Tài liệu Thực hành nuôi cấy mô và tế bào thực vật

150 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 151 MỤC LỤC Bài 1 Mở đầu ................................................................ 154 I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật............................................................................. 154 II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật ...................................................................... 158 Bài 2 Môi trường dinh dưỡng ....................................... 175 I. Thành phần chính của môi trường ............................... 177 II. Vấn đề lựa chọn môi trường ....................................... 188 III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc ............................... 189 Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng................................... 202 I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 203 II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ...................................... 204 III. Phương pháp tiến hành .............................................. 206 Bài 4 Nuôi cấy đơn bội in vitro...................................... 213 152 I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 213 II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 215 III. Phương pháp tiến hành .............................................. 217 Bài 5 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù.......................... 223 I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 223 II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 226 III Phương pháp tiến hành ............................................... 228 Bài 6 Nuôi cấy protoplast .............................................. 233 I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 233 II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 235 III. Phương pháp tiến hành .............................................. 237 Bài 7 Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens ..................................................................... 243 I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 243 153 II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 244 III. Phương pháp tiến hành .............................................. 247 TÀI LIỆU ĐỌC THÊM ................................................ 256 154 Bài 1 Mở đầu I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật (ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu) 1. Phòng rửa và cất nước + Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ) + Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ) - Máy sản xuất nước khử ion 2. Phòng sấy hấp + Tủ sấy 60-300oC + Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L) 155 - Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L) 3. Phòng chuẩn bị môi trường + pHmeter + Máy khuấy từ + Cân phân tích 10-4g + Cân kỹ thuật 10-2g + Bếp điện - Microwave + Tủ lạnh 100-200 L - Tủ lạnh sâu (-20  -80oC) 4. Phòng cấy vô trùng + Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench) + Quạt thông gió 156 + Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m) - Thiết bị lọc không khí 5. Phòng ảnh - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu 6. Phòng kính hiển vi + Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần). + Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số. + Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần). - Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học. - Kính hiển vi huỳnh quang 157 7. Phòng nuôi + Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux. + Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút) + Tủ ấm - Nồi phản ứng sinh học (bioreactor) 8. Phòng sinh hóa + Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...) + Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide) + Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của DNA, RNA và protein (Gene documentation system) + Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm 158 - Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh hóa của các tế bào và mô nuôi cấy. II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy môtế bào thực vật Có 3 nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng. - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách. - Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. 1. Bảo đảm điều kiện vô trùng 1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật 159 Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần. Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy), trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một vài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc, điều kiện này đặc biệt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào đơn thực vật trong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor), điều kiện vô trùng phải rất cao mới có hy vọng thành công được. 1.2. Nguồn nhiễm tạp 160 Có 3 nguồn nhiễm tạp chính: - Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối. - Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn. - Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường. 1.3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy và môi trường a. Dụng cụ thủy tinh Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là loại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy. Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông thường, chỉ cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ 161 cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy nhiều lần và cuối cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráo nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích) cần được vô trùng khô bằng cách sấy ở 60-70oC/2 giờ. Sau khi nguội được lấy ra cất vào chỗ ít bụi. b. Nút đậy Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông không thấm nước. Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhược điểm sau: + Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ bị nhiễm nấm, nhất là ở các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài. + Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên quy mô lớn. 162 + Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ. Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC (khoảng 1 atm) mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy. Trong giáo trình này, chúng tôi sử dụng giấy nhôm làm nút đậy. c. Môi trường Nói chung, môi trường được pha chế và dự trữ trong điều kiện không vô trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các dụng cụ thủy tinh đã đậy nút hoặc nắp. Thời gian hấp từ 15-20 phút ở áp suất khoảng 1 atm (121oC). Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông. 163 Các dung dịch mẹ (stock solutions) dùng để pha chế môi trường (dung dịch muối khoáng, vitamine, chất kích thích sinh trưởng...) cần được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha một lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường chỉ nên dùng các lọ có dung tích từ 100 đến 200 mL. Ở áp suất khoảng 1 atm hầu hết các vi sinh vật có trong môi trường đều bị diệt, kể cả các vi sinh vật ở dạng bào tử. Thời gian hấp thường từ 15 đến 20 phút ở 1 atm. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải dùng nước cất hoặc nước khử ion, tốt nhất là dùng nước cất 2 lần từ các máy cất hoàn toàn bằng thủy tinh. Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế phẩm mẫn cảm với nhiệt, có thể bị phân hủy khi ta hấp ở 121oC. Trường hợp này cần tiến hành lọc vô trùng riêng các chế phẩm đó và sau đó đưa vào môi trường được khử trùng. 164 d. Lọc vô trùng Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore (Hình 1.1) do hãng Millipore sản xuất hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5. Hình 1.1. Một số loại màng lọc vô trùng của hãng Millipore (disposable). Đây là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng một lần. 165 Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: Hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa chịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25 mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25 μm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời vô trùng một bình thủy tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc. 1.4. Vô trùng mô nuôi cấy Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như: hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ... Tùy theo sự tiếp xúc với điều kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề mặt. 166 Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70% sau đó mới xử lý trong dung dịch diệt khuẩn. Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy. Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh 167 hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắc chắn sẽ đạt kết quả. Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn để xử lý mô cấy thực vật Thời gian Stt Tác nhân vô trùng Nồng xử lý độ Hiệu quả (phút) 168 1 2 Calcium hypochlorite Sodium hypochlorite 9-10% 5-30 Rất tốt 2% 5-30 Rất tốt 1-2% 2-10 Rất tốt 3 Nước Bromine 4 H2O2 10-12% 5-15 Tốt 5 HgCl2 0,1-1% 2-10 Khá 6 Kháng sinh 30-60 Khá 4-50 mg/L 1.5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi 169 mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24 giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 90%. Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc.