốc nhuộm tóc, enzyme peroxydase tạo H 2O2 tại chỗ nồng độ thấp, không làm hại tóc. 3.8. Xử lý môi trường Loại bỏ H2O2 trong nước thải nhanh và có hiệu quả. Catalase (EC 1.11.1.6) xúc tác phản ứng đặc hiệu phân huỷ H2O2 [2]. Ngoài ra, catalase có thể phân huỷ formaldehyde, formic acid và alcohol - Các chất độc hại với môi trường, được thải ra trong nước thải của các nhà máy chế biến sữa, pho mát hoặc các nhà máy dệt, sợi. Catalase vi khuẩn có tác dụng tích cực trong việc phá hủy chúng. Trong các enzyme peroxidase thì catalase, peroxidase và manganese peroxidase được nghiên cứu nhiều phục vụ cho việc phát hiện một số ion kim loại độc cho môi trường như: Hg+2, Pb+2, Cd+2, Cr+6, Mn+2 [3]. Peroxidase củ cải ngựa (Horseradish peroxidase-HRP) có k. hiệu EC 1.11.1.7, tác động như catalase, xúc tác phản ứng đặc hiệu. HRP là một trong những enzyme được nghiên cứu nhiều nhất có liên quan tới phương pháp xử lý. rác thải bằng enzyme. HRP có thể SVTH: Nhóm 6 Trang 11 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ xúc tác phản ứng oxy hoá một phổ rộng các hợp chất thơm độc bao gồm phenol, biphenol, aniline, benzidine và các hợp chất thơm dị v.ng như hydroxyquinoline và arylamine carcinogen như benzidine và naphthylamine. Peroxidase được sử dụng để cải thiện quá trình khử nước bằng cặn phosphate L-galactonolactone oxidase (EC 1.1.3.24) có . nghĩa đối với việc xử lý ô nhiễm môi trường. Enzyme này xúc tác phản ứng đặc hiệu là phản ứng oxi hoá L-galactono-1,4lactone thành L-ascorbate Các enzyme polyphenol oxidase có khả năng xúc tác cho các phản ứng ôxy hoá các hợp chất phenol. Các enzyme này được chia thành hai phân họ: tyrosinase và laccase. Hoạt tính của cả hai họ đều cần sự có mặt của oxy phân tử nhưng không cần có mặt các coenzyme. Tyrosinase (EC 1.14.18.1) hay polyphenol oxydase, phenolase hay catecholase xúc tác cho hai phản ứng liên tiếp: phản ứng thứ nhất là phản ứng thuỷ phân monophenol nhờ oxy phân tử thành các o-diphenol và phản ứng thứ hai là phản ứng dehydrogen hoá các odiphenol nhờ oxy thành các o-quinon. Các quinon thường không bền và bị polime hoá không cần enzyme thu được các hợp chất không tan trong nước và dễ dàng bị loại bỏ nhờ kết tủa. Laccase (EC 1.10.3.2) là một enzyme kim loại xúc tác cho phản ứng oxi hoáhydroquinone thành benzoquinone Quá tr.nh tẩy trắng giấy được áp dụng rộng rãi trong công nghiệp nghiền bột giấy để loại bỏ các gốc lignin trong bột giấy. Các gốc này là nguyên nhân làm cho bột giấy có màu nâu và được loại bỏ mà ít tốn kém bằng cách dùng các chất tẩy trắng như chlorine và các oxid chlorine. Quá trình tẩy trắng tạo ra dịch lỏng có màu nâu đen chứa các sản phẩm bị chlorin hoá độc và có khả năng gây đột biến gây nguy hiểm đối với môi trường. Peroxidase và laccase có tác dụng tích cực trong việc xử l. dịch lỏng sau quá tr.nh tẩy nói trên và dạng cố định của các loại enzyme này trong mọi trường hợp đều hiệu quả hơn so với dạng tự do. SVTH: Nhóm 6 Trang 12 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 3.9. Định lượng thực phẩm Phân tích thành phần cholesterol, sulfite..trong thực phẩm. Dùng cholesterol oxydase, sau đó dùng catalase để chuyển hóa tiếp H 2O2 được tạo thành, và xác định formaldehyde được tạo thành. Sulfite thường dùng để bảo quản thực phẩm, nông sản, làm bất hoạt nhiều enzyme, ngăn ngừa tạo màu nâu, nếu nồng độ quá cao sẽ gây hại. Dùng sulfite oxydase, sau đó dùng NADP peroxydase để chuyển hóa H2O2 tạo thành. 