Tài liệu Tiểu luận công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................................. 3 PHẦN I. TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG CÂY TRỒNG .................................................................................................................................... 4 Khái niệm ............................................................................................................................................ 4 I. Các chất điều hòa sinh trưởng cây trồng chính ............................................................................. 4 1.1. Auxin............................................................................................................................................ 4 1.1.1. Phân loại ................................................................................................................................... 4 1.1.2 Quá trình trao đổi chất của auxin ............................................................................................. 4 1.1.3. Những ảnh hưởng của auxin đối với cây trồng ................................................................... 5 II. Gibberellin (GA) ............................................................................................................................ 7 2.1. Sinh tổng hợp gibberellin............................................................................................................ 7 2.2. Những ảnh hưởng sinh lý của gibberellin .................................................................................. 8 2.3. Ứng dụng của GA ....................................................................................................................... 9 III. Cytokinin....................................................................................................................................... 9 3.1. Nguồn gốc.................................................................................................................................... 9 3.2. Sinh tổng hợp cytokinin ............................................................................................................ 10 3.3. Những ảnh hưởng sinh lý của cytokinin .................................................................................. 11 II. GIỚI THIỆU VI KHUẨN AZOTOBACTER VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH. ......................................................................................................... 12 2.1. Đặc tính của vi khuẩn Azotobacter........................................................................................... 12 2.1.1. Hình thái học .......................................................................................................................... 14 2.1.2. Nang vi khuẩn......................................................................................................................... 14 2.1.3. Đặc tính vật lý: ....................................................................................................................... 14 2.2. Khả năng sản xuất các chất kích thích sinh trưởng và những tác động của chúng tới cây trồng............................................................................................................................................ 15 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG .......... 16 SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 1 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh III. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CÁC PHYTOHORMONE. ................................................................................ 17 3.1. Phân lập ................................................................................................................................... 17 3.2. Tuyển chọn các chủng VK Azotobacter sinh tổng hợp IAA ....................................... 18 3.3. Tuyển chọn chủng sinh Gibberelin ................................................................................... 18 3.4. Kiểm tra hoạt lực tổng hợp IAA của chủng vừa tuyển trọn trong thực tế ....... 19 3.5 Lên men thu sinh khối. ........................................................................................................ 20 3.6 Kiểm tra sinh khối ................................................................................................................ 21 IV. CHUẨN BỊ CHẤT MANG .................................................................................................. 22 4.1 Giới thiệu chung về chất mang. .......................................................................................... 22 4.2 Lựa chọn chất mang cho Azotobacter ................................................................................ 22 4.3. Xử lí chất mang ...................................................................................................................... 23 4.4 Cấy chủng ................................................................................................................................. 24 4.5 Bảo quản .................................................................................................................................. 24 4.6 Sử dụng ..................................................................................................................................... 24 PHẦN II. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG TỔNG HỢP RA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ............................................................................................................ 25 I. Phân lập, tuyển chọn chủng Pseudomonas tổng hợp ra chất kích thích sinh trưởng Auxin ........................................................................................................................................................... 25 1.1. Đặc điểm của chủng Pseudomonas sp .................................................................................. 25 1.2. Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas từ các mẫu khác nhau. .............................. 25 II. Phân lập và tuyển chọn chủng Azospirillum tổng hợp Auxin và Giberelin ....................... 30 2.1. Đặc điểm của Azospirillum .................................................................................................... 30 2.2. Phân lập và tuyển chọn Azospirillum từ cây mía ở tỉnh Cần Thơ(ĐH Cần Thơ nghiên cứu ) .................................................................................................................................................. 31 2.3. Phân lập và tuyển chọn Azospirillum từ mẫu đất rừng của quận Thanjavur, Tamil Nadu, Ấn Độ[6] .......................................................................................................................................... 32 PHẦN III. GIỚI THIỆU VỀ AZOTOBACTER ..................................................................... 35 1. Phân lập chủng Azotobacter spp từ đất .................................................................................... 35 SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 2 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh LỜI MỞ ĐẦU Cùng với việc gia tăng dân số mạnh mẽ là vấn đề về an ninh lương thực cho mỗi quốc gia và trên toàn thế giới, từ đó nảy sinh những yêu cầu cao hơn đối với nên nông nghiệp, nhằm nâng cao sản lượng, chất lượng của các sản phẩm nông sản phục vụ cuộc sống con người. Từ lâu, người nông dân đã sử dụng các loại phân bón hóa học như một công cụ hữu ích giúp nâng cao năng suất vụ mùa. Thực tế cho thấy, phân bón hóa học đã giúp cải thiện một cách đáng kể sản lượng lương thực thu được. Song mặt khác, việc sử dụng gia tăng phân bón hóa học trong sự mất cân đối nghiêm trọng giữa các yếu tố dinh dưỡng đã gây ra nhiều ảnh hưởng xấu đến hiệu quả sản xuất và môi trường sinh thái. Để phát triển nông nghiệp bền vững, cần phải có chiến lược an toàn dinh dưỡng cho đất và cây trồng: đó là bảo đảm cung cấp đủ liều lượng cần thiết các chất dinh dưỡng thiết yếu đúng lúc cây cần, theo tỷ lệ cân đối giữa các chất trong phân bón, phù hợp với yêu cầu từng loại cây trên các vùng đất trồng dưới các điều kiện thời tiết, khí hậu khác nhau: an toàn dinh dưỡng cho cây và đất trồng cũng có nghĩa bảo đảm và phát triển hệ sinh thái đất. Đất trồng không chỉ là tập hợp các nguyên tố hóa học, mà còn là một thế giới sống – nơi trú ngụ và sinh sống của hàng triệu triệu sinh vật, nơi từng giờ, từng phút diễn ra hàng loạt các phản ứng lý, hóa và sinh học. Thông qua các phản ứng lý, hóa, sinh học và các hoạt động của sinh vật sống, đất trồng mới có điều kiện để hồi phục và cân bằng thông qua các quy luật của tự nhiên. Nếu phá vỡ các quy luật này, đất sẽ bị hủy hoại và không phát huy được vai trò của nó. Bảo đảm an toàn dinh dưỡng cho cây và đất trồng không chỉ nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, giảm chi phí sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi sinh, môi trường thông qua việc tạo thế cân bằng trong tự nhiên, giảm bớt hóa chất độc sử dụng trong phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng. Chiến lược an toàn dinh dưỡng cho cây và đất trồng là sử dựng cân đối phân bón hóa học và phân bón sinh học cho cây trồng phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện đất đai, khí hậu trong đó phân bón sinh học có vai trò vô cùng quan trọng. Phân bón sinh học không chỉ cung cấp cho cây trồng các chất dinh dưỡng cần thiết mà còn góp phần duy trì độ phì nhiêu của đất trong quá trình canh tác, do vậy có vai trò rất quan trọng trong thâm canh. Phân bón sinh học là nhóm phân bón có nguồn gốc từ các chất liệu sinh học bao gồm các loại phân vi sinh vật, phân hữu cơ được chế biến thông qua quá trình lên men vi sinh vật. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 3 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh PHẦN I. TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG CÂY TRỒNG Khái niệm Phân vi sinh kích thích sinh trưởng là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống , có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng như: auxin (IAA), Cytokinin, GA, ethylene... kích thích sự phát triển của cây trồng nâng cao năng suất nông sản. I. Các chất điều hòa sinh trưởng cây trồng chính 1.1. Auxin 1.1.1. Phân loại Auxin có thể được chia thành 6 nhóm sau : - Những dẫn xuất indole: Indole-3-acetic (IAA) và Indole-3-butyric acid (IBA). - Những benzoic acid: 2,3,6-trichlorobenzoic acid và 2-methoxy-3-6- dichlorobenzoic acid (Dicamba). - Những chlorophenoxyacetic acid: 2,4,5 - trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) và 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). - Picolinic acid: 4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid (Tordon hay Pichloram). - Những naphthalene acid: α và β-naphthaleneacetic acid (α và β - NAA). - Những naphthoxyacetic acid: α và β-naphthoxyacetic acid (α và β- NOA). 