Tiến sĩ hóa học nghiên cứu hóa học cây thuốc việt nam có hoạt tính kháng tế bào khối u thực nghiệm cây tô mộc và cây hà thủ ô trắng

  • Số trang: 27 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 16 |
  • Lượt tải: 0
tranphuong5053

Đã đăng 6896 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  BÙI XUÂN HÀO NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO KHỐI U THỰC NGHIỆM  CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) VÀ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG (STREPTOCAULON JUVENTAS (LOUR.) MERR.) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH2013 Công trình đƣợc thực hiện tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP. HCM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN LÊ QUAN 2. GS. TS. NGUYỄN MINH ĐỨC Phản biện 1: PGS. TS. TRẦN HÙNG Phản biện 2: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẠNH Phản biện 3: GS. TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Phản biện độc lập 1: PGS. TS. PHẠM THÀNH QUÂN Phản biện độc lập 2: PGS. TS. NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp trường tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh Vào hồi ……….giờ …….ngày ………tháng ……. năm 2013 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp.HCM DANH MỤC CÔNG TRÌNH  DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Bùi Xuân Hào, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng, Tạp chí Phát triển KHCN, Vol 12, No.10, 72-77 (2009). 2. Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học cao etyl acetat của lõi gỗ cây tô mộc (Caesalpinia sappan L.), Tạp chí Hóa học, T.47 (4A), 343-346 (2009). 3. Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học cao etyl acetat của lõi gỗ cây tô mộc (Caesalpinia sappan L.), Tạp chí Hóa học, T.48 (4B), 441-445 (2010). 4. Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.), Tạp chí Hóa học, T.49 (2ABC), 267-271 (2011). 5. Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng. Tạp chí Phát triển KHCN, Vol 14, No.T2, 28-35(2011). MỞ ĐẦU Đã từ lâu, người ta biết được rằng, ung thư là một trong những căn bệnh hiểm nghèo, và sự di căn tế bào ung thư là nguyên nhân gây ra tử vong cho bệnh nhân. Thông thường, ung thư được điều trị bởi phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sau khi điều trị, các khối u vẫn tiếp tục phát triển và di căn do các tế bào ung thư không bị tiêu diệt hoàn toàn. Các tia phóng xạ và hầu hết các thuốc dùng điều trị ung thư thường có tác dụng phụ, gây tổn hại đến các tế bào lành của cơ thể; chúng cũng thường gây ra những hậu quả nghiêm trọng như rụng tóc, ức chế sự hoạt động của tủy xương, gây nôn mửa... Vì thế, các loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư hữu hiệu vẫn đang được tìm kiếm. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u vẫn đang được sử dụng và cho kết quả điều trị tốt, chẳng hạn như các alkaloid từ cây dừa cạn, taxol từ cây thông đỏ, các alkaloid từ cây trinh nữ hoàng cung... Năm 2011, tác giả Marie Jensen và cộng sự cho biết trong những năm gần đây, các hợp chất dẫn xuất cardenolid và các hợp chất bán tổng hợp từ các dẫn xuất cardenolid được xem như là các “ứng cử viên” xuất sắc dùng để điều trị bệnh ung thư phổi. Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây thuốc ở Việt Nam, luận án này giới thiệu một số kết quả nghiên cứu về khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất cô lập được từ cây hà thủ ô trắng và cây tô mộc; là hai cây thuốc đã được các nhà khoa học Việt Nam và Nhật Bản khảo sát sơ bộ, đã cho thấy là dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc đều có độc tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung… Nội dung chính của luận án bao gồm: - Cô lập các hợp chất tinh khiết từ rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được. - Thử nghiệm độc tính tế bào trên các hợp chất tinh khiết cô lập được. 1 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Trong phần cô lập các hợp chất cardenolid tinh khiết từ cao metanol của rễ cây hà thủ ô và cao etyl acetat của lõi gỗ thân cây tô mộc, chúng tôi đã đạt được các kết quả như sau: Từ dịch chiết metanol của bột rễ thô cây hà thủ ô trắng, đã cô lập được 16 hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết, trong đó, có 3 hợp chất mới đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 03 năm 2012. Các hợp chất mới là:  14 -Hydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(16)- D-glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid].  1,14 -Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl- (14)- -D-digitalosid].  5,14 -Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl(16)- -D-glucopyranosid]. Bốn hợp chất lần đầu tiên được cô lập từ dịch chiết metanol của bột rễ cây hà thủ ô trắng là:  Digitoxigenin 3-O- -glucopyranosid.  Acovenosigenin A 3-O-β-D-glucopyranosid.  Periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D-cymaropyranosid].  Periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D-2-Oacetyldigitalopyranosid]. Đã thử nghiệm sàng lọc sơ bộ độc tính tế bào của 20 hợp chất cô lập được, theo phương pháp SRB trên ba dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư phổi NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư vú MCF–7. Kết quả thử nghiệm sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, hầu hết các hợp chất cô lập được đều có độc tính tế bào đối với ba dòng ung thư trên. Ngoài ra, với các hợp chất cô lập được có khối lượng đủ lớn, chúng tôi đã thử nghiệm độc tính tế bào của các chất này trên dòng tế bào ung thư phổi NCI–H460 để tìm giá trị IC50. Các giá trị IC50 của các hợp chất cardenolid đều nhỏ cho thấy các hợp chất này có độc tính mạnh đối với dòng tế bào ung thư phổi NCI–H460. Các thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất dẫn xuất cardenolid và homoisoflavonoid cô lập được trên ba dòng tế bào ung thư nói trên là các thử nghiệm mới, lần đầu tiên được thực hiện đối với các hợp chất này. 2 BỐ CỤC LUẬN ÁN Luận án gồm 155 trang với 4 chương, 68 tài liệu tham khảo, 1 trang danh mục công trình và phần phụ lục các phổ. Trong đó, tổng quan 24 trang, thực nghiệm 15 trang, kết quả và thảo luận 101 trang, kết luận và kiến nghị 5 trang. Ngoài ra, còn có phần mở đầu 1 trang. NỘI DUNG LUẬN ÁN Chƣơng 1. TỔNG QUAN Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Streptocaulon juventas (Lour.) Merr. và cây Caesalpinia sappan Linn của các tác giả trong và ngoài nước. Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu Đối tượng nghiên cứu là rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc. Rễ cây hà thủ ô trắng được thu hái vào tháng 10 năm 2007; lõi gỗ thân cây tô mộc được thu hái vào tháng 04 năm 2005 tại cùng địa điểm, ở ấp Phú Hòa, xã An Phú, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang. Mẫu cây được nhận danh bởi Tiến sĩ Hoàng Việt, Bộ môn Thực vật, khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị Trong thực nghiệm, chúng tôi đã sử dụng các hóa chất tinh khiết thường được các nhà hóa thực vật dùng để chiết tách hợp chất thiên nhiên. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Điều chế các loại cao Đun hoàn lưu 8 kg bột thô rễ cây hà thủ ô trắng với metanol (30 lít, 3 giờ x 3 lần), lọc nóng và cô quay ở áp suất thấp, thu được 857 gam cao metanol ở dạng sệt. Phần cao thô metanol tiếp tục được hòa tan bằng nước, sau đó chiết lỏng-lỏng với dung môi cloroform. Dịch chiết được làm khan, cô quay dưới áp suất thấp, thu hồi dung môi thu được cao cloroform và cao nước. 3 Đun hoàn lưu 2 kg bột thô lõi gỗ thân cây tô mộc với metanol (10 lít, 3 giờ x 3 lần), lọc nóng và cô quay ở áp suất thấp, thu được 324 gam cao metanol ở dạng sệt. Phần cao thô metanol tiếp tục được hòa tan bằng nước sau đó chiết lỏng-lỏng với dung môi etyl acetat. Dịch chiết được làm khan, cô quay dưới áp suất thấp, thu hồi dung môi thu được cao tương ứng. 2.2.2. Trích ly, cô lập các hợp chất cardenolid và flavonoid Việc trích ly và cô lập được thực hiện bằng sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thường hoặc pha đảo RP-18, kết hợp với sắc ký bản mỏng. Trong một số trường hợp, khi các vết của chất có Rf gần bằng nhau, các chất này được tách bằng kỹ thuật sắc ký điều chế khai triển nhiều lần. 2.2.3. Xác định cấu trúc Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng các phương pháp phổ nghiệm như 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, COSY, ROESY, LC-MS, HRESI-MS và so sánh với số liệu phổ từ tài liệu tham khảo. 2.2.4. Thử nghiệm độc tính tế bào Việc xác định độc tính tế bào của hợp chất ở nồng độ 100 g/ml với dung môi hòa tan là DMSO trên các dòng tế bào ung thư người, đã được Viện ung thư Hoa Kỳ sử dụng cho chương trình sàng lọc của mình. Về nguyên tắc, thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một hợp chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào. Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học Từ dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng, đã cô lập được mười sáu hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết. Từ dịch chiết metanol của lõi gỗ thân cây tô mộc đã cô lập được năm hợp chất phenol tinh khiết và một hỗn 4 hợp gồm hai xuyên lập thể phân. Trong phần này, chúng tôi chỉ trình bày tóm tắt những điểm mới của luận án. 3.1.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất H9 Hợp chất H9 cô lập được là chất bột vô định hình không màu, tan hoàn toàn trong metanol. Biện luận cấu trúc Phổ LC-HRMS của H9 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 735,3569 [M+Na]+, phù hợp với công thức phân tử C36H56O14Na. Phổ 1H-NMR của H9 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl tại δH 1,00 (3H, s, H-18) và 1,21 (3H, s, H-19), hai proton carbinol cộng hưởng tại δH 4,53 (1H, brps, H-3) và tại 3,87 (1H, brs, H-1); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 5,30 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21) và 5,00 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin metin cộng hưởng tại δH 6,12 (1H, brs, H-22), mũi triplet bầu của proton metin cộng hưởng tại δH 2,77 (1H, brt, J 5,0 Hz; H-17). Trên phổ của H9 cho thấy các tín hiệu đặc trưng của hai đơn vị đường là digitalose và glucose. Tín hiệu đặc trưng của proton anomer trong đơn vị đường digitalose cộng hưởng tại δH 4,75 (1H, d J 8,0 Hz, H-1), proton metyl của đường này cộng hưởng dạng mũi đôi tại δH 1,58 (3H, d, J 6,5 Hz, H-6) và proton của nhóm metoxy cộng hưởng dạng mũi đơn tại δH 3,64 (3H, s, 3-OCH3). Tín hiệu cộng hưởng của proton anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δH 5,13 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′), hai proton metylen của đường này cộng hưởng tại 4,53 (1H, m, H-6′) và 4,35 (1H, m, H-6′). Phổ 13C-NMR DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng của H9 gồm 36 carbon, trong đó có ba nhóm metyl, mười nhóm metylen, mười bảy nhóm metin, một nhóm metoxy, tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 84,6 (C-14); một vòng γ-lacton bất bão hòa, gồm có tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin tại δC 117,7 (C-22), một carbon của nhóm carbonyl lacton tại δC 174,5 (C-23). Ngoài ra, phổ của H9 còn cho thấy các tín hiệu đặc trưng của đơn vị đường digitalose với carbon anomer cộng hưởng tại δC 101,3 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng tại δC 58,9 (3-OCH3), tín hiệu của nhóm metyl cộng hưởng tại δC 17,6 (C-6). Tín hiệu của carbon anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δC 105,4 (C1), nhóm metylen của đường này cộng hưởng tại δC 63,1 (C-6). Phổ 5 HMBC của H9 cho thấy proton tại δH 1,21 (3H, s, H-19) tương quan đến tín hiệu carbon carbinol tại δC 72,1 (C-1), nên nhóm chức hydroxyl gắn tại C-1. Tương quan của proton H-2 với H-1 và H-3 trên phổ COSY cho thấy carbon metin gắn oxygen còn lại là C-3. Tương quan HMBC của proton tại δH 1,00 (3H, s, H-18) đến carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 86,3 chứng minh có sự hiện diện của nhóm OH tại C-14. Ngoài ra, phổ HMBC của H9 còn cho thấy tín hiệu proton anomer của đường digitalose tại δH 4,75 (1H, d, 8,0 Hz, H-1) tương quan đến carbon tại δC 74,4 (C-3) nên carbon anomer của đường này gắn với oxygen tại C-3. Hằng số ghép 3JHH của H-1 (J 8,0 Hz) cho thấy cấu hình β của proton anomer. Mặt khác, tín hiệu cộng hưởng tại H 4,33 (H-4) xuất hiện dạng mũi đôi với hằng số ghép nhỏ, J 2,5 nên H-4 ở vị trí xích đạo, vậy oxygen gắn với C-4 ở vị trí trục. Đơn vị đường còn lại của H9 được xác định là Dglucose dựa vào độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu proton và carbon, có so sánh với tài liệu tham khảo; trong đó tín hiệu proton tại H 5,13 (H1) xuất hiện ở dạng mũi đôi có hằng số ghép J 8,0 Hz; tín hiệu tại H 4,23 (H-3) xuất hiện ở dạng triplet có hằng số ghép J 9,0 Hz, tín hiệu tại H 4,18 (H-4) xuất hiện với dạng mũi triplet có hằng số ghép J 9,0 Hz, cho thấy các proton trong đơn vị đường thứ hai đều ở vị trí trục, phù hợp với cấu trúc của D-glucopyranose. Phổ HMBC còn cho thấy tín hiệu proton anomer của đơn vị đường glucose tại H 5,13 (H-1) tương quan đến carbon tại δC 76,0 (C-4), đồng thời tín hiệu tại H 4,33 (brd, 2,5 Hz, H-4) tương quan đến carbon tại δC 105,4 (C-1) cho thấy C-1 của đơn vị đường này gắn với oxygen tại C-4 của đơn vị đường thứ nhất. Phổ COSY cho thấy tương quan 1H-1H của chuỗi H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H6/H-7/H-8/H-9/H-11/H-12 và H-15/H-16/H-17 trong khung aglycon của hợp chất H9, cũng như tương quan của các proton kế cận nhau trong hai đơn vị đường. Độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H9 là 19,1 (đo trong pyridin-d5) nên vòng A và B có cấu trạng cis, tín hiệu cộng hưởng proton tại H-17 của H9 là 2,77 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H. Ngoài ra, phổ 1H-NMR của H9 cho thấy proton H-2 cộng hưởng dạng mũi đôi đôi với hằng số ghép J 15,0; 2,5 Hz cho thấy proton H-1 và H-3 đều phải ở vị trí xích đạo, vì vậy nhóm OH gắn tại C-1 và C-3 đều phải ở vị trí trục; mũi đơn bầu tại δH 4,53 (1H, brps, H-3) cũng chứng tỏ proton H-3 phải ở vị trí 6 xích đạo (cấu hình α); mũi đôi bầu tại δH 2,34 (1H, brd, 11,5 Hz, H-5) cho thấy H-5 ở vị trí trục. Như vậy, hóa học lập thể của hợp chất H9 được xác định như sau: Các phân tích phổ trên cho thấy H9 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 1,14 -dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- D-digitalosid], có công thức phân tử C36H56O14. Đây là hợp chất mới đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 3 năm 2012. Hợp chất được đặt tên là acovenosigenin A 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -Ddigitalosid]. Các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H9 được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của H9. Vị trí 1 2 3 4 5 6 7 8 Hợp chất H9 (C5D5N) H (ppm) C J (Hz) 3,87 (brs) 72,1 2,26 (brdd, 15,0; 2,5) 32,0 1,97 (m) 4,53 (brps) 74,4 