3.10. Y học, chuẩn đoán bệnh Làm thuốc thử trong hóa phân tích, kháng khuẩn. Sử dụng glucose oxidase trong phương pháp đo hàm lượng glucose trong máu Những người bệnh tiểu đường cần phải kiểm tra hàm lượng glucose trong máu thường xuyên để xác định sự dao động của nồng độ glucose có thể tăng hay giảm trong máu từ đó đưa ra cách điều trị bệnh hợp lý. Gần đây, thiết bị cảm biến sinh học (Biosensor) được phát triển để dùng cho việc đo lường hàm lượng glucose, và glucose oxydase là một trong những enzyme chủ yếu mà biosensor có thể sử dụng. Sự định lượng chính xác hàm lượng glucose trong máu thì rất quan trọng trong sự chuẩn đoán và điều khiển sự tăng và giảm đường huyết. Phương pháp sử dụng thuốc thử trong đo lường hàm lượng glucose trong máu Phản ứng glucose oxidase kết hợp với một phản ứng phụ đã được sử dụng rộng rãi cho việc xác định glucose trong dung dịch sinh học. Nhiều phản ứng bổ trợ khác được phát triển để cải tiến toàn bộ hệ thống phản ứng đặc trưng hoặc giữ lại các đặc tính vốn có của glucose oxidase. Phương pháp sử dụng thuốc thử dựa vào 10 phản ứng chỉ thị màu của hydrogen peroxide mà nó kết hợp với 4-aminontipyrine để tạo một phức phenolic, phương pháp này được đề xuất đầu tiên bởi Trinder Phương trình phản ứng: Glucose Oxidas 1. Glucose + O2 + H2O ————> Gluconic Acid + H2O2 2. H2O2 + HBA + 4-AAP————> thuốc nhuộm Quinoneimine + H2O SVTH: Nhóm 6 Trang 13 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Phương trình 1: Glucose bị oxy hóa bởi glucose oxydase tạo ra gluconic acid và hydrogen peroxide Phương trình 2: Hydrogen peroxide phản ứng với HBA và 4-aminoantipyrine với sự hiện diện của enzyme Peroxidase hình thành nên 1 quinoneimine bắt màu đỏ. Cường độ màu tạo thành thì tương ứng với nồng độ glucose và có thể được đo lường bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng giữa 460-560nm. Chú thích: HBA = 4-hydroxybenzoic acid 4-AAP = 4-aminoantipyrine 4. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN Thu nhận GOD từ nấm mốc: chủng Penicilium: Pen. Notatum, Pen.chrysoenum, Pen.vitale và chủng Aspergillus: A. niger, 4.1. Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc Đem vật phẩm (mẫu vật đã để lên mốc) giã nhỏ, hòa vào trong 200ml nước cất vô trùng, hút 0.1 ml dịch cho vào đĩa petri có môi trường Czapek. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ 300C trong 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc đứng tách biệt dùng que cấy lấy một ít VSV cấy lên các đĩa petri khác, làm tương tự cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần chủng, dùng que cấy lấy một ít bào tử khuẩn lạc đó cấy vào ống thạch nghiêng. 4.2. Lên men sinh tổng hợp enzyme GOD Tiến hành lên men trong môi trường lỏng với thành phần (g/l): (NH4)2SO4 0.4; KH2PO4 0.4; MgSO4.7H2O 0,1; saccharose 100; peptone 15; CaCO3 40. Đun sôi môi trường cho tan hết, điều chỉnh pH 6.5 – 6.9. Lấy 70 ml môi trường vào mỗi bình nón 250 ml, hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút, làm nguội xuống nhiệt độ môi trường và cấy với 3 vòng que cấy VSV. SVTH: Nhóm 6 Trang 14 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Bình nón được nuôi 70h trên máy lắc với tốc độ 175 vòng/phút. Sau lên men, canh trường VSV được ly tâm 15 phút (5200 vòng/phút) để tách riêng phần lỏng và sinh khối VSV. 5.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH Nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật người ta thực hiện thử nghiệm oxidase. NGUYÊN TẮC:  Cytochrome oxidase trong chuỗi chuyền điện tử của hô hấp hiếu khí với oxy là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy ý.  Thuốc thử p-phenylenediamine.  Có sự hiện diện của cytochrome c khử trong tế bào: thuốc thử bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương. SVTH: Nhóm 6 Trang 15 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ 6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 6.1. Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry a. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước song 660nm. Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. b. Hoá chất cần dùng - Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000ml nước cất. - Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%. - Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi dùng). - Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N. - Albumin huyết thanh bò 1mg/ml c. Cách tiến hành - Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút. Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da trời và đạt đến cường độ mầu cực đại. Đem so mầu của hỗn hợp trên máy so mầu quang điện ở bước sóng 660nm. Xác định được trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình. SVTH: Nhóm 6 Trang 16 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ - Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm. d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn. Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120  g/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn. - Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm. - Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm. Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường. Ta có phương pháp hồi quy. y = 0,55066844x + 0,01791961 SVTH: Nhóm 6 Trang 17 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ OD 0,6 660 0,5 nm 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 mg 1,2 Hàm lượng protein Hình 1. Đường đồ thị xác định nồng độ Protein theo phương pháp Lowry Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. 7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOSE-OXIDASE 7.1. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp dựa vào đường cong chuẩn hydrogen peroxide 7.1.1Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme Glucose oxidase được đo bằng cách xác định hàm lượng hydrogen peroxide (H2O2) tạo thành trong phản ứng chuyển hoá đường glucose thành gluconic acid trong phản ứng sau : GOD GOD Glucose + SVTH: Nhóm 6 O2 gluconic acid + H2O2 Trang 18 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ POD H2O2+ α-dianisidine α-dianisidine + H2O Đường cong chuẩn hydrogen peroxide (H 2O2) được xây dựng để xác định hàm lượng Hydrogen peroxide (H2O2) trong phản ứng . Một đơn vị hoạt tính là lượng enzyme cần để tạo ra 1µ mol gluconic acid và H2O2 trong một phút ở điều kiện pH 5.1 và nhiệt độ 250C . 7.1.2 Dụng cụ - Hoá chất a. Dụng cụ − Ống nghiệm − Pipets − Quang phổ kế − Cuvettes b. Hoá chất & enzyme −Dung dịch Hydrogen peroxide (H2O2) chuẩn −Acid sulfuric (H2SO4) −Thuốc thử α-dianisidine −Enzyme Peroxidase (POD) −Enzyme Glucose oxidase (GOD) −Dung dịch Glucoses 7.1.3. Cách tiến hành Cho 0.1 ml (2mg/ml) glucose oxidase vào ống nghiệm chứa 2.9 ml dung dịchglucose (1 – 20mM) được pha trong dung dịch đệm acetate (pH 5.1). Phản ứngđược thực hiện ở nhiệt độ 250C trong thời gian 1 – 3 phút . Sau đó thêm vào 0.1ml (60U/ml) peroxidase (POD) và 2.4mlo-dianisidine (0.21mM) − POD là chất xúc tác cho phản ứng giữa Hydrogen peroxide (H2O2) và α-dianisidine SVTH: Nhóm 6 Trang 19 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ ( chất tạo màu). Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm vào 0.5ml dung dịch acid sulfuric 2.5M Đo mật độ quang OD 530nm (OD530) và xác định lượng hydrogen peroxide(H2O2) tạo ra dựa trên đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD530 và nồng độchuẩn hydrogen peroxide (H2O2). 7.1.4. Xây dựng đồ thị đường chuẩn H2O2 Pha loãng dung dịch hydrogen peroxide (H2O2)chuẩn theo các nồng độ khác nhau. Có thể cho trong bảng sau : Hóa chất H2O2 (ml) Nước cất (ml) Nồng độ ống 1 0,2 9,8 0,2 ống 2 0,4 9,6 0,4 ống 3 0,6 9,4 0,6 ống 4 0,8 9,2 0,8 ống 5 1,0 9,0 1,0 Từ các ống nghiệm trên lấy 2.4ml ở mỗi ống nghiệm vào 5 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 2.4mlo-dianisidine ( chất tạo màu) với 0.1ml (60U/ml) peroxidase (POD) chất xúc tác phản ứng. Sau đó cho vào 0.5ml H2SO4 2.5M để dừng phản ứng . Đo mật độ quang OD 530nm (OD530) và xây dựng đường chuẩn H2O2 . 7.1.5. Tính kết quả Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được lượng H2O2 tạo thành trong phản ứng enzyme . 7.2. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp chuẩn độ Đây là được sử dụng phương pháp phổ biến để xác định hoạt tính của GOD. Trong phương pháp này, 1 ml dung dịch enzyme được thêm vào 25 ml đệm CH3COONa 60 mM pH 5.6 chứa 2% β-D-glucose. Hỗn hợp được lắc 1h trong không khí ở 300C trên máy lắc, tốc độ 200 vòng/phút. Phản ứng dừng lại bởi thêm vào 20ml dung dịch NaOH 0.1N. Hỗn hợp đó đem chuẩn độ với dung dịch chuẩn HCl 0.1N. Mẫu trống (không có SVTH: Nhóm 6 Trang 20
- Xem thêm -