1.1.2 Quá trình trao đổi chất của auxin - Sự tổng hợp IAA: Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm và cả ở vi khuẩn. Ở thực vật bậc cao IAA được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn và từ đó được vận chuyển xuống dưới với vận tốc 0,5- 1,5cm/h. Sự vận chuyển của auxin trong cây có tính chất phân cực rất nghiêm ngặt, tức là chỉ vận chuyển theo hướng gốc. Chính vì vậy mà càng xa đỉnh ngọn, hàm lượng auxin càng giảm dần tạo nên một gradien nồng độ giảm dần của auxin từ đỉnh ngọn xuống gốc của cây. Ngoài đỉnh ngọn ra auxin còn được tổng hợp ở các cơ quan còn non khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng, mô phân sinh tầng phát sinh. Quá trình tổng hợp auxin xảy ra thường xuyên và mạnh mẽ ở trong cây dưới xúc tác của các enzyme đặc hiệu. Axit β-Indol Axetic là loại auxin phổ SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 4 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh biến trong cây, được tổng hợp từ tryptophan bằng con đường khử amin, cacboxyl và oxy hóa. Công thức tổng quát của Axit β - Indol Axetic là C10H9O2N. - Sự phân hủy auxin: Sự phân hủy auxin cũng là một quá trình quan trọng điều chỉnh hàm lượng auxin trong cây. Auxin sau khi tác dụng có thể bị phân hủy làm mất hoạt tính hoặc trong trường hợp hàm lượng cao và dư thừa auxin có thể bị phân hủy để giảm hàm lượng. Sự phân hủy auxin trong cây chủ yếu xảy ra bằng con đường enzyme IAA-oxidase. IAA-oxidase hoạt động rất mạnh trong cây, đặc biệt trong hệ thống rễ. Dưới tác dụng xúc tác của IAAoxidase, IAA bị ôxy hóa và chuyển thành dạng mất hoạt tính là metilen oxindol. - Sự biến đổi thuận nghịch dạng tự do và dạng liên kết: IAA ở trong cây có thể tồn tại dưới hai dạng là dạng tự do và dạng liên kết. IAA tự do là dạng gây ra hoạt tính sinh lý ở trong cây. Tuy nhiên, trong tế bào IAA tự do chiếm một hàm lượng rất thấp so với dạng IAA liên kết. IAA liên kết ở trong cây là dạng chủ yếu, nhưng chúng không có hoạt tính sinh lý hoặc có hoạt tính sinh lý thấp. AIA liên kết chủ yếu với gluxit và với axit amin. Dạng liên kết của IAA có ý nghĩa rất lớn trong việc dự trữ IAA, làm giảm hàm lượng IAA tự do, tránh tác dụng của IAA-oxidase và cũng là dạng vận chuyển auxin trong cây. Nhờ ba quá trình trao đổi chất tiến hành đồng thời của auxin ở trong cây mà hàm lượng auxin trong cây tương đối ổn định bảo đảm sự sinh trưởng, phát triển của các cơ quan và cơ thể cây hài hòa, không bị rối loạn. Bằng con đường tổng hợp hóa học, hàng loạt hợp chất có bản chất tương tự auxin lần lượt ra đời và có ý nghĩa quan trọng trong việc điều chỉnh sinh trưởng của cây. Có nhiều chất quan trọng như: α-NAA; IAA; IBA; 2,4D; 2,4,5T... 1.1.3. Những ảnh hưởng của auxin đối với cây trồng Auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Vài ảnh hưởng auxin điều hòa các quá trình sinh lý của thực vật có thể kể đến như sau: quan trọng của  Vươn dài tế bào: Các bước ảnh hưởng lên sự vươn dài do auxin tác động có thể tóm tắt như sau: - Giảm tính chống chịu của vách tế bào đối với sức căng. Điều này gây ra do sự bẻ gãy những liên kết không cộng hóa trị giữa xyloglucans và cellulose trong vách tế bào. - Có một sự thay đổi về những chế độ nước với tế bào. Ngay cả khi áp suất thẩm thấu trong tế bào không thay đổi, thế năng nước trong tế bào được xử lý với auxin trở nên yếu hơn do sự giảm thế năng áp suất. - Sự giảm thế năng nước cho phép nước di chuyển vào bên trong tế bào và tạo ra một áp suất về phía vách tế bào có tính dẻo tạo ra sự vươn dài. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 5 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh - Khi sự vươn dài hoàn tất, những liên kết không cộng hóa trị giữa polysaccharide tái lập trở lại. Quá trình này không thuận nghịch. cellulose và những  Quang hướng động: Quang hướng động là sự phát triển của một mô thực vật hướng về phía sáng do sự đáp ứng với thông lượng trực tiếp hoặc gradient. Theo giả thuyết Cholodny - Went thì ánh sáng chiếu từ một phía sẽ gây ra sự di chuyển của auxin về phía tối, do đó nồng độ auxin về phía tối cao hơn phía được chiếu sáng. Sự phân phối auxin không đều được xem là nguyên nhân gây ra sự nghiêng.  Địa hướng động: Là sự hướng động của một cơ quan thực vật đáp ứng với trọng lực. Nếu một câyđược đặt nằm ngang, chồi của nó sẽ nghiêng lên phía trên ngược chiều với trọng lực (địa hướng động âm), trái lại rễ sẽ nghiêng xuống theo chiều của trọng lực (địa hướng động dương). Theo thuyết Cholodny-Went về địa hướng động thì thân và rễ đáp ứng với trọng lực tích lũy IAA về phía thấp hơn. Trong thân IAA kích thích sự sinh trưởng trên mặt đáy của thân và làm cho thân nghiêng về phía trên. Khi cắt chóp rễ đi thì khả năng đáp ứng của rễ đối với trọng lực bị mất đi và khi đặt chóp rễ trở lại thì tính địa hướng động được phục hồi.  Ưu thế chồi ngọn: Chồi ngọn được biết là nguyên nhân khống chế sự phát triển của chồi bên. Khi cắt chồi ngọn, chồi bên sẽ phát triển. Tuy nhiên theo thời gian, chồi bên phát triển trội lên và ức chế sự phát triển của những chồi bên mọc sau. Sau khi auxin được phát hiện, hàm lượng cao của nó trong đỉnh chồi cũng đã được ghi nhận. Ưu thế chồi ngọn đã được ghi nhận ở nhiều loài thực vật và được điều khiển bởi chất điều hòa sinh trưởng.  Sự tượng rễ: Julius Von Sachs (1880) cho rằng trong lá non và những chồi hoạt động có chứa một chất điều hòa sinh trưởng có khả năng dẫn truyền và kích thích sự tượng rễ. IAA cũng đã được biết là chất có khả năng kích thích sự tượng rễ của cành giâm và cũng đã cho thấy khả năng ứng dụng trong thực tiễn. Những auxin tổng hợp thường được dùng thay vì IAA tự nhiên vì chúng không bị phân hủy bởi enzyme IAA oxidase hay những enzyme khác và sẽ tồn tại trong mô trong một thời gian dài. Áp dụng auxin ngoại sinh có thể kích thích sự tượng rễ và sự phát triển sớm của rễ, trái lại sự vươn dài của rễ nói chung bị ức chế trừ khi áp dụng với nồng độ đủ nhỏ. Sự ức chế sinh trưởng của auxin thường có liên quan đến sự kích thích sinh tổng hợp ethylene.  Sự sản sinh ethylene: Sự kích thích sản sinh ethylene gây ra do auxin được ghi nhận đầu tiên trên cà chua bởi Zimmerman và Wilcoxon (1935). Ngày nay, auxin đã được biết là chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự sinh tổng hợp ethylene trên nhiều loài thực vật như đậu xanh, lúa, cỏ lồng vực…  Sự phát triển trái: Sự gia tăng kích thước trái chủ yếu do sự nở rộng của tế bào gây ra. Auxin có liên quan đến sự nở rộng của tế bào và đóng vai trò cơ bản trong việc quyết định sự phát triển của trái. Vai trò mạnh mẽ của auxin trong sự phát triển của trái gồm hai yếu tố. Thứ nhất là mối quan hệ giữa sự phát triển hột với kích thước cuối cùng và hình dạng trái. Thứ hai là việc áp dụng auxin lên trái nào đó ở những giai đoạn đặc thù của sự phát SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 6 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh triển sẽ gây ra sự đáp ứng. Ví dụ ở dâu tây, nội phôi nhủ và phôi trong bế quả sản xuất auxin, nó di chuyển ra ngoài và kích thích sự sinh trưởng. Vị trí của bế quả trên trái có một ảnh hưởng lớn đến hình dạng trái. Bế quả dâu tây nằm bên ngoài đế hoa thịt quả và dễ dàng tác động. Khi tách tất cả bế quả thì trái không phát triển. Tuy nhiên, nếu tách tất cả bế quả và áp dụng auxin lên đế hoa thì trái phát triển bình thường.  Sự rụng: Nếu cắt bỏ phiến lá non thì lá sẽ dễ rụng. Tuy nhiên cuống lá sẽ không rụng nếu được xử lý auxin như IAA. Sự rụng lá là do sự thành lập tầng rời và hiện tượng này bị chi phối bởi auxin. Sự rụng sẽ gia tăng khi lượng auxin nội biên bằng hoặc lớn hơn auxin ngoại biên. Xử lý auxin về phía lá của tầng rụng làm giảm sự lão hóa, về phía thân của tầng rụng kích thích sự lão hóa và gây ra sự rụng. Sự giảm auxin nội sinh trong lá hoặc các cơ quan khác của cây sẽ gây ra sự rụng. Việc xử lý NAA hay 2,4 D cũng làm giảm sự rụng trái.  Sự thể hiện giới tính: Việc xử lý auxin có thể làm thay đổi giới tính của hoa trên một số loài cây và sự thay đổi giới tính này được ghi nhận có liên quan đến sự kích thích sinh tổng hợp ethylene. Khi xử lý auxin ngoại sinh đã làm tăng số lượng hoa cái trên họ bầu bí. II. Gibberellin (GA) 2.1. Sinh tổng hợp gibberellin Nói chung người ta chấp nhận rằng gibberellin được tổng hợp từ mevalonic acid trong những chồi non đang sinh trưởng tích cực và hột đang phát triển. Chu trình mevalonic acid không chỉ có liên quan đến sinh tổng hợp gibberellin mà còn liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, abscisic acid và brassinosteroid (hình 3.6). Sau khi mevalonic acid biến đổi thành mevalonicacid pyrophosphate rồi thành isopentenyl pyrophosphate sẽ tách ra theo hướng tổng hợp cytokinin, abscisic acid và con đường khác theo các bước tiếp theo để tạo thành ent-kaurene sẽ dẫn đến sự thành lập các phân tử gibberellin. Quá trình tổng hợp gibberellin có thể bị ức chế bởi các chất làm chậm sinh trưởng trong bước chuyển hóa từ geranylgeranyl pyrophosphate thành copyl pyrophosphate. Các chất làm chậmsinh trưởng gốc pyrimidine, triazole, tetcyclacis và inabenfide cũng ức chế sự biến đổi từ entkaurene thành ent-kaurenol, từ ent-kaurenol thành ent-kaurenal, từ ent-kaurenal thành entkaurenoic acid. Quá trình sinh tổng hợp gibberellin của nấm G.fujikuroi và thực vật bậc cao có thể chia thành 3 giai đoạn chính: - Chuyển hóa mevalonic acid thành ent-kaurene. - Chuyển hóa ent-kaurene thành gibberellin prototype, GA12-aldehyde. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 7 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh - Chuyển hóa GA12 - aldehyde thành C20-, rồi thành C19 - GA với con đường không 13-hydroxyl hóa và con đường 13-hydroxyl hóa sớm ở các vị trí khác nhau và sau cùng thành các dạng GA khác nhau. 2.2. Những ảnh hưởng sinh lý của gibberellin Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở những chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả nhất. Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa. - Ảnh hưởng trên sự phát triển của thực vật sống: Các gibberellin đã biết đều có khả năng kích thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích vươn dài của GA thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng thành hay cơ quan đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi. Nhìn chung, GA kích thích sự sinh trưởng của nhiều loài cây đặc biệt là những cây lùn. Khác với auxin, ảnh hưởng vươn dài của GA lên thực vật sống thì rõ hơn trên các đoạn mẫu được cắt. Thực vật đáp ứng với các loại gibberellin khác nhau cũng khác nhau. Đối với trục hạ diệp rau diếp, ảnh hưởng kích thích sự vươn dài của GA8 không rõ nét, ảnh hưởng kích thích sự vươn dài của GA4, GA1 và GA3 mạnh dần và GA9 lại có ảnh hưởng mạnh hơn cả. Trong một vài trường hợp thì ảnh hưởng kích thích sự vươn dài trục hạ diệp dưa leo của gibberellin cũng kém hiệu quả. - Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: Có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp GA đã được phát hiện. Đây là tính trạng đơn gene, kích thước của cây biến dị có thể chỉ bằng một phần năm cây bình thường và sự lùn chủ yếu là do lóng bị ngắn lại. Các dạng đột biến lùn như đột biến bắp lùn (Zea mays L.) d1 và d5 và lúa lùn (Oryza sativa L.) Tan-ginbozu và WaitoC. GA nội sinh kiểm soát hoạt động của bắp và lúa là GA1. Việc xử lý GA ngoại sinh làm cho các cây này cao trở lại bình thường. Cũng có những dạng đột biến lùn không đáp ứng với việc áp dụng gibberellin ngoại sinh và cây vẫn lùn sau khi xử lý. - Ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hột và miên trạng: Hiện nay GA được biết là những chất có khả năng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng trên nhiều loại cây trồng. GA có thể kích thích hoạt động của các enzyme thủy phân hydrolase trong hột ngũ cốc. GA ngoại sinh tác động lên lớp aleurone của hột ngũ cốc và kích thích sự sản sinh enzyme α-amylase để tác động lên sự phân hủy tinh bột thành đường đơn. Tác động này có tác dụng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng. Khoai tây có thể nảy mầm sớm khi xử lý với GA3. GA cũng có thể kích thích sự nảy mầm của hột rau diếp mà không cần xử lý ánh sáng đỏ. GA cũng có thể thay thế điều kiện nhiệt độ thấp hoặc ngày dài để phá vỡ miên trạng. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 8 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh - Ảnh hưởng lên sự trổ hoa: Gibberellin có khả năng thúc đẩy quá trình trổ hoa trong nhiều loài thực vật. Đối với những cây cần yêu cầu ngày dài hay trải qua điều kiện lạnh trước trổ hoa thì khi xử lý GA trong những điều kiện không cảm ứng chúng sẽ tượng hoa và trổ hoa. Ảnh hưởng này có liên quan đến sự kích thích quá trình phân chia tế bào và vươn dài tế bào. - Ảnh hưởng lên sự phân hóa giới tính, đậu trái và lão hóa: GA có thể làm thay đổi giới tính của hoa tương tự như auxin, cytokinin và ethylene. Tuy nhiên, GA có hiệu quả ngược với auxin và ethylene. GA làm tăng số hoa đực trên dưa leo. GA cũng gây nên hiện tượng trình quả sinh và tạo nên trái không hột. GA cũng giúp cho trái to và trì hoãn sự lão hóa. Các loại trái nho không hột ở Nhật, Úc, Mỹ và châu Âu thường có xử lý GA3. Bằng cách giảm lão hóa, GA giữ cho vỏ trái cam quít tươi lâu hơn, chậm mềm khi chín và kéo dài thời gian bảo quản hơn. GA cũng làm cho vỏ táo đẹp hơn, cây kiểng trổ hoa sớm và tập trung. GA3 cũng có thể giúp quá trình sản xuất malt trong công nghiệp sản xuất bia hiệu quả hơn và ngắn hơn 2-3 ngày. 2.3. Ứng dụng của GA - Kích thích tăng chiều cao, tăng sinh khối. - Tăng năng suất và tạo quả không hạt. - Phá bỏ sự ngủ nghỉ của hạt, củ. - Điều chỉnh giới tính III. Cytokinin. 3.1. Nguồn gốc Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin(6-furfurylaminopurine). Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA tinh trùng cá trích được thanh trùng và được gọi là kinetin bởi vì nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân bào (cytokinensis) trong mô lõi thuốc lá. Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên được phân lập đầu tiên từ hột bắp non và được gọi làzeatin(6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino)purine). Ngày nay, hầu hết cytokinin được tìm thấy trong cây là zeatin (hình 3). SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 9 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Hình 3. Cấu trúc của Zeatin Hiện nay, có nhiều cytokinin tổng hợp được biết. Có 3 chất thông dụng là kinetin (6furfurylaminopurine), BA (6-benzylaminopurine), và BPA (6-benzylamino)-9-(2tetrahydropyranyl)-9H-purine) (hình 4). Cytokinin đã được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và không ký sinh, vi khuẩn, và cũng có trong phần lớn tRNA của vi sinh vật và tế bào động vật. Hiện tại có hơn 200 cytokinin tự nhiên và tổng hợp đã được phát hiện. Hình 4. Cấu trúc của 6-(furfurylamino)purine (Kinetin), benzylaminopurine và BPA (6benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine) 3.2. Sinh tổng hợp cytokinin Cytokinin có nhiều nhất trong miền phân sinh và vùng phát triển có hiệu quả liên tục bao gồm rễ, lá non,trái đang phát triển và hột. Chúng được xem là được tổng hợp ở rễ và vận chuyển đến chồi bởi vì có nhiều báo cáo cho thấy rằng cytokinin được tìm thấy ở nhựa gỗ. Tuy nhiên, cytokinin đã được tìm thấy nhiều trong mô của trái và hột cho thấy rằng chúng có thể được tổng hợp ở đó. Sự sinh tổng hợp cytokinin liên quan đến các bước khởi đầu của chu trình mevalonic acid đến isopentenyl phosphate (hình 3.6). SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 10 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Bước tiếp theo, isopentenyl sẽ kết hợp với AMP để tạo thành isopentenyl AMP. Chất này sau đó được biến đổi thành isopentenyl adenosine theo sau bởi một loạt phản ứng khác để tạo thành cytokinin. 