1,78 (m) 29,1 1,94 (m) 2,34 (brd, 11,5) 30,8 1,78 (m) 26,7 1,32 (m) 1,32 (m) 21,6a 1,83 (m) 42,1 7 HMBC ( H13C) 1 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 β-D-Dig 1 2 3 4 5 6 3-O-CH3 -D-glu 1 2 3 4 5 6 a, b, c 1,62 (m) 37,6 40,6 21,7a 39,8 50,0 84,6 1,32 (m) 1,36-1,42 (m) 1,85 (m) 2,08 (m) 2,05 (m) 1,91 (m) 2,77 (brt, 5,0) 1,00 1,21 (s) 33,1 27,3 51,4 16,2 19,1 176,0 12, 17, 14 5, 1, 9, 10 73,7 20, 23 117,7 174,5 23 4,75 (d, 8,0) 4,39 (m) 3,52 (dd, 10,0; 3,0) 4,33 (d, 2,5) 3,76 (q, 7,0) 1,58 (d, 6,5) 3,64 (s) 101,3 70,9c 85,6 76,0b 70,9c 17,6 58,9 3 1, 2 6 4, 5 3 5,13 (d, 8,0) 3,95 (m) 4,23(t, 9,0) 4,18 (t, 9,0) 3,94 (m) 4,56 (brd, 11,0) 4,36 (m) 105,4 76,0b 78,4 72,1 78,6 4 1, 3 5 3, 5 3 5,02 (dd, 18,0; 1,5) 5,30 (dd, 18,0; 1,5) 6,12 (s) giá trị có thể hoán vị trong mỗi cột. 8 63,1 Hình 3.18. Tương quan HMBC và H-H COSY quan trọng của H9 3.1.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất H12 Hợp chất H12 cô lập được từ phân đoạn III-4 (sơ đồ 2.1 trong luận án), là chất bột vô định hình, không màu, tan hoàn toàn trong metanol. Biện luận cấu trúc Khối phổ của H12 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 713,3389 [M-H]¯, phù hợp với công thức phân tử C35H53O15. Phổ 1H-NMR của H12 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl tại δH 1,00 (3H, s, H-18) và 1,07 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng hưởng tại δH 4,56 (1H, brps, H-3); proton metin cộng hưởng tại δH 2,80 (1H, m, H17); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 5,03 (1H, d, J 18,0 Hz, H-21) và 5,29 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin metin cộng hưởng tại δH 6,13 (1H, brs, H-22). Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H-NMR của H12 cho thấy tín hiệu hai proton anomer của hai đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δH 4,97 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1) và 5,12 (1H, d, J 7,5 Hz, H-1); tín hiệu proton metylen của đơn vị đường thứ nhất cộng hưởng tại δH 4,33 (1H, m, H-6) và 4,84 (1H, d, J 11,0 Hz, H-6); của đơn vị đường thứ hai cộng hưởng tại 4,34 (1H, m, H-6) và 4,51 (1H, dbr, J 11,0 Hz, H-6). Các đặc điểm về dữ liệu phổ như trên cho phép dự đoán H12 là một glycosid có aglycon là periplogenin gắn với hai đơn vị đường glucose. Hằng số ghép J tại H-1 và H-1 lần lượt bằng 8,0 và 7,5 Hz cho thấy hai đơn vị đường đều có cấu hình  -glucopyranose. Phổ 13C-NMR DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng của H12 gồm 35 carbon, trong đó có hai nhóm metyl, mười hai nhóm metylen, mười lăm nhóm metin, tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 84,7 9 (C-14); một vòng γ-lacton bất bão hòa gồm có các tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin tại δC 117,6 (C-22), một carbon của nhóm carbonyl lacton tại δC 174,6 (C-23). Ngoài ra, phổ của H12 còn cho thấy tín hiệu carbon anomer của hai đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δC 101,6 (C-1) và 105,3 (C1). Phổ HMBC cho thấy proton anomer tại δH 4,97 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1) của đơn vị đường thứ nhất tương quan đến carbon tại δC 74,4 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen tại C-3. Proton anomer tại 5,12 (1H, d, J 7,5 Hz, H-1) tương quan đến carbon tại δC 70,2 (C-6) và proton metylen tại δH 4,84 (1H, d, J 11,0 Hz, H-6) tương quan đến tín hiệu δC 105,3 (C-1), cho thấy C-1 của đơn vị đường thứ hai gắn với oxygen tại C-6. Tín hiệu cộng hưởng proton và carbon của hai đơn vị đường và khung aglycon của H12 được xác định chính xác nhờ vào tương quan 1H-1H trong phổ COSY và 1H-13C trong phổ HSQC, có so sánh với tài liệu tham khảo, cho thấy hoàn toàn phù hợp với khung periplogenin và hai đơn vị đường glucose. Hình 3.24. Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H12 Tương tác của các proton gần nhau trong không gian cho phép xác định cấu trúc lập thể của H12. Phổ ROESY của H12 cho thấy tín hiệu tại δH 1,07 (3H, s, H-19) tương tác với tín hiệu tại 2,09 (1H, m, H-1); tín hiệu tại 1,54 (1H, m, H-9) tương tác với tín hiệu tại 2,02 (1H, m, H-2); tín hiệu tại 2,20 (1H, m, H-7) tương tác với tín hiệu tại 1,48 (1H, m, H-4). Các tương quan này xác nhận cấu trạng cis của vòng A và vòng B; phổ ROESY còn cho thấy tín hiệu tại 0,97 (1H, s, H-18) tương tác với tín hiệu tại 1,78 (1H, m, 10 H-8); tín hiệu tại 1,07 (1H, s, H-19) tương tác với tín hiệu tại 1,78 (1H, m, H-8). Tương quan này xác nhận cấu trạng trans của vòng B và C; đồng thời, tương tác giữa H-8 và H-18 cũng cho thấy nhóm hydroxyl tại C-14 ở vị trí xích đạo. Ngoài ra, phổ ROESY còn cho thấy tương tác của H-12 với H-17, tương quan này xác nhận hydrogen gắn tại C-17 là (17α)-H. Như vậy, cấu trúc lập thể của khung aglycon trong H12 đã được xác định. Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của H12. Hợp chất H12 (C5D5N) Vị trí 1 2 3 4 H (ppm) (*) J (Hz) 2,10 (m) 1,41 (m) 2,06 (m) 1,73 (m) 4,56 (brps) 1,90 (m) 1,55 (m) H (ppm) (**) J (Hz) 2,09 (m) 1,41 (m) 2,02 (m) 1,73 (m) 4,52 (brps) 1,87 (m) 1,48 (m) 2,06 (m) 1,87 (m) 2,22 (m) 1,33 (m) 1,82 (m) 1,58 (m) 1,96 (m) 1,82 (m) 2,20 (m) 1,22 (m) 1,78 (m) 1,54 (m) 1,24 (m) 1,39 (m) 1,39 (m) 1,36 (m) 1,20 (m) 1,31 (m) 1,33 (m) 1,48 (m) 5 6 7 8 9 10 11 12 HMBC ( H13C) 1 ROESY (**) (1H1H) 26,1 19 26,6 9 74,4 36,2 7 73,2 13 14 15 C (ppm) 34,1 24,5 4 40,9 39,2 41,2 19 2 22,0 18, 19 40,0 17 50,0 84,7 2,06 (m) 1,85 (m) 2,05 (m) 1,85 (m) 11 33,2 16 16 17 18 19 2,08 (m) 1,90 (m) 2,80 (dd, 9,5; 5,0) 1,00 (s) 1,07 (s) 2,06 (m) 1,94 (m) 2,80 (dd, 8,5; 5,0) 0,97 (s) 1,00 (s) 5,03 (d, 18,0) 5,29 (d, 18,0) 6,13 (brs) 5,03 (d, 18,0) 5,28 (d, 18,0) 6,12 (brs) 4,97 (d, 8,0) 4,92 (d, 8,0) 20 21 22 23 -D-glu 1 27,3 51,3 12, 20, 21 12 16,1 13, 14, 17 1, 5, 8, 9, 10 11 17,2 1, 8, 11, 12 176,0 73,8 20 117,6 174,6 21, 23 101,58 3 3, 5 1 5 d 2 3,94 (m) 3,91 (m) 75,0 3 4,19 (m) 4,08 (dbr, 4,5) 78,4b 4 4,23 (m) 4,11 (m) 5 4,11 (m) 4,08 (dbr, 4,5) 6 4,84 (d, 11,0) 4,33 (m) 4,79 (d, 11,0) 4,26 (d, 5,5) 70,2 1 5,12 (d, 7,5) 5,02 (d, 7,5) 105,3 2 3,97 (m) 4,00 (t, 8,5) 75,2 d 3 4,23 (m) 4,15 (m) 78,4b 4 5 4,17 (m) 4,16 (d, 9,0) 71,7a 3,92 (m) 3,86 (m) 78,6b 4,51 (m) 4,34 (m) 4,45 (d, 10,5) 4,26 (d, 5,5) 62,8 71,7a 77,4 -D-glu 6 6 5 Ghi chú: a, b, c, d giá trị có thể hoán vị trong mỗi cột. (*) Phổ 1H-NMR đo tại Phòng Phân tích Trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM. (**) Phổ 1H-NMR đo tại Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. (**) Phổ ROESY đo tại Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 12 Các phân tích về số liệu phổ như trên đã xác định được hợp chất H12 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 5,14 -dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O[ -D-glucopyranosyl-(16)- -D-glucopyranosid]. Đây là hợp chất mới, đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 3 năm 2012. Hợp chất được đặt tên là periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(16)- -Dglucopyranosid]. Các số liệu phổ1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H12 được trình bày trong bảng 3.2 Hình 3.25. Tương quan H-H ROESY quan trọng của H12 3.1.