Tài liệu Thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của Masson’s trên mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TẾ BỘ Y TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ........***……. NGUYỄN MẠNH TUẤN THùC HµNH Kü THUËT NHUéM MASSON’S TR£N M¤ BÖNH HäC BÖNH NH¢N X¥ GAN Vµ T×M HIÓU MéT Sè YÕU Tè LI£N QUAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2009- 2013 Hà Nội- 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ ........***……. NGUYỄN MẠNH TUẤN THùC HµNH Kü THUËT NHUéM MASSON’S TR£N M¤ BÖNH HäC BÖNH NH¢N X¥ GAN Vµ T×M HIÓU MéT Sè YÕU Tè LI£N QUAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2009- 2013 Hướng dẫn khoa học:ThS. Nguyễn Hữu Quốc ThS. Hoàng Trung Kiên Hà Nội- 2013 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại Họctrường Đại Học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em được học tập, rèn luyện và tu dưỡng tại trường. Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, Ths. Nguyễn Hữu Quốc - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths. Hoàng Trung Kiên, Ban Tuyên giáo Thành ủy Hà Nội, thầy đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và cán bộ trong Bộ môn Giải phẫu bệnh - trường Đại Học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất cho con. Cảm ơn những người bạn đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Nguyễn Mạnh Tuấn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học, khóa luận hay tài liệu tham khảo nào. Hà Nội, ngày……..tháng…....năm 2013 Sinh viên Nguyễn Mạnh Tuấn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3 1.1. Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan...........................3 1.1.1. Giải phẫu gan....................................................................................3 1.1.2. Mô học gan bình thường...................................................................3 1.2. Bệnh xơ gan............................................................................................4 1.3. Vài nét về mô liên kết.............................................................................5 1.4. Sợi collagen.............................................................................................6 1.4.1. Collagen type 1.................................................................................6 1.4.2. Collagen type 2.................................................................................6 1.4.3. Collagen type 3.................................................................................6 1.4.4. Collagen type 4.................................................................................6 1.4.5. Collagen type 5 và 6..........................................................................7 1.5. Phương pháp nhuộm ba màu của Masson...............................................7 1.5.1. Lịch sử phương pháp nhuộm ba màu của Masson............................7 1.5.2. Cơ chế nhuộm...................................................................................8 1.5.3. Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson..............8 1.6. Pha hóa chất..........................................................................................12 1.6.1. Dung dịch Hematoxylin Ferric.......................................................12 1.6.2. Dung dịch Fuchsin – Ponceau.........................................................12 1.6.3. Dung dịch acid Phosphomolybdic 1%............................................12 1.6.4. Dung dịch Blue aniline...................................................................12 1.6.5. Dung dịch acid acetic 1%................................................................13 1.6.6. Dung dịch cố định Bouin................................................................13 1.7. Tiến hành...............................................................................................13 1.8. Tiến hành quy trình nhuộm...................................................................15 1.8.1. Quy trình nhuộm.............................................................................15 1.8.2. Kết quả chung.................................................................................16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........17 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................17 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.........................................................17 2.3. Mẫu và phương pháp chọn mẫu............................................................17 2.3.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu......................................................................17 2.3.2. Cỡ mẫu............................................................................................17 2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................17 2.4.1. Thiết kế nghiên cứu.........................................................................17 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu......................................................................18 2.4.3. Phương tiện nghiên cứu..................................................................18 2.5. Đánh giá kết quả nghiên cứu.................................................................18 2.5.1. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng tiêu bản........................................19 2.5.2. Tiêu chuẩn đánh giá tiêu bản đạt yêu cầu.......................................19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................20 3.1. Đánh giá kết quả thực hành kỹ thuật.....................................................20 3.2. Các yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành.........................23 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN............................................................................32 4.1. Kết quả thực hành.................................................................................32 4.2. Các yếu tố liên quan..............................................................................35 KẾT LUẬN....................................................................................................38 KIẾN NGHỊ...................................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng tiêu bản....................................19 Bảng 2.2: Bảng tiêu chuẩn đánh giá tiêu bản đạt yêu cầu..........................19 Bảng 3.1: Kết quả thực hành tháng thứ nhất...............................................20 Bảng 3.2: Kết quả thực hành tháng thứ hai.................................................20 Bảng 3.3: Kết quả thực hành tháng thứ ba..................................................21 Bảng 3.4: Kết quả thực hành tháng thứ tư..................................................21 Bảng 3.5: Bảng kết quả chất lượng tiêu bản có và không cố định bằng Bouin..........................................................................................23 Bảng 3.6: Bảng kết quả nhuộm sợi collagen bằng Blue aniline và Light green 23 Bảng 3.7: Bảng kết quả khi biệt hóa bằng Acid acetic 1% và không biệt hóa bằng Acid Acetic 1%...........................................................24 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Đánh giá tổng quan chất lượng tiêu bản sau các tháng..............22 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Gan và các bộ phận lân cận trong ổ bụng.....................................3 Hình 1.2: Một phần tiểu thùy gan cổ điển.....................................................4 Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ................................................................5 Hình 1.4: C.L Pierre Masson.........................................................................7 