3.3. Những ảnh hưởng sinh lý của cytokinin - Phân chia tế bào và tạo thành cơ quan: Vai trò chính của cytokinin trong cây là kích thích sự phân chia tế bào. Callus có thể được tạo thành ban đầu chỉ cần auxin hoặc cytokinin riêng lẽ. Tuy nhiên để duy trì sự phát triển của callus, sự kết hợp của auxin và cytokinin tỏ ra cần thiết. Tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ ảnh hưởng lên sự tạo callus, rễ hay chồi . Khả năng tái sinhcây từ callus là một công cụ kỹ thuật sinh học thông thường dùng để chọn lọc những cây kháng với điều kiện khô hạn, stress do mặn, bệnh, thuốc cỏ hay những yếu tố khác. - Sự nảy mầm, sự mở rộng của tế bào và cơ quan: Kinetin có thể giúp hột rau diếp nảy mầm vượt qua ảnh hưởng ức chế của ánh sáng đỏ xa. Cytokinin được biết là chất kích thích sự phân chia tế bào, tuy nhiên vẫn có những trường hợp thấy được ảnh hưởng của cytokinin lên sự mở rộng của tế bào. Cytokinin kích thích sự mở rộng tế bào trục hạ diệp được cắt từ cây củ cải, bí rợ, cây lanh và nhiều cây song tử diệp khác. Sự mở rộng của tế bào là do sự hấp thu nước gây ra do sự giảm thế năng thẩm thấu của tế bào được kích thích bởi sự biến đổi trở lại của lipid dự trữ trong trục hạ diệp thành đường khử (glucose và fructose). - Sự tượng rễ và sự phát triển rễ: Cytokinin có thể kích thích hoặc ức chế sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử lý. Kinetin có thể kích thích sự gia tăng trọng lượng khô và sự vươn dài của rễ cây đậu lupin con, trái lại hai yếu tố trên bị ức chế ở nồng độ kinetin cao. Khi kinetin được xử lý lên rễ ở nồng độ thấp, nó kích thích quang hợp và sinh trưởng. Tuy nhiên nếu rễ tiếp xúc với 0,47 µM kinetin hơn hai ngày thì sinh trưởng của rễ và toàn cây sẽ bị giảm rõ rệt. - Sự phát triển nụ và chồi: Cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn. Bằng công nghệ di truyền người ta đã làm gia tăng được sự sinh tổng hợp cytokinin trong cây thuốc lá và Arabidopsis. Một gene của vi khuẩn giải mã enzyme isopentenyl AMP synthase, một enzyme đáp ứng với quá trình sản sinh cytokinin, cùng với kích thích gây sốc nóng đã đưa được gene này vào cây thuốc lá và Arabidopsis. Gene mới này được hoạt hóa bằng cách cho cây chuyển gene vào điều kiện nhiệt độ 40-450C trong một thời gian ngắn và kết quả là làm gia tăng hàm lượng zeatin riboside monophosphate, zeatin riboside và zeatin lần lượt là 23, 46 và 80 lần. Một ví dụ khác là việc đưa một gene giải mã enzyme biến đổi IAA tự do thành một amino acid liên hợp bất hoạt. Dưới ảnh hưởng của gene này, IAA tự do bị giảm, do đó kích thích chồi bên phát triển. Ưu thế chồi ngọn được điều khiển bởi sự cân bằng giữa mức độ cytokinin và auxin nội sinh. Có hai giả thiết về mối quan hệ của cytokinin lên SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 11 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh ưu thế chồi ngọn. Giả thiết thứ nhất cho rằng cytokinin có thể ức chế enzyme IAA oxidase trong chồi bên và do đó cho phép tích lũy auxin và gây ra sự vươn dài của chồi bên. Giả thiết thứ hai là cytokinin có thể khởi đầu cơ chế liên quan đến sức chứa ở chồi bên bằng cách kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng, vitamin, khoáng và những chất sinh trưởng khác để tác động lên sự sinh trưởng. - Trì hoãn sự lão hóa và kích thích sự vận chuyển chất dinh dưỡng và những hợp chất hữu cơ: Cytokinin có thể giúp làm giảm quá trình lão hóa khi tách lá ra khỏi thân cây và hoạt động như là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để giảm lão hóa. Cytokinin cũng có khả năng thay thế ảnh hưởng của ánh sáng và làm giảm sự lão hóa bằng cách duy trì nguyên vẹn màng tonoplast (màng bán thấm bao quanh không bào). Khi cytokinin được xử lý lên lá cây úa vàng hoặc tử diệp vài giờ trước khi đưa ra ánh sáng, tiền lạp thể sẽ được chuyển hóa thành lục lạp và kết quả là có sự gia tăng sự sản sinh diệp lục tố. Cytokinin cũng làm giảm sự lão hóa của hoa cắt cành và rau tươi. Kinetin có khả năng kích thích sự vận chuyển của những hợp chất hữu cơ trong lá đã cắt và giữ trong tối. Khả năng của cytokinin kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng và tạo ra sức chứa đã được biết trên nhiều loài. II. GIỚI THIỆU VI KHUẨN AZOTOBACTER VÀ ỨNG DỤNG NGHIỆP SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH. TRONG CÔNG 2.1. Đặc tính của vi khuẩn Azotobacter Azotobacter thuộc nhóm vi khuẩn di động (motile), có dạng hình cầu hoặc ovan, thường hình thành các nang có vỏ rất dầy và tiết ra một lượng lớn chất nhờn bao quanh. Chúng là vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất, có đóng góp quan trọng vào chu trình N2 trong tự nhiên bằng cách cố định N2 không khí_ dạng mà cây không hấp thụ được, rồi chuyển hóa thành muối amoni trong đất. Con người đã lợi dụng các đặc điểm có lợi của Azotobacter để sản xuất phân bón vi sinh, các chất phụ gia thực phẩm và một vài loại polymer sinh học. Đại diện đầu tiên của loài VK này là chủng Azotobacter chroococum, được phát hiện và miêu tả lần đầu vào năm 1901 bời nhà vi sinh vật học người Hà Lan Martinus Beijerinck. Azotobacter là vi khuẩn Gram âm, ta có thể dễ dàng phân lập chúng từ các nguồn đất trung tính hoặc kiềm, nước và một số loài thực vật. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 12 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Domain: Bacteria Kingdom: Bacteria Phylum: Proteobacteria Class: Gammaproteobacteria Order: Pseudomonadales Family: Pseudomonadaceae/Azotobacterace-ae Genus: Azotobacter Tên chủng: Azotobacter agilis Azotobacter armeniacus Azotobacter sp. AR Azotobacter beijerinckii Azotobacter chroococcum * Azotobacter sp. DCU26 Azotobacter sp. FA8 Azotobacter nigricans Azotobacter paspali Azotobacter salinestris Azotobacter tropicalis Azotobacter vinelandii * * : Chủng có khả năng sinh tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cytokinin, giberellin ) được công bố trong các tài liệu kèm theo. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng (auxin, 13 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh 2.1.1. Hình thái học Tế bào Azotobacter tương đối lớn hơn so với vi khuẩn nói chung (đường kính khoảng 1-2 micromet). Thường thì chúng có dạng hình oval, nhưng cũng có thể có nhiều hình dạng khác, từ hình que đến hình cầu. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi, ta có thể thấy chúng phân tán hay co cụm thành đám, đôi khi lại hình thành các chuỗi dài ngắn khác nhau. Trong canh trường non, các tế bào trở nên di động nhờ vào đuôi flagella. Khi tế bào già đi, chúng mất dần khả năng di động, trở nên dạng hình cầu và sản sinh ra lớp dịch nhầy, sau tạo thành vỏ tế bào. Hình dạng của tế bào được quyết định bởi a.a Glycine có mặt trong canh trường peptone. Ngoài ra, khi quan sát canh trường còn nhìn thấy nhiều thể vùi, một số có màu sắc. Vào khoảng những năm 1900, những thể vùi có màu được cho là các hạt tái sinh “ reproductive grains”. Tuy nhiên, sau này người ta nhận ra rằng những hạt đó không tham gia vào quá trình phân chia tế bào , mà đó là volutin, còn những thể vùi không màu là giọt chất béo, giúp vi khuẩn dự trữ năng lượng. 2.1.2. Nang vi khuẩn Các nang của vi khuẩn Azotobacter giúp chống chịu một số yếu tố môi trường có hại, độ khô, sóng siêu âm và đặc biệt là tia UV, nhưng lại không chịu được nhiệt độ cao. Sự tạo nang xảy ra khi có sự thay đổi nồng độ một số chất dinh dưỡng trong môi trường và việc thêm vào các chất hữu cơ như etanol, n-butanol hay beta-hydroxybutyrate. Dạng nang hiếm khi hình thành trong môi trường lỏng, khi tạo nang thì kèm theo nhiều thay đổi trong đường hướng trao đổi chất, hô hấp… Bản chất của nang chính là dạng tế bảo sinh dưỡng ở trạng thái ngủ; tuy nhiên, trong khi những tế bào sinh dưỡng bình thường nhân lên thì nang Azotobacter không có khả năng này, tựa như việc hình thành bào tử của nhiều loài VSV khác nhằm chống chọi khi điều kiện môi trường không thuận lợi (pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng…). Khi nang nẩy chồi, những tế bào sinh dưỡng mới này tăng sinh bằng hình thức phân chia giản đơn. Quá trình này diễn ra khá chậm, mất khoảng 4-6 giờ, sau đó tốc độ tăng dần, các tế bào bắt đầu hấp thu O2 và thải CO2. 2.1.3. Đặc tính vật lý: Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí, pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng khoảng 7.0 – 7.5, tuy nhiên chúng vẫn tồn tại ở dải pH từ 4.8 tới 8.5. Nhiệt độ phù hợp khoảng 20 – 30oC. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 14 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Trạng thái khuẩn lạc: dẹt, nhầy, đường kính khoảng 5-10 mm, có thể tạo thành màng trong canh trường lỏng. Màu sắc khuẩn lạc có thể là nâu đen, xanh lá cây hoặc đôi khi không có màu, tùy thuộc vào từng chủng cụ thể. 2.2. Khả năng sản xuất các chất kích thích sinh trưởng và những chúng tới cây trồng tác động của Chất kích thích sinh trưởng, hay hormone thực vật là những hợp chất tự nhiên được tạo ra bởi các vi sinh vật và cây cối, có tác dụng kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh hóa trong cây và bản thân VSV. Brakel và Higer (1965) đã chỉ ra rằng loài vi khuẩn Azotobacter có thể sản sinh ra indo -3-acetic acid (IAA) khi thêm trytophan vào canh trường nuôi cấy. Vancura và Macura (1960), Burlingham (1964) và Hennequin (1966) mặt khác chỉ tìm thấy một lượng nhỏ IAA trong canh trường khi không có mặt tryptophan. Ba hợp chất giống với Gibberelin cũng đã được kiểm tra bởi 2 nhà khoa học Brown và Burlingham (1968) trên chủng Azotobacter Chroococum. Sau 14 ngày, lượng chất tăng tương ứng từ 0.01 đến 0.1 g GA3/ml. Các chủng vi khuẩn Azotobacter tự tổng hợp auxin, cytokinin và những chất tương tự GA, có vai trò điều khiển sự phát triển của cây cà chua (Jackson et al.,1964; Barea và Brown, 1974; Azcorn và Barea , 1975). Những hormone này có khả năng kích thích sự sinh trưởng của rễ cây, chúng được hình thành không chỉ trong cây mà còn từ vùng đẩt rễ _ nơi có vi khuẩn Azotobacter sinh sống. Rất nhiều đề tài đã chứng minh sự hiện diện của các phytohormone này trong canh trường nuôi cấy và các nhà khoa học đã đo đạc được sự ảnh hưởng của nó lên cây trồng: Reliv et al. (1987), Martinez Toledo et al. (1989), Salmeron et al. (1990) và Gonzales Lopez et al. (1991). Một nghiên cứu được thực hiện bởi Govedarica và cộng sự (1993) trên 9 chủng Azotobacter Chrocoocum phân lập từ đất bùn đen đã cho thấy khả năng sinh tổng hợp auxin, gibberelin và phenol, làm tăng chiều cao cây cà chua, khối lượng và hàm lượng N trong cây. Các chủng được phân lập từ vùng rễ củ cải đường lại cho một lượng Gibberelin vào