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất H6 Hợp chất H6 cô lập được là chất bột vô định hình không màu, tan hoàn toàn trong metanol. Biện luận cấu trúc Phổ LC-HRMS của H6 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 899,4238 [M-H]¯, phù hợp với công thức phân tử [C44H67O19]. Phổ 1H-NMR của H6 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl tại δH 1,01 (3H, s, H-18) và 0,90 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng hưởng tại δH 4,25 (1H, s, H-3); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 5,30 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21) và 5,02 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin metin, gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 6,14 (1H, brs, H-22), mũi triplet của proton metin cộng hưởng tại δH 2,78 (1H, brt, J 5,5 Hz, H-17). Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H-NMR cho thấy H6 là một dẫn xuất của digitoxigenin. Phổ 1H-NMR của H6 còn cho thấy tín hiệu của ba proton anomer, tương ứng với ba đơn vị đường. Tín hiệu đặc trưng của proton anomer trong đơn vị đường digitalose cộng hưởng tại δH 4,85 (1H, d J 8,0 Hz, H-1), proton 13 metyl của đường này cộng hưởng ở dạng mũi đôi tại δH 1,65 (3H, d, 6,0 Hz, H-6), proton của nhóm metoxy cộng hưởng tại δH 3,44 (3H, s, 3-OCH3). Ngoài ra, phổ 1H-NMR của H6 còn cho thấy tín hiệu cộng hưởng dạng mũi đôi tại 4,60 (H-4), có hằng số ghép nhỏ, J 2,5 Hz, cho thấy H-4 ở vị trí xích đạo nên oxygen tại C-4 ở vị trí trục. Ở hai đơn vị đường glucose còn lại, tín hiệu cộng hưởng của hai proton anomer cộng hưởng tại δH 5,10 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′) và 5,18 (1H, d, 8,0 Hz, H-1′); tín hiệu proton metylen của một đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δH 4,82 (1H, d, H-6) và 4,30 (1H, dd, J 12,0; 7,5 Hz, H-6), của đơn vị đường glucose còn lại cộng hưởng tại 4,40 (1H, dd, J 11,0; 1,0 Hz, H-6) và 4,60 (1H, dd, J 11,0; 2,5 Hz, H-6). Dựa vào các phân tích về phổ 1H-NMR của H6 như trên, có so sánh với tài liệu tham khảo, cho thấy H6 là một glycosid, có aglycon là digitoxigenin gắn với ba đơn vị đường, trong đó có một đơn vị đường là digitalose, hai đơn vị đường còn lại là glucose. Hằng số ghép J tại H-1, H1 và H-1 lần lượt bằng 8,0; 8,0 và 8,0 Hz cho thấy cho thấy proton anomer của ba đơn vị đường đều có cấu hình . Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng của H6 gồm 44 carbon, trong đó có ba nhóm metyl, một nhóm metoxy, một nhóm acetyl (CH3CO-), mười một nhóm metylen, hai mươi ba nhóm metin, một vòng γ-lacton bất bão hòa, có các tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin tại δC 117,7 (C-22), một carbon của nhóm carbonyl lacton tại δC 174,5 (C-23); tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 84,7 (C14). Ngoài ra, phổ của H6 còn cho thấy các tín hiệu đặc trưng của đơn vị đường digitalose với carbon anomer của đường này cộng hưởng tại δC 99,7 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng tại δC 58,2 (3-OCH3), tín hiệu của nhóm metyl cộng hưởng tại δC 17,8 (C-6). Tín hiệu của carbon anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δC 106,6 (C-1), nhóm metylen của đường này cộng hưởng tại δC 70,9 (C-6). Tín hiệu của carbon anomer trong đơn vị đường glucose còn lại cộng hưởng tại δC 105,7 (C-1), của nhóm metylen tại δC 62,9 (C-6). Phổ HMBC cho thấy tín hiệu proton anomer của đường digitalose tương quan đến carbon tại δC 73,5 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen tại C-3. Ngoài ra, trong đơn vị đường digitalose, còn cho thấy proton metyl của nhóm 14 acetyl tại 2,07 (3H, s, CH3CO-) tương quan đến C-2 và proton metin tại 3,96 (1H, m, H-2) tương quan đến tín hiệu tại δC 169,4 (-COO-), nên nhóm acetyl gắn vào oxygen tại C-2. Phổ HMBC còn cho thấy tín hiệu proton anomer của một đơn vị đường glucose tại δH 5,10 (1H,d, J 8,0 Hz, H-1) tương quan đến carbon tại δC 74,5 (C-4), cho thấy carbon anomer C-1 của đơn vị đường glucose thứ hai gắn với oxygen tại C-4 của đơn vị đường digitalose. Tín hiệu proton anomer của đơn vị đường glucose còn lại tại 5,18 (1H, d, 8,0 Hz, H-1′) tương quan đến carbon tại δC 70,5 (C-6), cho thấy carbon anomer C-1 của đơn vị đường glucose còn lại gắn với oxygen tại C-6 của đơn vị đường glucose thứ hai. Phổ HSQC cho thấy tương quan một nối của proton và carbon, nên cho phép xác định được độ chuyển dịch hóa học của các proton và carbon tương ứng trong hợp chất H6, có so sánh với độ dịch chuyển hóa học của proton và carbon của hợp chất (17)-H-periplogenin 3-O-βglucopyranosyl(14)-2-O-acetyl-3-O-metyl-β-fucopyranosid. Phổ COSY của hợp chất H6 cho phép xác định chính xác tín hiệu cộng hưởng các proton của đơn vị đường thứ nhất, nhờ tương quan 1H-1H COSY của chuỗi H-1/ H-2/ H-3/ H-4/ H-5/ H-6. Tín hiệu cộng hưởng tại H 4,60 (H-4) xuất hiện dạng mũi đôi đôi với hằng số ghép nhỏ, J 2,5 Hz, xác nhận H-4 ở vị trí xích đạo nên oxygen tại C-4 ở vị trí xích trục; tín hiệu tại H 3,52 (H-3) xuất hiện dạng mũi đôi đôi với hằng số ghép J 11,5; 3,0 Hz cho thấy H-3 ở vị trí trục, nên oxygen gắn tại C-3 ở vị trí xích đạo. Tín hiệu cộng hưởng tại H 4,65 (H-1) xuất hiện dạng mũi đôi với J 8,0 Hz, cho thấy H-1 và H-2 đều ở vị trí trục. Tương tự như đơn vị đường thứ nhất, giá trị H của các proton trong hai đơn vị đường còn lại được xác định dựa vào tương quan 1H-1H trong phổ COSY. Hai đơn vị đường này được xác định là glucopyranos, dựa vào các phân tích về dữ liệu phổ, có so sánh với phần đường của hợp chất (17)-Hperiplogenin 3-O-β-glucopyranosyl(14)-2-O-acetyl-3-O-metyl-βfucopyranosid. Các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H6 được trình bày trong bảng 3.3. 15 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của H6. Vị trí 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 H (ppm) (**) J (Hz) 1,48 (m) 1,61 (m) 1,96 (m) 2,10 (m) 4,25 (brps) 1,61 (m) 1,87 (m) 1,77 (m) 1,29 (m) 1,80 (m) 2,11 (m) 1,78 (m) 1,73 (m) (-) 1,41 (m) 1,87 (m) 2,14 (m) 1,86 (m) 2,78 (brt, 5,5 Hz) 1,01 (s) 0,90 (s) 5,30 (dd, 18,0; 1,5) 5,02 (dd, 18,0; 1,5) 6,14 (brs) 22 23 2-Ac--D-dig 4,65 (d, 8,0) 1 Hợp chất H6 (C5D5N) HMBC H (ppm) C 1 ( H13C) (***) (ppm) J (Hz) 1,48 (m) 30,6 9, 10 1,54 (m) 1,98 (m) 27,4 2,16 (m) 4,07 (brps) 73,5 1,62 (m) 30,1 1,90 (m) 1,65 (m) 36,9 1,08 (m) 27,1 10 1,61 (m) 2,07 (m) 21,6 14 1,71 (m) 42,0 1,67 (m) 35,9 35,6 (-) 22,1 1,22 (m) 39,9 14 50,2 84,7 2,18 (m) 33,2 1,89 (m) 2,75 (brt, 4,5 Hz) 0,84 (s) 0,72 (s) 27,3 5,15 (d, 19,0) 5,00 (d, 19,0) 19 1 19 18, 19 17 13, 14 51,5 13, 21, 22 12 16,3 24,1 176,0 12,17, 14 1, 9, 5 1, 5 73,8 13, 17, 20, 22 6,00 (brs) 117,7 174,5 21, 23 4,60 (d, 8,0) 99,7 3 16 ROESY (***) (1H1H) 3, 3, 5 2 3 4 5 6 -OCH3 CH3CO O-COO-D-glu 1 2 3 4 5 6 5,78 (dd, 10,0; 8,0) 3,52 (dd, 11,5; 3,0) 4,60 (d, 2,5) 3,68 (d, 7,0) 1,65 (d,6,0) 3,44 (s) 5,70 (m) 72,3 1, 3 3,61-3,68 (*) 83,0 2, 6 4,54 (s) 3,90-3,92 (*) 1,60 (d,6,0) 3,44 (s) 74,5 70,8 17,8 58,2 1, 2, 3 1, 4 2,02 (s) 21,2 169,4 5,10 (d, 8,0) 3,96 (m) 4,16 (m) 4,22 (m)c 4,11 (m) 4,83 (d, 10,5) 4,30 (dd, 12,0; 7,5) 4,94 (d, 8,0) 3,90-3,97 (*) 3,90-4,00 (*) 4,19-4,23 (*) 4,00-4,07(*) 104,8 75,7 78,6b 71,8a 77,8 1 4,80 (d, 8,0) 70,5 1, 4, 5 5,18 (d, 8,0) 4,04 (d, 8,5) 4,16 (m) 4,00 (m) 3,94 (m) 4,40 (dd, 11,0; 1,0) 4,52 (dd, 11,5; 2,5) (-) 3,97-4,00 (*) 4,20-4,21 (*) 3,97-4,00 (*) 3,90-3,95 (*) 105,7 75,2 78,4b 71,9a 78,6b 6, 5 1 2 2,07 (s) 1 3 -COO- 4 3 4 2 4 -D-glu 1 2 3 4 5 6 5 3 62,9 (-) Ghi chú: a, b giá trị có thể hoán vị trong mỗi cột. c mũi đôi chập một phần mũi đơn bầu của H-3. (-) Không xác định được proton. (*) Các tín hiệu chập nhau. (**) Phổ 1H-NMR đo tại Phòng Phân tích Trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM. (***) Phổ 1H-NMR và phổ ROESY đo tại Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 17
- Xem thêm -