Hình 1.5: Công thức của Hematoxylin..........................................................8 Hình 1.6: Cấu trúc acid Fuchsin....................................................................9 Hình 1.7: Cấu trúc Ponceau de xylindine......................................................9 Hình 1.8: Cấu trúc acid Phosphomolybdic.................................................10 Hình 1.9: Cấu trúc Blue aniline...................................................................10 Hình 1.10: Cấu trúc Acid acetic....................................................................11 Hình 1.11: Cấu trúc Light green...................................................................11 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Mô liên kết là loại mô phổ biến nhất có mặt ở hầu hết các bộ phận của cơ thể, xen giữa các mô và gắn bó chúng với nhau. Mô liên kết được tạo thành bởi các thành phần chính như: gian bào (còn gọi là dịch mô), các tế bào liên kết nằm ở gian bào, các sợi liên kết vùi trong chất căn bản. Trong đó đặc biệt chú ý đến là sợi collagen, đây là sợi liên kết có ở hầu hết các mô liên kết. Xã hội càng phát triển, bệnh lý về mô liên kết gặp ngày càng nhiều. Xơ gan là một minh chứng, thường gặp nhiều ở độ tuổi 40. Đây là một bệnh mạn tính kéo dài có tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao. Đến nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y và Đông y). Bệnh gây tổn thương lan tỏa ở các thùy gan với xơ hóa, đảo lộn cấu trúc bình thường của gan dẫn tới hình thành các u, cục tân tạo với các cấu trúc không bình thường [9]. Nhiễm vius B, C là nguy cơ chính gây xơ gan. Kết quả một số nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, tỷ lệ lưu hành virus viêm gan B tại cộng đồng chiếm khoảng 10- 25% dân số, trong đó tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B ở người khoẻ (8- 25%); tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C (0,4- 4,1%) [2]. Một lý do khác gây xơ gan là do rượu, gặp nhiều ở các nước Châu Âu và các nước có thói quen sử dụng rượu trong đó có Việt Nam. Ngày nay, tiến bộ trong lĩnh vực khoa học đã giúp chẩn đoán sớm và điều trị tốt cho bệnh nhân xơ gan nhưng tiên lượng của bệnh xơ gan vẫn rất dè dặt. Việc đánh giá mức độ viêm gan và xơ hóa của nhu mô gan là thực sự cần thiết, nhất là những trường hợp xơ gan nặng. Có nhiều kỹ thuật hiện đại giúp chẩn đoán xơ gan như: siêu âm, CT scanner...nhưng sinh thiết gan phục vụ chẩn đoán giải phẫu bệnh mới là tiêu chẩn vàng để đánh giá tình trạng xơ gan. Phương pháp nhuộm hai màu thông thường bằng Hematoxylin và Eosin 2 không cho phép quan sát, đánh giá phân biệt bệnh lý của mô liên kết. Năm 1951, phương pháp nhuộm ba màu của nhà giải phẫu bệnh P. Masson được mô tả như là một bước ngoặt đột phá giúp cho các nhà lâm sàng trong chẩn đoán bệnh học về mô liên kết. Phương pháp giúp phân biệt rõ được các thành phần dựa trên sự tương phản màu sắc của mô: nhân, các hồng cầu, sợi huyết, bào tương và đặc biệt là các sợi collagen. Các đề tài nghiên cứu trong nước ứng dụng kỹ thuật nhuộm ba màu để chẩn đoán, phân biệt bệnh lý về mô liên kết còn ít. Mặt khác, chưa có đề tài nào nghiên cứu một cách toàn diện và cung cấp các thông tin đầy đủ về kỹ thuật nhuộm ba màu, cũng như ưu, khuyết điểm, các yếu tố ảnh hưởng đến kĩ thuật nhuộm ba màu và cách khắc phục. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của Masson’s trên mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan”, với mục tiêu: 1. Thực hành thành thạo kỹ thuật chuyển, đúc, cắt, nhuộm. 2. Một số yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan 1.1.1. Giải phẫu gan Gan là cơ quan lớn thứ hai trong cơ thể (sau da). Gan đóng nhiều vai trò quan trọng khác nhau trong việc bảo tồn sức khỏe của chúng ta. Tùy theo kích thước và trọng lượng của mỗi cá nhân, gan có sức nặng từ 1.100 đến 1.800 gram. Gan vừa là tuyến ngoại tiết (tiết mật vào tá tràng), vừa là tuyến nội tiết (tổng hợp một số chất và những chất này được chuyển trực tiếp vào máu) [7]. Hình 1.1. Gan và các bộ phận lân cận trong ổ bụng 1.1.2. Mô học gan bình thường Gan được chia làm nhiều thùy. Các thùy gan được tạo thành bởi những khối nhỏ với cấu trúc điển hình được gọi là tiểu thùy gan. Mỗi tiểu thùy là một đơn vị cấu trúc và chức năng của gan [7]. 4 Mỗi tiểu thùy gan là một khối đa diện có đường kính khoảng 1- 2mm. Các tiểu thùy chỉ phân cách với nhau rõ rệt ở khoảng cửa (chỗ mô liên kết dày lên ở góc giữa 3- 4 tiểu thùy). Gan được tạo thành chủ yếu bởi các tế bào gan. Những tế bào đó hợp thành những dây tế bào và nối với nhau tạo thành một đơn vị hình thái được gọi là Kiernan hay còn gọi là tiểu thùy gan. Hình 1.2: Một phần tiểu thùy gan cổ điển 1.2. Bệnh xơ gan Xơ gan là bệnh mạn tính gây thương tổn nặng lan toả ở các thuỳ gan. Đặc điểm thương tổn là mô xơ phát triển mạnh, đồng thời cấu trúc các tiểu thuỳ và mạch máu của gan bị đảo lộn một cách không hồi phục được [1]. Hình thái học của xơ gan là kết quả của 3 quá trình đồng thời hoặc nối tiếp: - Tổn thương hoại tử của các tế bào nhu mô gan. - Sự tăng sinh của mô xơ. - Sự tạo thành những hòn, cục tái tạo và những tiểu thuỳ giả. 5 Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ 1.3. Vài nét về mô liên kết Trong số các loại mô cơ bản thì mô liên kết là loại mô phổ biến nhất. Mô liên kết có mặt ở hầu hết các bộ phận trong cơ thể, xen giữa các mô khác, giúp chúng gắn bó với nhau [7]. Mô liên kết có nguồn gốc từ lá thai giữa, tức là trung mô. Trong cơ thể có nhiều loại mô liên kết. Mỗi loại mô liên kết được tạo thành bởi: - Thành phần gian bào: gồm phần lỏng gọi là dịch mô, phần đặc hơn có đặc tính của một hệ keo gọi là chất căn bản. - Các sợi liên kết vùi trong chất căn bản. - Các tế bào liên kết nằm rải rác trong thành phần gian bào. Mô liên kết là loại mô giàu thành phần gian bào (được coi như môi trường bên trong cơ thể). Căn cứ vào sự khác nhau chủ yếu của chất căn bản người ta phân mô liên kết thành ba loại lớn: - Mô liên kết chính thức: có mật độ mềm và có mặt ở mọi nơi trong cơ thể. - Mô sụn: chất căn bản nhiễm cartilagen (chất sụn) có mật độ rắn vừa phải. - Mô xương: chất căn bản nhiễm ossein và muối canxi vì vậy mật độ rắn. 1.4. Sợi collagen 6 Sợi collagen là một trong ba loại sợi vùi trong chất căn bản liên kết gồm: sợi collagen, sợi võng và sợi chun. Sợi collagen có mặt ở hầu hết các mô liên kết, nhưng khác nhau đáng kể về số lượng. Về nguồn gốc, sợi collagen được hình thành từ protein. Sợi collagen bắt màu đỏ của thuốc nhuộm Eosin, bắt màu xanh của Blue aniline. Đơn vị cấu tạo hình thái của sợi collagen là xơ collagen, có đường kính trung bình khoảng 50nm quan sát rõ ở kính hiển vi điện tử. Về mặt sinh hóa, hiện nay đã xác định được trên 20 type collagen khác nhau. Sự khác nhau này là do có các chuỗi α khác nhau, khi chúng kết hợp thành bộ ba xuất hiện những hình thái phân tử collagen khác nhau. Một số type collagen quan trọng: 1.4.1. Collagen type 1 Có trong chân bì da, gân, cân, xương, sụn xơ. Chúng tương tác mức độ thấp với dermantan sulfat. 1.4.2. Collagen type 2 Có trong sụn trong và sụn chun. Chúng tương tác với chondroitin sulfat. 1.4.3. Collagen type 3 Có trong sợi võng của mô thần kinh đệm, ở mô kẽ của gan, thận, lách, phổi. Chúng tương tác với heparin sulfat. 1.4.4. Collagen type 4 Có trong lá đáy của màng đáy. Chúng tương tác với heparin sulfat. 1.4.5. Collagen type 5 và 6 7 Collagen type 5 được sản xuất một lượng nhỏ bởi nhiều loại tế bào của mô liên kết, bao gồm tế bào liên kết, tế bào nội mô và tế bào biểu mô. Collagen type 6 là cấu trúc giàu cầu nối disunfit. Collagen type 6 được tìm thấy trong khu vực ranh giới kẽ của sợi collagen type 1 và 2, có chức năng liên kết các thành phần không phải collagen [6]. 1.5. Phương pháp nhuộm ba màu của Masson 1.5.1. Lịch sử phương pháp nhuộm ba màu của Masson Nhuộm ba màu là một trong những phương pháp nhuộm để phân biệt các thành phần khác nhau của mô liên kết. Thuật ngữ nhuộm ba màu là tên thường dùng của kỹ thuật nhuộm chọn lọc cho cơ, sợi collagen, sợi huyết và hồng cầu. C.L Pierre Masson (1880-1959) là một nhà giải phẫu bệnh người Canada nổi tiếng của thế kỉ 20. Ông được biết đến như nhà nghiên cứu về u não và hệ thống thần kinh và những kỹ thuật mô học như phương pháp nhuộm ba màu đã trở thành chuẩn trong tất cả các Hình 1.4: C.L Pierre Masson phòng xét nghiệm bệnh học [13], [14]. Phương pháp nhuộm mang tên ông được mô tả lần đầu năm 1951 với nguyên tắc nhuộm: nhuộm phối hợp ba loại phẩm nhuộm, một phẩm nhuộm nhân bởi Hematoxylin (tốt nhất là Hematoxylin ferric); nhuộm bào tương và các thành phần khác bằng hỗn hợp phẩm nhuộm acid (Fuchsin acid và Ponceau S) và nhuộm sợi collagen bằng một phẩm nhuộm acid khác đặc hiệu là Blue aniline. 1.5.2. Cơ chế nhuộm 8 Các mô xốp được nhuộm màu của các phân tử cực nhỏ của thuốc nhuộm. Đầu tiên mô được nhuộm màu bởi thuốc nhuộm acid. Sau đó, khi được nhuộm với các acid Phosphomolybdic, các thành phần ít thấm giữ lại màu đỏ, trong khi đó màu đỏ bị kéo ra khỏi mô có bản chất collagen. Đồng thời, gây ra một liên kết với collagen giúp gắn màu xanh của Blue aniline. 1.5.3. Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson 1.5.3.1. Hematoxylin Hematoxylin: là một phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất bằng ete từ lõi cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ở Mexico [8]. Hình 1.5: Công thức của Hematoxylin Hematein bản thân ít ưa các tổ chức, vì vậy, phải dùng một chất gắn màu. Khi pha với các muối nhôm, sắt crom, đồng hoặc tungsten nó bắt màu vào nhân rất, nhất là các muối kim loại hóa trị III như nhôm, sắt...dưới dạng alum potassium, chlorua ferric hình thành một hợp chất tích điện dương mạnh nên cố định các acid nucleic của nhân [8]. Chúng tôi tiến hành nhuộm nhân trong dung dịch Hematoxylin ferric bởi khả năng bền màu trong acid hơn so với Hematoxylin alum [6]. 9 1.5.3.2. Acid Fuchsin Acid Fuchsin (thuốc nhuộm gốc acid): là hỗn hợp của sulfonated fuchsins. Công thức: C20H17N3Na2O9S3 Hình 1.6: Cấu trúc acid Fuchsin 1.5.3.3. Ponceau de xylindine Công thức: C18H14N2O7S2 Hình 1.7: Cấu trúc Ponceau de xylindine 10 1.5.3.4. Acid Phosphomolybdic Acid Phosphomolybdic, còn được gọi là acid molybdophosphoric dodeca hoặc PMA là một thành phần của phương pháp nhuộm ba màu của Masson. Nó là một hợp chất màu vàng- xanh, dễ tan trong nước và các dung môi hữu cơ cực như ethanol. Công thức: 12MoO3·H3PO4 Hình 1.8: Cấu trúc acid Phosphomolybdic 1.5.3.5. Blue aniline Công thức: C37H27N3Na2O9S3. - S O3 HN - S O3 O3S - N H N + H Hình 1.9: Cấu trúc Blue aniline 11 1.5.3.6. Acid acetic Công thức: C 2 H 4 O 2 Hình 1.10: Cấu trúc acid acetic Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid 8 monoprotic. Nó tạo ra gốc liên kết là acetat (CH3COO−). Dung dịch 1,0 M có pH là 2,4. 1.5.3.7. Light green Công thức: C37H34N2Na2O9S3. Hình 1.11: Cấu trúc Light green 12 1.6. Pha hóa chất 1.6.1. Dung dịch Hematoxylin Ferric Dung dich A: - Hematoxylin - Ethyl alchohol 95% Dung dịch B: - Nước cất - FeCl3 30% 1g 100ml 95ml 1ml 1ml - Acid HCl đậm đặc Khi dùng, trộn 100ml dung dịch A vào 100ml dung dịch B. Trộn trước khi dùng 10 phút, dùng được trong 2 tuần. 1.6.2. Dung dịch Fuchsin – Ponceau Cách pha: - Dung dịch Fuchsin acid 1%: 1 thể tích - Dung dịch Ponceau de xylidine 1% trong dung dich acid acetic 1%: 2 thể tích. Trộn đều 2 dung dịch trên. 1.6.3. Dung dịch acid Phosphomolybdic 1% - Nước cất - Acid Phosphomolybdic 1.6.4. Dung dịch Blue aniline 100ml 1g - Blue aniline 2,5g - Acid acetic 2,5ml - Nước cất 100ml Cách pha: Đun nóng 100ml nước cất, thêm vào đó 2,5g bột Blue aniline. Lấy ra khỏi lửa, thêm 2,5ml acid acetic. Đậy bằng nút bông, làm lạnh rồi lọc. 1.6.5. Dung dịch acid acetic 1% - Nước cất 100ml