khoảng 0.003- 0.1 g/cm3 canh trường (Miliv và Markova-ki, 1995). Nhưng tiến bộ trong sinh học phân tử gần đây giúp cải tiến nhiều kỹ thuật phân tích, gia tăng độ nhạy, cho phép đo đạc chính xác hơn sự có mặt và lượng phytohormone mà VSV tạo ra. Thêm vào đó, rất nhiều quá trình sinh trưởng của thực vật không chỉ bị điều hòa bởi 1 hormone mà do tác động của nhiều chất điều hòa khác. (Barendse và Peter, 1995; Voasenek và Blom, 1996). SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 15 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG Chất mang Phân lập, tuyển chọn VSV Xử lý Lên men sinh khối Nghiền mịn Thu sinh khối hỗn hợp, kiểm tra sinh khối và mật độ tế bào Đóng bao Thanh trùng Tiêm dịch Hỗn hợp Ủ sinh trưởng Bảo quản, sử dụng SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 16 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh III. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CÁC PHYTOHORMONE. 3.1. Phân lập Từ nhiều mẫu đất khác nhau (trồng lúa, trồng màu, đất bỏ hoang). Hong khô,nghiền mịn ta tiến hành pha loãng với các hệ số pha loãng khác nhau.Trang trên hộp peptri chứa o môi trường Burk đặc pH=7.2-8.2, 28-30 C để 2-3 ngày đem quan sát khuẩn lạc. Các môi trường phân lập: (1) Môi trường Burk K2HPO4 0.08 g KH2PO4 0.02 g MgSO4.7H2O 0.02 g NaCl 0.02 g CaSO4 0.01 g Fe – Mo mixture 0.1 ml Sucrose 2.0 g H3BO3 10.0 µg ZnSO4.7H2O 10.0 µg MnSO4.4H2O 1.0 µg CuSO4.5H2O 0.30 µg KI 0.10 µg Nước cất 100 ml Agar 2.0 g (2) Fe - Mo mixture FeCl3.6H2O Na2MoO4.2H2O Nước cất 1,45 g 0,253 g 100 ml (3) Môi trường Thompson – Sherman K2HPO4 MgSO4 CaCl Na2MoO4 Glucose Nước máy 1g 0,2 g 0,1 g 0,001 g 10 g 1000 ml Kết quả phân lập được một số chủng VK, cấy chuyển các chủng VK vào ống thạch nghiêng môi trường Burk SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 17 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Kiểm tra các chủng VK phân lập thuộc chi Azotobacter bằng cách quan sát hình thái hoặc dùng sinh học phân tử. Qua một nghiên cứu cụ thể của ĐH Đà Nẵng người ta nhận thấy có 4 loài: A.chroococcum; A.beijerinckii; A.vinelandii; A. agilis . Khi nuôi trong môi trường thạch,vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan,lúc đầu không màu, sau biền thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen nhưng không làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc.Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhãn nheo,khuẩn lạc có màu vàng lục,màu hồng. 3.2. Tuyển chọn các chủng VK Azotobacter sinh tổng hợp IAA Từ các chủng VK phân lập được, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA, dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Salkowski (2 ml of 0.5 M FeCl3+ 98 ml 35% HClO4). Cường độ máu tỉ lệ thuận với nồng độ IAA. Tiến hành: Phản ứng màu giữa thuốc thử Salkowski và IAA Nuôi cấy Azotobacter trên môi trường lỏng, bổ sung 0,1% tryptophan nuôi lắc o o 220v/p, 5 ngày, t = 28- 30 C Lấy 2ml dịch vi sinh vật đã li tâm loại bỏ tế bào 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, lắc đều Hàm lượng IAA thô được xác định theo phương pháp so màu ở 530nm với đồ thị chuẩn IAA Quan sát màu của các ống nghiệm phản ứng .3. Tuyển chọn chủng sinh Gibberelin Qua quá trình thử trên ta lựa chọn được chủng A.chroococcum sinh tổng hợp IAA mạnh nhất. Ngoài kiểm tra khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng ta con kiểm tra khả năng tổng hợp Gibberellins vi một số chủng Azotobacter có khả năng tổng hợp Gibberellins. Phương pháp tiến hành như sau: SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 18 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh 0 . Dịch nuôi cấy ở 28 C trong 3 ngày Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vào flask 250 ml Tính nồng độ Gibberelins (tỷ lệ với cường độ màu) Cho 15 ml axit phosphomolybdic Đo cường độ màu ở 780 nm Đun sôi 1 h và làm nguội về nhiệt độ phòng Bổ sung nước cất đến 25 ml Qua kiểm tra thấy chủng A.chroococcum tổng hợp IAA mạnh nhất lại có khả năng tổng hợp cả Gibberellins. Như vậy ta sẽ chọn A.chroococcum làm đối tượng để sản xuất. 3.4 thực tế Kiểm tra hoạt lực tổng hợp IAA của chủng vừa tuyển trọn trong Sau 24h, hạt đậu đen được xử lý bằng dịch nuôi cấy của chủng A.chroococcum ở nồng -2 -3 -2 độ pha loãng 10 và 10 . Sau 72h, tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ pha loãng 10 vượt 23% so với đối chứng. Như vậy dịch nuôi cấy của chủng A.chroococcum đã kích thích và rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt giống. Vì vậy, có thể ứng dụng chủng này để xử lý hạt giống trước khi gieo. SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 19 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Đối chứng Xử lý bằng dịch ở nồng độ 10 -2 3.5 Lên men thu sinh khối. - Từ chủng VSV tuyển chọn ta tiến hành nhân sinh khối VSV theo phương pháp lên men chìm trong môi trường Burk lỏng có sục khí và bổ sung N (cao nấm men, pepton hay axit amin). - Chuẩn bị môi trường. Pha môi trường, điều chỉnh pH thích hợp với chủng rồi thanh trung môi trường. Sinh khối VSV được nhân qua cấp 1,2 trong các điều kiện phù hợp với từng chủng VSV và mục đích sản xuất. Giống trong ống thạch Hoạt hóa giống Nhiệt độ 20 – 30oC pH 7.0 – 8.0 Sục khí, khuấy Khuấy Áp suất Áp suất thường Lên men thu nhận giống SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 20